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【期刊论文】DGGE 技术在湿地微生物多样性研究中的应用

第 49 卷第 4 期 第4期 2010 年 4 月

湖北农业科学

Vol. 49 No.4 Apr. ,2010

Hubei Agricultural Sciences

DGGE 技术在湿地微生物多样性研究中的应用
陈爱辉 1,2,李朝霞 2,梁慧星 2,丁 成2
224002 ; 224003 )
(1. 江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室, 江苏 盐城

2. 盐城工学院化学与生物工程学院,江苏 盐城

摘要:变性梯度凝胶电泳(DGGE )是微生物生态学研究的重要手段之一,具有快速和操作简便等优点。其 可以对不可培养的微生物进行监测,被广泛地应用于微生物多样性及其动态的研究 。 介绍了该技术的基 本原理、主要影响因素以及在湿地微生物多样性研究中的应用现状,并对其应用前景进行了综述。 关键词:DGGE ;微生物群落;微生物分子生态学;湿地 中图分类号:Q938.1 文献标识码:A 文章编号:0439-8114 (2010 )04-0981-04

Application of DGGE on the Diversity Study of Wetland Microbial Community
CHEN Ai-hui1,2,LI Zhao-xia2,LIANG Hui-xing2,DING Cheng2
(1. Jiangsu Provincial Laboratory of Coastal Wetland Bio-resources and Environmental Protection , Yancheng 224002 , Jiangsu ,China ;

2. School of Chemical and Biological Engineering , Yancheng Institute of Technology , Yancheng 224003 , Jiangsu ,China )

Abstract: Denaturing gradient gel electrophoresis

(DGGE ) is well-established molecular tools in microbial molecular ecology

that allows the study of diversity and dynamics of microbial communities to be fast and easy to operate. It can describe microbial communities based on partial sequences of nucleic acid and monitor uncultured bacteria. Here , the basic principles of the technology were introduced and common issues in the analyses of microbial community by DGGE were discussed. Finally , the application and prospect of DGGE for understanding the diversity of wetland microbial communities were reviewed. Key words : DGGE ; microbial community ; microbial molecular ecology ; wetland

收稿日期:2009-11-11 基金项目:盐城工学院应化研究所开放项目(XKY2009008 );江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室开放课题 (JLCBE09005 ) 作者简介:陈爱辉(1979- ),男,江苏南通人,讲师,在读博士生,研究方向为环境生态学,(电话)0515-88298192 (电子信箱)aihui_chen@126.com ; 通讯作者,丁 成,(电子信箱)ycdingc@163.com 。

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2010 年

湿 地 被 称 为 “地 球 之 肾 ”,具 有 蓄 洪 防 旱 、调 节 气候、控制土壤侵蚀、降解环境污染等功能。 但由于 全球气候变暖、酸雨、臭氧层破坏、有毒有害物质的 污染等问题,使湿地生态系统正遭受前所未有的冲 击 [1]。 微生物群落作为湿地景观的重要组成部分,是 影响湿地物质循环和污染物去除过程的关键因素, 因此 研 究 湿 地 微 生 物 组 成 和 功 能 的 多 样 性 对 于 揭 示湿 地 的 运 行 机 制 和 污 染 物 净 化 机 理 具 有 重 要 理 论意 义 和 实 践 价 值 。 传 统 的 环 境 微 生 物 学 研 究 方 法 ,主 要 是 菌 种 分 离 、培 养 和 鉴 定 等 , 即 纯 培 养 技 术。 但是,自然界中有 85%~99% 的微生物至今还不 可纯培养 ,因此采用纯培养技术很可能造成微生
[2]

可 有 效 地 提 取 土 壤 细 菌 DNA 。 考 虑 到 超 声 波 对

DNA 的剪切作用,我们并不推荐使用这种方法。 通
常,上述 3 种 DNA 提取的方法很少被单独使用,适 当地组合可以获得更好的效果。 Krsek 等 [9]认为玻璃 珠 + 溶 菌 酶 +SDS 组 合 可 以 从 土 壤 中 获 得 较 高 产 量 和纯度的 DNA 。 应用溶菌酶不但可提高 DNA 的产 量和纯度,也可减少腐植酸的影响。 Yang 等 [10]采用

SDS 和蛋白酶 K 的 组 合 从 堆 肥 中 得 到 了 高 质 量 的 DNA。 我们在对湿地土壤 DNA 进行提取时,采用溶 菌酶和 SDS 预处理 1 h ,再加入蛋白酶 K 温浴 4h 的
方法也取得了较好的提取效果。

2.2

PCR 扩增优化
在 DNA 模板质量一定的前提下, 影响 PCR 扩

物的多样性被严重低估 。 1993 年 Muyzer 等 首先
[3] [4]

将 DGGE 技术应用于微生物多样性研究,证明该技 术在 揭 示 微 生 物 遗 传 多 样 性 和 种 群 变 化 方 面 具 有 独特的优越性。 本文介绍了该技术的原理和影响因 素及其在湿地微生物多样性研究中的应用情况。

增效果的主要因素是引物的选择和扩增程序等。 在 分析微生物群落时, 被广泛使用的 16S rDNA 通用 引 物 是 341f / P534r (V 区 )、341f / P926r (V3~V5 区 ) 和 968f / P1401r (V6~V8 区)。扩增片段大小对 DGGE 分析影响也较大,200bp 的 V3 区分离效果较好,但 是分类信息缺乏; 如果对于分类水平要求较高,可 以选择 450~500bp 的 V3~V5 区或 V6~V8 区。 利用 不同的引物扩增 16S rDNA 靶序列,在 DGGE 分析 中的结果是不同的 [11],因此可以同时进行多对引物 的 DGGE 分析。 在 PCR 扩增中,随着模板浓度和循 环数的增加, 非特异性扩增产物的量也随之增加。 根据我们的研究,反应体系中模板的浓度 0.05 ng / μL、

1 DGGE 的基本原理
在 DNA 分 子 中 ,GC 碱 基 对 比 AT 碱 基 对 结 合 得要牢靠, 因此 GC 含量高的区域具有较高的解链 温度(Tm)。 在 DGGE 系统中,DNA 片段在进入变性 剂 某 一 浓 度 时 ,DNA 的 低 温 解 链 区 (Low melting

domain )解开,使 DNA 在胶中的迁移速率减慢。如果
变性剂梯度选择恰当,因碱基变化使不同的双链在 凝胶中的不同位置分叉,随后 DNA 片段迁移减慢, 从而使不同的 DNA 片段分离。 为了取得较好的分 离效果,通常在 PCR 引 物 的 5 ’端 加 上 GC 夹 板 ,即 一段长度为 30~50 个碱基富含 GC 的核甘酸序列, 形成一个人工高温解链区 (High melting domian )。 这样 PCR 扩增片段的其他部分都处在低温解链区, 这一方法使可检出的突变比例大大增加,甚至可以 使具有单碱基差异的序列分开
[5,6]

PCR 循环数 30~35 为适宜。 退火温度过低,容易引
起引物的错配,增 加 非 特 异 性 扩 增 产 物 ;适 当 地 延 长延伸时间可以减少人工突变的产生。 此外,不同 的 DNA 聚合酶对扩增效果也有影响, 使用具有校 对功能(Proof reading )和高保真(High fidelity )的聚 合酶可以减少人为突变的引入。

2.3

凝胶浓度和变性剂梯度的确定 通常根据基因片段的大小来确定聚丙烯酰胺



2 影响 DGGE 分辨率的因素及其优化
2.1
样品总 DNA 的提取及纯化 湿地土样组成复杂,富含有机物尤其是腐植酸 类物质。 由于腐植酸的干扰,导致 PCR 扩增困难,因 此在 DNA 提取前,首先要对样品进行洗涤,以减少 胞外 DNA 和可溶性有机物尤其是腐植酸类物质的 污染。 总 DNA 的提取包括粗提和纯化两个步骤。 细 胞是否充分裂解 ,以 及 核 酸 降 解 等 因 素 ,都 会 影 响

凝胶浓度,200 bp 的片段可用 8% 的凝胶,500bp 的 片段采用 6% 的凝胶。 变性剂梯度范围的选择取决 于样品的 Tm 值,可以利用垂直变性剂梯度实验来选 择所要研究的 DNA 片段的解链性质, 确定变性剂 浓度梯度。 在一定变性剂浓度梯度范围内,DNA 片 段呈现 出 一 条 清 晰 的 “S ”型 曲 线 ,曲 线 斜 率 较 大 的 部分代表解链区域的 Tm 值。通常选择水平胶的变性 剂梯度范 围 为 30% (相 当 于 Tm 范 围 10℃ 左 右 ),对 于 16S V3 rDNA 被广泛使用的变性剂梯度范围是

DNA 的提取效果 [7]。 根据细胞裂解的方法,可将DNA
提取 方 法 分 为 机 械 法 (如 玻 璃 珠 、 超 声 波 和 冻 融 等)、化学法(如 SDS 、苯酚等)和酶法(如溶菌酶、蛋 白酶 K 等)。 Frosteg覽rd 等 发现超声波和冻融结合
[8]

30%~60% ,针对不同的样品需要进行调整。 在预实
验中可以首先采用较大的变性剂梯度范围,根据电 泳结果,逐步地缩 小 变 性 剂 梯 度 范 围 ,以 达 到 最 佳 分离效果。

第4期

陈爱辉等:DGGE 技术在湿地微生物多样性研究中的应用

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2.4

电泳温度和时间的确定 通常要求电泳的温度要低于样品解链区域的

一定的相似性。 但总体来说,外来种互花米草的种 植较明显地改变了滩涂的土壤微生物群落结构;此 外,滩涂土壤微生物群落随着季节的变化而发生了 较大的改变。 赵庆节等 [25]应用 PCR-DGGE 方法对 同一个人工湿地系统中香根草、美人蕉、香蒲、芦苇 和旱伞 草 5 种 植 物 根 际 细 菌 的 多 样 性 进 行 了 研 究 分析。 PCR-DGGE 分析结果显示,同一个人工湿地 系 统 中 不 同 植 物 根 际 土 壤 具 有 类 似 的 DNA 图 谱 , 其中有 6 个相同的优势条带, 聚类分析结果表明 5 种植物根际土壤细菌群落具有很高的相似性。 他们 认为,在人工湿地 的 基 质 土 壤 中 ,决 定 微 生 物 群 落 结构组成的因素可能是系统处理的污水性质,而与 栽种的植物种类不存在必然联系。 蒋玲燕等 [26]则认 为,不同类型的潜流人工湿地在微生物种群结构上 有很大差异,体现了植物与填料对微生物群落结构 的影响。 此外,黄德锋等 [27]应用 PCR-DGGE 技术对 复合垂 直 流 湿 地 氨 氧 化 菌 种 群 结 构 及 空 间 分 布 进 行 了 研 究 ; 冯 胜 等 [28] 获 得 了 太 湖 水 体 细 菌 群 落 的

Tm 值, 对大多数 DNA 片段 50~65℃ 是比较适合的。
目前 一 些 软 件 被 广 泛 地 应 用 于 解 链 性 质 预 测 和 模 拟 [12],但 是 对 于 复 杂 样 品 ,无 法 利 用 软 件 获 得 一 个 标准的温度,因此通常是在 60℃ 左右进行优化。 电 泳时间取决于样 品 的 片 段 大 小 、凝 胶 浓 度 、变 性 剂 梯度、电泳时的 电 压 等 因 素 ,可 以 利 用 时 间 进 程 实 验
[13]

来确定最佳的电泳时间。

3 DGGE 在 湿 地 微 生 物 多 样 性 研 究 中的应用及前景
目前关于湿地科学的研究主要集中在湿地生 物资源保护与开发利用 [14,15]、人工湿地对各种污染 物的控制技术研究
[16]

。 国内外大量研究证明了湿地

对污染物的控制能力,并成功利用人工湿地技术处 理 生 活 污 水 [17]、农 业 径 流 [18] 以 及 各 种 工 业 废 水 [19], 对 COD 、N 、P、持久性有机污染物、重金属等在湿地 中的 迁 移 转 化 规 律 及 去 除 效 率 等 方 面 进 行 了 广 泛 而深入的研究
[20]

16S rDNA 指纹图谱。
到目前为止,国内外学者对湿地生态系统微生 物多样性的研究涉及仍很少,还处于起步阶段。 已 有的一 些 研 究 主 要 集 中 在 人 工 构 建 的 简 单 模 拟 湿 地系统,对结构复 杂 、受 外 界 影 响 因 素 较 大 的 天 然 湿地研究得更少。 不同植物构建的人工湿地系统对 污染物的消减能力存在很大差异 [29-31],一般认为微 生物在污染物的吸附和降解中起着核心作用 [32,33]。 因此,研究湿地生 境 微 生 物 群 落 演 变 过 程 ,有 助 于 对湿地生态作用机制的理解,为污染湿地环境的原 位或异 地 恢 复 和 污 染 物 的 湿 地 生 态 处 理 技 术 提 供 微生物学依据; 对自然湿地系统的可持续性管理, 实现生态、社会、经 济 的 协 调 发 展 有 重 要 的 现 实 意 义。 虽 然 DGGE 电 泳 技 术 在 研 究 群 落 多 样 性 和 动 态方面存在很多优势, 但是该技术也存在着不足, 其检测的 DNA 片段受长度的限制, 不能确定代谢 活性、细菌数量和基因表达的水平。 因此,DGGE 必 须与其他技术,如 Biolog 、酶学分析和原位杂交技术 等相结合才能弥补不足。
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Ibekwe 等 [21]采用 PCR-DGGE 方法研究处理奶
牛场 废 水 的 人 工 湿 地 中 总 细 菌 群 落 和 氨 氧 化 菌 组 成 的 变 化 , 发 现 总 细 菌 群 落 组 成 以 Bacillus 、

Clostridium 、 Mycoplasma 、 Eubacterium 和 Proteobacteria 为主;氨氧化菌的种类在湿地中以 Nitrosospira 为主 , 且 实 验 期 间 没 有 发 生 优 势 种 群 变 化 ;Nitrosomonas 主要存在于粪便、 原水和兼氧塘中。 Paul 等 [22]对已有甲烷利用细菌(Methanotrophic bacteria , MOB)的 16S rDNA 引物加以重新组合,提高了分析 Ⅰ 型和 Ⅱ 型 MOB 的能力,并用于淡水湿地 MOB 组 成和功能关系的分析。 Duongruitai 等 [23]对处理酸性
煤矿排水的人工湿地的微生物群落进行了研究,发 现微生物多样性程度很低,铁氧化菌和硫氧化菌并 不如预期的丰富,这个结果与采用培养方法得到的 结论一致。 我国学者周虹霞等 [24]通过对互花米草盐 沼 和 对 应 光 滩 的 土 壤 微 生 物 16S rRNA 的 特 征 检 测,分析了外来种互花米草的侵入对潮间带生态系 统土壤微生物多样性的影响。 结果显示,互花米草 盐沼与光滩的土壤微生物群落多样性皆较低,二者 在互 花 米 草 生 长 初 期 其 土 壤 微 生 物 群 落 结 构 具 有

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