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发酵车间消毒培训_图文

发酵车间消毒培训

焦江涛

一、消毒与灭菌
消毒与灭菌在发酵工业中均广泛应用。 1、消毒:。是指用物理或化学的方法杀死 物体上的病原微生物,一般只能杀死营养 细胞而不能杀死细菌芽孢。 2、灭菌:是指用物理或化学的方法杀灭或 除掉传播媒介上的所有微生物(包括芽 孢),使之达到无菌程度。在生产上习惯 叫做消毒但它与消毒是的严格意义上的区 别。
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二、灭菌方法
灭菌的方法主要有:干热灭菌法、湿热灭菌 法、化学药品灭菌法、过滤除菌法、过滤除菌法。 根据灭菌的对象和要求选用不同的方法。 1 干热灭菌法 干热灭菌法是指在干燥高温条件下,将微生物 杀死。干热对微生物有氧化、蛋白质变性和电解 质浓缩引起中毒的作用,其中氧化作用是主要的。 干热灭菌必须高温,工业生产中采用的条件是摄 氏160℃,1h。主要使用于需要保持干燥的器械、 容器的灭菌。生产实例:在接种操作和镜检涂片 时用的灼烧灭菌法就是最简单的干热灭菌法,在 投罐前的空消(125℃、30min)也属于干热灭菌,
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所以在空消之前必须先把PH、溶氧电极拔掉,否则会大大 削减其使用寿命。 2 湿热灭菌法 湿热灭菌是借助蒸汽释放的热能和水的参与,能 使微生物细胞中蛋白质、酶、核酸分子内部的化学键 (特别是氢键)受破坏,特别是蛋白质发生不可逆的 凝固性变性,使微生物死亡。蒸汽在冷凝时释放出大 量潜热,具有强大的穿透力,尤其适用于大量培养基 及发酵设备的灭菌。 温热灭菌与干热灭菌相比具有以下特点: (1)湿热灭菌时,菌体蛋白质吸收热量容易变性凝固; (2)湿热的穿透力比干热大(如表1所示) (3)蒸汽冷凝时放出大量潜热,温度上升快; 车间培训课件 焦江涛 (4)蒸汽制取简便、成本低、数量大,适于工业生产。

加热 加热类别 温度(℃) 时间 透过布层的温度(℃) 结论

(h)
20层 干热 温热 130--140 4 3 85 101 40层 72 101 100层 70以下 101 不完全灭 菌 完全灭菌

105.3

高温灭菌也会给培养基带来一些不利影响,所以在生产中就要求 我们在实消时一定要严格按工艺要求来控制实消的温度和时间。 超温超时对培养基的破坏主要有两种情况:一造成培养基成分相 互作用;二造成热稳定性差的原材料严重破坏。前者在降低培养 基质量的同时还会引起培养基褐变、沉淀,褐变反应包括类黑色 素褐变 (主要是氨基化合物与羰基化合物在加热条件下生成棕红 色的色素),焦糖化褐变(糖在没有含氨基化合物存在下,加热 到其熔点逐步形成焦糖),糖类破坏后易和有机氮源结合,产生 车间培训课件 焦江涛 氨基糖,

对微生物产生一定的毒性,严重时将抑制微生物的生 长发育破坏整个发酵所以在一、二步种子罐时,一旦 发现料液发黑会发现其菌量很少,产糖或产酸会大受 抑制甚至造成代谢停滞,严重时不得不倒罐。沉淀主 要是在加热情况下,培养基中的钙铁离子等成分易与 磷酸盐碳酸盐发生反应生成无机物沉淀和无机物如多 肽类沉淀。后者会使玉米浆和酵母膏中的微量元素、 蛋白质及糖类遭到破坏,通常解决方案 如下:①分开 灭菌。对培养基中糖类等不耐高温的成份与培养基其 它成分分开灭菌,冷却后再混合比如我们的二步糖采 取流加而不是放在一起实消;将培养基中的钙铁等离 子成分与磷酸盐分别灭菌可以避免发生沉淀反应②低 温灭菌,低温灭菌几乎对培养基中的营养成分没有破 坏。如我们一步的糖。培养基在达到完全灭菌时,灭 车间培训课件 焦江涛 菌温度和灭菌时间对维生素C培养基养分破坏的比较:

灭菌温 110 度(%) 灭菌时 400 间(min) 营养成 分破坏 99.3 率 (%)

110

115

120

130

145

150

36

15

4

0.5

0.08 0.01

67

50

27

8

2

<1

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3 化学药品灭菌法 一些化学药品易与微生物细胞中的某种成分产生化学反应,如 使蛋白质变性、酶类失活,破坏细胞膜透性而杀死微生物。根据 灭菌对象不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。如我们 车间环境消毒用的浓度为1%--0.25%的高锰酸钾溶液或0.25%的漂 白粉,发酵罐发酵至终点前加入0.25%的新洁尔灭和染菌后加入 0.15%--0.17%的甲醛熏蒸、加入5%的氢氧化钠浸泡,进入无菌室 操作前人双手用75 %的酒精消毒。 三 投罐前的几点注意事项 发酵是否成功,很大程度上决定于准备工作,以下几点须注意: 1、清洗发酵罐,特别要注意死角的洗刷和与外界接触的零部位的 清洗,清除罐底上批料的堆积物。 2、检查取样阀的密闭性有无关不严或滑丝现象,罐体、法兰、轴 封、移种阀、移糖阀、视镜等有无渗漏、穿孔、堵塞、死角等情 况,并用肥皂水或洗衣粉水严格试漏。隔膜阀更是要定期拆
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检。

3、有机械搅拌装置的发酵罐一定要擦干轴封支承内的积水,气升 式发酵罐的罐顶部和视镜处要经常保持干燥清洁。 4、检查冲视镜管是否畅通,冲视镜阀是否内漏,发现问题要彻底 处理。 5、检查罐上的仪表指针的灵敏度,是否归零显示有无偏差。 6、检查与罐上相连接的螺丝是否有脱丝现象,破旧的及时换新

四消毒过程中的注意事项 1、首先要结合配料工共同确认本批罐所用的原料为合格品,发现 有结块、变质的原料拒绝使用。
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2、在用泵向罐中打配制好的培养基时要注意保持稍开些 进气,让料翻腾,以防(前期)培养基浓度过大沉淀粘 附在罐底。 3、打完料后首先调至适宜的PH,再确认一下所有的培养 基都已加入后封住罐口,开始从进气口、放料口、取样 口等分路进入蒸汽。各路保持均衡进汽,防止短路

和堵塞,排气要畅通,排汽量不宜过大,以节约 蒸汽。
4、在实消过程中要保持压力的稳定,不宜突然卸压升压 以防造成大量泡沫冒顶或逃料。 5、在实消控制时原则上以温度为准,压力为辅。

但是在保压时可能出现压力表与温度计不对应的 情况, 在不能确定到底是温度计还是压力表失 车间培训课件 焦江涛 灵时,当压力表显示压力大于等于0.1Mpa,而温度

不到121℃时,以温度计为准;反之,则以压力表为准 , 总之要确保压力与温度都达到灭菌要求。 6、如遇蒸汽压力突然升高,罐温超过规定,可适当缩短 灭菌时间;如遇蒸汽压力突然下跌,一时上不来,

温度下降到规定范围以下,可适当延长灭菌时间, 以确保灭菌彻底。严防高温高压闷罐,否则容易 造成培养基成分破坏和PH值升高。
7、在实消结束降温时在确定空气过滤器的压力大于罐压 时,可以先打开空气进气阀,再开冷却水阀以防外界空 气倒吸进去。 8、在降温过程中严防大开排气阀使罐压几乎跌零,特别 是种子罐装料系数较大,这样做会使料液翻腾剧烈产生 大量的泡沫,易出现冒顶或逃料。
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9、在消移种管道时要确保整个管道打气畅通,严防堵塞

或排气不畅。在消好后,通入无菌空气(即给管道降温又

能使管道内保持正压)。
10、移种结束后要把发酵罐调至正常培养状态并交给看罐工,打扫 完现场卫生后方可离开。

五、染菌原因分析
发酵工业自从采用纯种培养以后,产率有了很大提高,然而防 止染菌的要求也更高了。染菌是发酵工业的致命伤,轻者影

响产率、提取收率、产品质量和三肇废治理,严重者造 成倒罐,浪费大量原材料,造成严重经济损失,而且扰 乱生产秩序,破坏生产计划。 在发酵染菌之后,必须分析染菌原因,总结发酵染菌的经 验教训,把发酵染菌消灭在发生之前,防患于未然,是 积极制服发酵染菌的最重要措施。 (一)不同染菌时间对发酵的影响 1、种子培养期染菌
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种子培养主要是生长繁殖菌体,菌体浓度低, 培养基营养丰富,比较容易染菌,带进发酵罐中 危害极大,应严格控制种子污染。当发现种子染 菌均应灭菌后倒入地沟,并对种子罐、管道进行 检查和彻底灭菌。
2、发酵前期染菌 发酵前期主要是菌体生长繁殖,代谢产物较少,这个 时期容易染菌,一旦污染杂菌会迅速繁殖,与生产菌争 夺营养成分和氧分,严重干扰生产菌的生长繁殖和产物 的生成,要特别防止发酵前期染菌。紧急处理措施:

如果污染危害较大的杂菌不能继续运转,必须重 新灭菌。重灭前可适当放出部分发酵液,并补入 适量的培养基特别是氮源使消后的培养基符合发 车间培训课件 焦江涛 酵要求,低灭后调节好PH后重新移种或倒种。

如果污染的杂菌无大的影响,可以继续运转,但要密切注 意发酵过程的代谢情况和杂菌的变化,必要时可适当降 低罐温、空气流量、和控制补料量进行发酵。 3、发酵中期染菌 发酵中期染菌将严重干扰生产菌的代谢,影响产物的生成。

有些杂菌繁殖后产生酸性或碱性物质,使PH值异 常变化加碱突增或骤减,糖、氮消耗迅速,菌体 自溶,发酵液发粘或浑浊,产生大量泡沫,代谢 产物的积累迅速减少或停止或下降,有的发酵液 发臭。发酵中期染菌,由于营养成分大量消耗, 一般挽救处理困难,危害性很大常用的方法有: 降低罐温,控制残糖量,降低空气流量或冷置待 放。对于这种罐批在核算提取成本和一定滤速 (一般不低于5ml/5min)时放罐,否则难以过滤,增大 车间培训课件 焦江涛 提取工作量甚至无法过滤而放弃。如果中期染的某些

杂菌不太严重情况,可以采取补加抑菌剂的办法 控制杂菌的生长繁殖,如二步发酵染酵母菌可加 4--5.6kg的硫酸铜抑止酵母生长,革兰氏阳性菌 对青霉素和磺胺类抗生素敏感而阴性菌则不敏感, 革兰氏阴性菌对链霉素、氯霉素和四环素等敏感 而阳性菌则不敏感。霉菌发酵中染细菌可加入适 量的青霉素来杀灭细菌。
4、发酵后期染菌 发酵后期产物积累较多,糖等营养物质接近耗尽,如果 染菌不太多,可继续进行发酵;如污染严重,破坏性

较大,可以采取提前放罐。

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(二)不同染菌规模的原因分析
1、当发酵出现连续染菌或大面积染菌,一般是公用系统有 问题,特别是空气系统。总空过滤器失效可效率下

降,新装的空过要避免因为介质移位或翻动而造 成空气走短路。 接种和中间补糖设备系统有渗漏和死角,也会 造成大面积染菌因此要按时检查维修相关设备。
2、部分发酵罐染菌,发生在前期可能是灭菌不彻底或种子 罐带菌所致,同时也与公用接种设备系统有关;染菌发

生在中后期,一般与补料、加碱有关。
3、个别罐连续染菌时要检查该罐设备的各个部件,查找 有无渗漏和死角,如降温盘管穿孔是造成染菌的多见原 因之一。个别罐批偶尔染菌,原因比较复杂,要针对具 体情况,视染菌时间和染菌类型,从操作到设备作具体 车间培训课件 焦江涛 分析。

(三)从染菌类别上分析原因 1、染革兰氏阳性杆菌、酵母菌等其它杂菌多是由空气系统 中带入而造成污染也有可能是种子带菌 2、染革兰氏阴性杆菌、特别是球菌大多数因设备渗漏所致 带菌的冷却水或污水,从冷却盘管、连接法兰、衬里焊 缝中渗漏进入发酵罐培养基中。 3、染耐热的芽孢杆菌,可能是培养基或设备灭菌不彻底但 并不是绝对的,空气带菌也常引起染芽孢杆菌; 4、染霉菌,一般是无菌室灭菌不彻底或操作问题 六、染菌的途径和防治 (一)种子带菌及其防治 种子带菌的原因: 1、培养基及用具灭菌不彻底 菌种培养基及用具灭菌均在灭菌锅中进行,造成灭菌不彻 车间培训课件 焦江涛 底主要是灭菌时锅内空气排放不完全,造成假压,使灭 菌时温度还达不到要求。

2、菌种在移种过程中受污染 菌种的移接工作是在无菌室中,按无菌操作进行的。当菌 种移接操作不当或管理不严,就可能引起污染。 3、菌种在培养过程或保藏过程中受污染

菌种在培养过程和保藏过程中,由于外界空气进入, 也使杂菌进入而受污染。为了防止污染,试管的 棉花塞应有一定的紧密度,不宜太松,且有一定 的长度,培养和保藏温度不宜变化太大。在放入 摇床后要经常去检查种母摇瓶的状况。 (二)无菌空气带菌及防止 空气净化系统失效或空气精过、预过减效是发酵染 菌的主要原因之一。具体防止措施:定期更新主 车间培训课件 焦江涛 空气系统的过滤介质,加强平时系统的排污除水

特别是在多雨或潮湿的天气。确保进入车间之前的 空气升温至35--45℃,使相对 湿度下降,定时拆 检空气精过、预过。 (三)培养基和设备灭菌不彻底带菌及防止 培养基和设备灭菌不彻底的原因,主要与以下几个 方面有关 1 1、原料形状 一般稀薄的培养基容易灭菌彻底,而含有固体颗 粒或粘稠状物料时容易由于灭菌不彻底而造成染 菌。这就要求在投料时确保搅拌混合均匀。 2、实消时未充分扣除罐内空气 实消时罐内空气未完全排除造成假压,使罐顶空间 局部温度达不到灭菌要求,导致灭菌不彻底而污 车间培训课件 焦江涛 染。因此在实消升温时,应打开排气阀门及有关

连接管的边阀、罐顶部的接管边阀,使蒸汽通过达 到彻底灭菌。 3、设备管道存在死角染菌及防止 由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原 因,引起蒸汽不能到达预定部位,这就是死角。 所以发酵罐要合理简化安装管、阀。凡不合理的 管、阀、开孔都要坚决去掉,遗留的孔眼要焊平, 消除隐患。管道之间尽可能用焊接来代替法兰, 不能用直角弯头,要保持管道畅通、光滑、密封。 主要阀门及其垫应经常检查更换。 4、设备渗漏引起染菌及防止 发酵设备、管道、阀门的长期使用,由于腐蚀、摩 车间培训课件 焦江涛 擦、振动或憋压等原因,往往会造成渗漏。例如:

设备的表面或焊缝处有砂眼,由于腐蚀逐渐加深, 最终导致穿孔;冷却管受搅拌器作用,长期磨损, 焊缝处受冷热和振动产生裂缝而渗漏。防止措施: 要选用优质材料并经常检查,小渗漏不易发现时可 压入碱性水,在可疑的地方用浸湿的酚酞指示剂的 白布擦,如有渗漏时白布显红色。 5、操作问题 在发酵过程中如操作不当也引起染菌,如移种时或 发酵培养时罐内压力跌零,使外界空气进入而染菌 泡沫冒顶而造成染菌;压缩空气压力突然下降使发 酵液倒流入空气过滤器而造成染菌等等;防止措施 加强对一线操作人员的无菌操作培训和始终贯彻无 车间培训课件 焦江涛 菌操作制度及责任心教育,加强管理措施。

(四)、环境卫生 发酵车间和菌种室的内外环境,必须保持干净整洁,定期 清扫和消毒,车间周围不得堆放废弃物,不允许有活菌 排放,有异味或易飞扬的物料的贮存,应远离发酵车间 和菌种室。 七、染菌的检查 (一)感官检查 1 1、大部分染菌的发酵液可以从发酵的异常情况来检出,如 色泽、异味、变稠或变稀、加碱速率、菌丝变形产酸不 正常或不产酸或倒酸而糖却消耗很快。 2、借助显微镜,常用梅兰染色、结晶紫染色和革兰氏染色 来判断。 (二)、无菌平皿划线检查 平板检查法既可检查出杂菌污染,又可以检查出有无噬菌 体污染。检查杂菌时,先将灭菌后的培养基倒入已经灭 车间培训课件 焦江涛

菌的培养皿内,冷却后置于37℃恒温箱内培养24 小时,进行镜检。或者将待检样品置于37℃培养 6小时,使细菌生长,增加数量,然后再划线接 种培养。这样可以提高平板法的灵敏度。 (三)肉汤培养检查法 主要用于空气系统和培养基染菌的检查。具体的做 法是将培养液装在吸所瓶中,灭菌30分钟后,置 于37℃培养24小时,如无混浊即可用于上述两 项的检查。将无菌空气或灭菌后的培养基引入后 保温培养,观察有无混浊现象发生,如呈现浑浊 说明染菌 八、染菌的后续处理 车间培训课件 焦江涛 染菌查找到原因后,对罐彻底清洗干净,加入甲醛

空消

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