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M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit

Code No.:D6130

M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit
(20 μg RNA 用)


内 容
●制品说明 ●制品内容 ●保 存


页 码
1 1 1 1 3 3 5 5 8 9 10

●试剂盒原理 ●cDNA 合成反应时的前期准备 ●操作方法 ●使用例 Ⅰ. cDNA 的克隆 Ⅱ. 向λ载体中插入 cDNA ●cDNA 合成实验例 ●注意事项

●制品说明
以原核细胞或者真核细胞的 mRNA 为模板合成 cDNA 后再进行 cDNA 的克隆, 是分子生物学研究中的一种 重要手段。利用这一技术可以进行基因的构造解析和目的蛋白质的表达研究等。 一般来说,cDNA 的合成以及 cDNA 文库的利用方法是:在合成与目的 mRNA 互补的双链 cDNA 后,将双 链 cDNA 与细菌或病毒来源的载体进行重组,再将重组体导入细菌或真核细胞内进行复制、扩增 cDNA, 然后再对 cDNA 进行解析,或者再进一步进行体外转录或体外翻译等。 使用本试剂盒无需使用载体/引物系统或利用 S1 核酸酶等除去发卡环结构,只需使用少量的 RNA,便能简 便高效地制作成高比例的含有 5’末端序列的全长 cDNA 的基因文库。

●制品内容(20 μg RNA 用)
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Reverse Transcriptase(M-MLV) (200 U/μl) RNase Inhibitor(20 U/μl) Oligo(dT)18 Primer(1 μg/μl) Random Primer(9mer) (0.3 μg/μl) 5×1st Strand Synthesis Buffer dNTP Mixture(10 mM each) 10 10 20 40 40 20 20 300 40 600
*

μl μl μl μl μl μl μl μl μl μl×2 μl

20 μl

E. coli RNase H/E. coli DNA Ligase Mixture E. coli DNA Polymerase I(20 U/μl)
5×2nd Strand Synthesis Buffer

10. T4 DNA Polymerase(1 U/μl) 11. RNase-free H2O 12. Control RNA(1 μg/μl)
*【Control

5

RNA】

本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3 质粒(质粒中的SP6 启动子下游插入长约 1.4 kbp的 pBR322 来源的DNA片段,其DNA片段上含有抗四环素基因)为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转 录而得到的。Control RNA(约 1.4 kbp)是带有 30 个A碱基的具有Poly(A)+尾的RNA。以这 种RNA为模板合成的双链cDNA插入到适当的质粒载体中,如果确实为全长的cDNA,那这种质 粒便可获得四环素抗性。

●保

存: -20℃

●试剂盒原理
TaKaRa 的 cDNA Synthesis Kit 主要是以 Gubler-Hoffman 法为基础构建的,其原理见图 1、图 2,简 要说明如下: 1. 2. 3. 4. 在逆转录酶的作用下,利用 Oligo(dT)18 Primer 或者 Random Primer 合成 cDNA 的第一条链。 使用 E. coli RNase H 使 DNA-RNA 杂合体中的 RNA 链形成单链切口(Nick) 。 在 E. coli DNA Polymerase I 与 E. coli DNA Ligase 的作用下,RNA 链被 DNA 链置换,合成 cDNA 的第二条链。 使用 T4 DNA Polymerase 使双链 cDNA 片段末端平滑。

-1-

图 1. 使用 Oligo dT Primer 时的 cDNA 合成原理

图 2. 使用 Random Primer 时的 cDNA 合成原理

-2-

●cDNA 合成反应时的前期准备
A)实验器材及实验试剂
1.实验器材 市售的一次性灭菌塑料器材通常被认为是无 RNase 的,可以直接使用。微量离心管以及吸液枪头等需要 经过高温高压灭菌后方能使用。可以干热灭菌的器材(如玻璃器具等)必须在 160℃干热灭菌 2 小时以 上;不能干热灭菌的器材(如塑料制品)须用 0.1% 的 DEPC 溶液在 37℃下处理 12 小时以上后,经高 温高压灭菌后使用。做 RNA 实验的器材必须和一般实验器材严格分开。此外,做 RNA 实验时,通过人 手混入 RNase 的机率极大,因此,进行实验操作时,一定要戴一次性橡胶手套。 2.溶液试剂 用于 cDNA 合成反应的溶液试剂尽可能用 0.1% DEPC 进行处理,并在高压灭菌后使用。有些试剂不能 高压灭菌时,首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后,再将溶液进行过滤除菌处理。 使用的溶液试剂和蒸馏水都要求 RNA 实验专用。

B)mRNA的精制和分析
1.总 RNA 的制备 除了利用 CsCl 密度梯度离心法或者硫氰酸胍苯酚氯仿法(AGPC 法)等一般方法之外,也可利用本公司 的 Catrimox-14 RNA Isolation Kit(TaKaRa Code:DWA005)来制备总 RNA。 2.Poly(A)+ RNA的分离 通常采用Oligo(dT)纤维素或Poly(U)Sepharose 的亲和层析法将Poly(A)+ RNA从总RNA中分离出 来。 3.Poly(A)+ RNA的分析 为了得到最大程度的cDNA合成活性,获得纯度高且完整的Poly(A)+ RNA是极为关键的。建议使用乙二醛 /DMSO或甲醛变性琼脂糖凝胶电泳的方法对制备的Poly(A)+ RNA进行分析,检查其完整性。

●操作方法 1st strand cDNA 合成反应
1. 在微量离心管中配制下述反应液,全量 20 μl。 Template RNA(poly(A)+RNA) 5×1st Strand Synthesis Buffer dNTP Mixture RNase Inhibitor Oligo(dT)18 或 Random Primer Reverse Transcriptase(M-MLV) (200 U/μl) RNase-free H2O 2. 轻柔搅拌混匀。 up to 2 4 1 1 2 1 20 μg μl μl μl μl μl μl

-3-

3. 4. 5.

室温放置 10 分钟后,移至 42℃恒温水浴槽内。 42℃反应 1 小时。 反应结束后置于冰中冷却 2 分钟。

注)当使用二级结构较为复杂的模板 RNA 时,在进行 cDNA 合成反应之前,将 RNA 溶液于 65℃加热 5 分 钟后迅速置于冰中,利用这种办法可以减弱二级结构的影响,提高逆转录反应效率。

2nd strand cDNA 合成反应以及末端平滑化
1. 在第一条 cDNA 链合成后的微量离心管中按下列顺序配制合成 cDNA 第二条链的反应液,全量 为 146 μl。 合成 cDNA 第一条链的反应液 5×2nd Strand Synthesis Buffer dNTP Mixture RNase-free H2O 20 30 3 89 2 2 μl μl μl μl μl μl

E. coli DNA Polymerase I E. coli RNase H/E. coli DNA Ligase Mixture
2. 3. 4. 5. 6. 16℃反应 2 小时。 70℃加热 10 分钟。 加入 4 μl 的 T4 DNA Polymerase,轻轻搅拌。 37℃反应 10 分钟。

加入 15 μl 的 0.25 M EDTA(pH8.0)以及 15 μl 的 10% SDS 溶液,停止反应。

合成的 cDNA 精制
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 反应停止后反应液总体积为 180 μl,加入等量(180 μl)的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)溶液。 剧烈振荡混匀。 在室温下 12,000 rpm 离心 5 分钟,液体分为二层。小心取出水相(上层)移至另一个新的微量 离心管中(注意切勿取出中间层) 。 向水相中加入等量(180 μl)的氯仿/异戊醇(24:1)溶液,剧烈振荡混匀。 在室温下 12,000 rpm 离心 5 分钟,液体分为二层。小心取出水相(上层)移至另一个新的微量 离心管中。 加入 150 μl 的 4 M CH3COONH4。 加入 2.5 倍量的乙醇(825 μl) ,充分混匀。 室温下放置 10 分钟。 在 4℃下 15,000 rpm 离心 15 分钟,除去上清。

10. 用 70%乙醇清洗沉淀。 11. 用适量的 TE Buffer 溶解。 12. -20℃保存。

-4-

注)① 利用这种方法可以极为有效地除去未反应的 dNTP。此外,用 Spin column 层析法或凝胶过滤 的方法也可以除去 dNTP。 ② 如果采用琼脂糖凝胶电泳胶回收法,不仅可以除去未反应的 dNTP,还可以根据分子量来选择 回收目的大小的 cDNA。 ③ 以上操作是模板 RNA 为 2 μg 时的反应系统。 实际操作时可以根据模板 RNA 的使用量来调整 1st Strand,2nd Strand 的 cDNA 合成反应液量,具体情况如下表。
模板RNA量 2 μg 3 μg 4 μg 5 μg 合成cDNA第一条链 反应液量(含酶) 20 μl 30 μl 40 μl 50 μl 合成cDNA第二条链 反应液量(含酶 )* 1 50 μl 2 25 μl 3 00 μl 3 75 μl

* 此反应液量中包含用于末端平滑的 T4 DNA Polymerase。

●使用例

Ⅰ. cDNA 的克隆
A)使用甲基化系统(Methylation System)进行cDNA克隆 如果在想要克隆的 cDNA 片段中含有 Linker 所带有的限制酶切位点时, 应先用相应的甲基化酶对酶切位 点进行甲基化保护,避免 cDNA 片段在 Linker 连接→酶切反应时被限制酶切断,以保证插入到载体中的 cDNA 的完整性。这里介绍的是使用 EcoR I 的甲基化系统进行 cDNA 的克隆例。

cDNA 链的甲基化反应
1. 在微量离心管中制备下列反应液(浓度表示值为终浓度) 。 Tris-HCl(pH8.0) EDTA DTT S-Adenosylmethionine(SAM,腺苷甲硫氨酸) 双链 cDNA Methylase EcoR I Total 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 37℃反应 1 小时。 用等量(20 μl)的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提二次。 加入 1/10 量(2 μl)的 3 M CH3COONa 溶液。 加入 2 倍量(44 μl)的无水乙醇。 -20℃放置 30 分钟。 12,000 rpm 离心 20 分钟。 用 80%乙醇清洗沉淀后真空干燥。 用适量的 TE Buffer 溶解 cDNA。 100 10 2 80 20 20 mM mM  mM μM U

0.5~1 μg

μl

10. -20℃保存。

-5-

Linker 连接以及限制酶反应
1. 在微量离心管中制备下列反应液(浓度表示值为终浓度) 。 甲基化的 cDNA pEcoR I Linker Tris-HCl(pH7.6) MgCl2 DTT ATP T4 DNA Ligase Total 0.01~0.1 pmol cDNA(摩尔数比)的 100 倍量以上 66 mM

6.6 mM 10 mM 0.1 mM 350 U 10

μl

注)连接反应也可以使用 TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2(TaKaRa Code.D6022)。 2. 3. 4. 16℃反应 2 小时~过夜。 65℃保温 10 分钟。 制备下列反应液,进行 EcoR I 酶切反应。 操作 3.的 cDNA 溶液 10×H Buffer(EcoR I 用) 10 μl 5 <5 μl μl

EcoR I(20~100U)
H2 O 5. 6. 7. 8. 9. 37℃反应 2 小时。

up to 50 μl

用等量(50 μl)的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提 2 次。 加入 1/10 量(5 μl)的 3 M CH3COONa。 加入 2 倍量(110 μl)的无水乙醇。 -20℃冷却 30 分钟。

10. 12,000 rpm 离心 20 分钟。 11. 用 80%乙醇清洗沉淀后真空干燥。 12. 用适量的 TE Buffer 溶解 cDNA 沉淀。 13. 用凝胶过滤、Spin column 层析或凝胶电泳等方法除去未反应的 Linker。 14. 回收 cDNA 片段。 15. 插入至适当的载体中。

-6-

B)使用Adaptor进行cDNA克隆 Adaptor 与 cDNA 进行连接反应后,不需要进行甲基化反应和限制酶切反应,便可以直接向载体中插入 cDNA 片段。这里介绍的是使用 EcoR I-Not I-BamH I Adaptor 进行 cDNA 的克隆例。

Adaptor 的连接反应
1. 在微量离心管中制备下列反应液(浓度表示值为终浓度) 。 双链 cDNA 0.01~0.1 pmol cDNA(摩尔数比)100 倍量以上 66 mM 6.6 mM 10 mM 0.1 mM 350 U 10

EcoR I-Not I-BamH I Adaptor
Tris-HCl(pH7.6) MgCl2 DTT ATP T4 DNA Ligase Total

μl

注 ) 连 接 反 应 也 可 以 使 用 TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2(TaKaRa Code.D6022)。 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 16℃反应 2 小时~过夜。 加入 1 μl 的 0.5 M EDTA 停止反应。 用等量(11 μl)的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提 2 次。 加入 1/10 量(1.1 μl)的 3 M CH3COONa。 加入 2 倍量(24.2 μl)的无水乙醇。 -20℃冷却 30 分钟。 12,000 rpm 离心 20 分钟。 用 80%乙醇清洗沉淀后真空干燥。

10. 用适量的 TE Buffer 溶解 cDNA 沉淀。

Adaptor 的磷酸化反应
1. 在微量离心管中制备下列反应液(浓度表示值为终浓度) 。 Tris-HCl(pH8.0) MgCl2 DTT ATP 连接 Adaptor 后的 cDNA T4 Polynucleotide Kinase Total 2. 3. 4. 5. 37℃反应 30 分钟。 加入 5 μl 的 0.5 M EDTA 停止反应。 70℃反应 5 分钟。 用等量(55 μl)的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提 2 次。 50 10 5 0.1 5~20 50 mM mM mM mM U

0.01~0.1 pmol

μl

-7-

6. 7. 8. 9.

加入 1/10 量(5.5 μl)的 3 M CH3COONa。 加入 2 倍量(121 μl)的无水乙醇。 -20℃冷却 30 分钟。 12,000 rpm 离心 20 分钟。

10. 用 80%的乙醇清洗沉淀后真空干燥。 11. 用适量的 TE Buffer 溶解 cDNA 沉淀。 12. 用凝胶过滤、Spin column 层析或琼脂糖凝胶电泳等方法除去未反应的 Adaptor。 13. 回收 cDNA 片段。 14. 插入至适当的载体中。

Ⅱ. 向λ载体中插入 cDNA
1. 在微量离心管中制备下列反应液。 带有酶切后的 Linker(或 Adaptor)的双链 cDNA λ-Vector DNA(EcoR I 片断) 3 M CH3COONa 无水乙醇 Total 2. 3. 4. 5. 6. -20℃冷却 30 分钟。 12,000 rpm 离心 20 分钟。 用 80%的乙醇清洗沉淀后真空干燥。 用适量的 TE Buffer 溶解沉淀。 向上述操作 5.溶液中加入下列试剂(浓度表示值为终浓度) 。 Tris-HCl(pH7.6) MgCl2 DTT ATP T4 DNA Ligase Total 66 6.6 10 0.1 350 10 mM mM mM mM U 0.01~0.1 pmol cDNA(摩尔数)的 2 倍量 反应液 1/10 量 反应液 2 倍量 50

μl

μl

注 ) 连 接 反 应 也 可 以 使 用 TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2(TaKaRa Code.D6022)。 7. 8. 9. 16℃反应 2 小时~过夜。 取全量或部分连接液,使用市售的试剂盒进行体外包装反应。 转染合适的宿主菌,在平板培养基上形成噬菌斑。

-8-

●cDNA 合成实验例
A)以Poly(A) Tailed RNA Marker RL10,000(TaKaRa Code: D524A) 1 μg为模板的cDNA合成 使用 Oligo(dT)18 Primer 进行 1st Strand cDNA 合成反应后,其中半量用于 2nd strand cDNA 的合 成以及末端平滑化的反应。上述反应液分别进行苯酚/氯仿处理、乙醇沉淀以及 RNase H 处理后,全量 进行 1%的琼脂糖凝胶电泳(结果见图 3) 。

图 3. Poly(A) Tailed RNA Marker RL10,000 的 cDNA 合成结果 B)以Control RNA(约 1.4 kb)2 μg为模板的cDNA合成 使用 Oligo(dT)18 Primer 进行 1st Strand cDNA 合成反应后,其中半量用于 2nd strand cDNA 的合 成以及末端平滑化的反应。上述反应液分别进行苯酚/氯仿处理、乙醇沉淀以及 RNase H 处理后,全量 进行 1%的琼脂糖凝胶电泳(结果见图 4) 。

图 4.Control RNA 的 cDNA 合成结果 注)以 1 μg的pSP Tet3 RNA Poly(A)+ RNA为模板,在标准反应条件下,通常能够获得以下的实验结果: ① 从 mRNA 反转录至 1st Strand cDNA 的效率为:>25%。 ② 从 1st Strand cDNA 合成 2nd Strand cDNA 的效率为:>80%。

-9-

●注意事项
1. Control RNA 的使用 本试剂盒中的Control RNA(pSP Tet3 Poly(A)+ RNA)可以用于对照实验。用液体闪烁计数器或碱性琼脂 糖凝胶电泳法可以确认 1st Strand cDNA或 2nd Strand cDNA的合成反应是否顺利进行。 2. mRNA 的纯度检测

为了能够获得最高的 cDNA 合成效率, 尽可能使用完整的 mRNA 是非常重要的。 在进行 cDNA 合成反应前, 可以通过测定 260 nm 和 280 nm 的吸光度 260/A280≥1.7) 或使用琼脂糖凝胶电泳法对 RNA 的纯度 (A , 进行检测。 3. RNase 的污染

实验时要注意一定不能在 mRNA 的样品中混入 RNase。 实验用的器具、 试剂等应尽可能进行高温灭菌处理。 操作时注意戴手套进行。 4. 模板 RNA 的二次结构对反转录反应的影响

有的 mRNA 由于二次结构的影响而导致反转录效率下降。在这种情况下,应在 cDNA 合成反应前把 RNA 溶液 65℃加热 5 分钟后,放入冰中急冷,然后再进行 cDNA 的合成反应。这样能够减弱二次结构的影响, 提高反转录效率。

-10V2008.04.02


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