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8.仪器分析 高效液相色谱法


第十章 高效液相色谱法
high performance liquid chromatography (HPLC)

第一节 高效液相色谱 的特点与仪器
feature and instrument of HPLC

一、HPLC的特点 feature of HPLC 二、高效液相色谱仪 instrument of HPLC 三、流程及主要部件 general process and main assembly of HPLC

2013-8-12

一、高效液相色谱法的特点
feature of HPLC
特点:高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。

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(一)固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类,可分为刚性

固体和硬胶两大类。
刚性固体以二氧化硅为基质,可承受7.0×108~109Pa的高 压,可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中,它由聚苯乙烯 与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。

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固定相按孔隙深度分类,可分为表面多孔型和全
多孔型固定相两类。

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1. 表面多孔型固定相
它的基体是实心玻璃球,在玻璃球外面覆盖一层多孔活性 材料,如硅胶、氧化铝、分子筛等。这类固定相的多孔层 厚度薄、孔浅、柱子容量低,相对死体积小,出峰快。 2. 全多孔型固定相 由直径为3-10 ?m 的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于 颗粒很细,传质速率快,柱效高。特别适合复杂混合物

分离及痕量分析。

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(二)流动相
由于高效液相色谱中流动相是液体,它对组分有亲合力, 并参与固定相对组分的竞争,因此,正确选择流动相直接

影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是:
(1)溶剂必须具有合适的极性和良好的选择性;能溶解

样品但不与样品发生反应或聚合。
(2)选用的溶剂与检测器匹配。

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(3)高纯度。由于高效液相色谱灵敏度高,对流动相溶 剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳,或产

生“伪峰”;
(4)低粘度(粘度适中);若使用高粘度溶剂,势必增 高压力,不利于分离。

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二、高效液相色谱仪器
high performance liquid chromatograph

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液相色谱仪(2)

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液相色谱仪(3)

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三、高效液相色谱的流程及主要部件
process and main assembly of HPLC

1.流程图 动画演示

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2. 主要部件
高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和 数据处理系统;此外还有一些附属设备,如梯度洗 脱、自动进样装置。

(1) 高压输液系统
(a)高压输液泵: 主要部件之一,压 力:150~350×105 Pa。
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动画演示

应具有压力平稳、
脉冲小、流量稳定

可调、耐腐蚀等特
性。

为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相,液体的 流动相高速通过色谱柱时,将产生很大的压力,因 此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。
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(b)梯度洗脱装置(梯度洗提、梯度淋洗) 所谓梯度洗脱就是流动相含有两种或两种以上不 同极性的溶剂,在分离过程中按一定程序连续改 变流动相的配比和极性,以此来改变被分离组分 的容量因子 k 和选择性因子?,达到缩短分析时 间和提高分离效果的目的。

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高压梯度洗脱: 内梯度 利用两台高压输液泵,将两种不同极性的溶剂按一定的 比例送入梯度混合室,混合后进入色谱柱。 低压梯度洗脱: 外梯度

一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极 性的溶剂按一定的比例抽入混合器中混合。

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(2) 进样系统

动画演示

通常使用耐高压的六通阀进样装置,其结构如图 所示:

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(3) 分离系统
柱体为直型不锈钢管,内径2~6 mm,柱长 10~30 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以

提高柱效。

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(4) 检测系统
在液相色谱中,有两种基本类型的检测器。 一类是溶质性检测器,它仅对被分离组分的物理 或化学特性有响应,比如紫外、荧光等检测器。 另一类是总体型检测器,它对试样和流动相总的 物理或化学性质有响应,比如示差折光,电导检 测器等。

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a. 紫外光度检测器 ultraviolet photometric detector 应用最广,对大部分有机化合物有响应。
灵敏度高,10-6 g/L; 流通池可做的很小(1mm × 10mm ,容积 8μL); 对流动相的流速和温度变化不敏感;可用于梯度洗脱。

动画演示

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b. 光电二极管阵列检测器 photodiode array detector
紫外检测器的重要发展;由1024个二极管组成,各检测特 定波长,计算机快速处理,三维立体谱图,如图所示。

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光电二极管阵列检测器获得的色谱图

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c. 荧光检测器 fluorescence detector
高灵敏度、高选择性; 对多环芳烃,维生素B、

黄曲霉素、卟啉类化合
物、农药、氨基酸类化 合物等有响应。 激光诱导荧光(LIF) Laser Induced Fluorescence 体积小,适合毛细管柱
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d. 示差折光检测器 differential refractive index detector
除紫外检测器之外应用最多的检测器;通用型检测器(每 种物质具有不同的折光指数) ; 可连续检测参比池和样品

池中流动相的折光指数差值,差值与浓度呈正比。
灵敏度低、对温度敏感、

不能用于梯度洗脱;
偏转式、反射式两种类型

动画演示
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请选择内容
第一节 高效液相色谱的特点与仪器
feature and instrument of HPLC

第二节 主要的分离类型和原理
main separating types and principle

第三节 影响分离的因素与操作条件选择
factors influenced separation and choice of operation condition

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第十章 高效液相色谱法
high performance liquid chromatography(HPLC)

第二节 主要分离类型和原理
main separation types and principle

一、液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography 二、液-液分配色谱 liquid-liquid partition chromatography 三、离子对色谱 Ion pair chromatography 四、离子交换色谱 ion exchange chromatography 五、尺寸排斥色谱 size-exclusion chromatography 六、亲和色谱 Affinity chromatography

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一、 液-固吸附色谱
liquid-solid absorption chromatography

1.分离原理
利用吸附剂作为固定相,根据吸附剂对样品中不 同组分产生不同的吸附能力以及流动相对吸附在 固定相上的样品组分具有不同的洗脱能力进行分

离的方法。

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当流动相流过固定相(吸附剂)时,吸附剂表面
的活性中心就要吸附流动相分子(Mad)。当待

测组分(Xm)被流动相带入柱内,就要取代数
目相当的已被吸附的流动相分子,于是,在固定 相表面发生交换(竞争)吸附: Xm + n Mad = Xad + n Mm

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竞争吸附达平衡时,有

K ad

[ X ad ][ Mm] ? n [ Xm][ M ad ]

n

其中Kad为吸附平衡常数,值大表示组分在吸附剂 上保留强,难于洗脱。Kad值小,则保留值弱,易

于洗脱,试样中各组分据此得以分离。
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2.固定相
极性: 由于硅胶的优点较多,如线性容量高,

机械性能好,不溶胀,与大多数试样不发生化
学反应等,因此,以硅胶用得最多。 非极性:活性炭。

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3. 流动相
一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸 附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱 剂;对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。 洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数(?0 ) 来衡量。 ?0 越大,表示洗脱剂的极性越强。

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二、 液-液分配色谱
liquid-liquid partition chromatography 固定相与流动相均为液体(互不相溶)。

1. 基本原理:
利用组分在互不相溶的两相间的分配系数K的不 同,造成各组分的差速迁移而进行分离。

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2. 固定相和流动相
涂渍固定相:早期涂渍固定液,固定液易流失, 现在较少采用;

化学键合固定相:将不同基团通过化学反应键合
到硅胶(载体)表面的游离硅羟基上。 1. 疏水基团:如烷烃C8、C18和苯基等 2. 亲水基团:如氨基、氰基等
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流动相:对于亲水性固定液,通常采用疏水性流

动相,即固定相的极性大于流动相的极性,称为
正相色谱;反之,固定相的极性小于流动相的极 性的称为反相色谱。 正相色谱适用于极性化合物的分离。其流出顺序是 极性小的先流出,极性大的后流出。 反相色谱适用于非极性化合物的分离,其流出顺序 与正相色谱恰好相反。
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3. 正相键合相色谱法
固定相采用极性的有机基团,CN、NH2、双羟基 等键合在硅胶表面; 流动相采用非极性或极性小的溶剂(如烃类)中 加入适量的极性溶剂(如氯仿、醇、乙醇等)。 它多用于分离异构体、中等极性的化合物,

此时,组分的分配比k值随其极性的增加而增大,
但随流动相极性的增加而降低。
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4.反相键合相色谱法
固定相是采用极性较小的键合固定相,如硅 胶-C18H37、硅胶-苯基等;

流动相是采用极性较强的溶剂,如甲醇、乙
睛-水、水和无机盐的缓冲溶液等。
反相键合色谱它多用于分离多环芳烃等低极性化 合物;反相键合相色谱法具有柱效高,能获得无 拖尾色谱峰的优点。
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总结:
键合相色谱的优点:通过改变流动相的组成和种 类,可有效地分离各种类型化合物(非极性、极 性和离子型)。此外,由于键合到载体上的基团 不易流失,特别适用于梯度淋洗。 最大缺点:不能用于酸度、碱度过大或存在氧化 剂的缓冲溶液作流动相的体系。
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三、 离子对色谱 法 ion pair chromatography
对强极性的有机酸和有机碱的分离?
将一种或多种与溶质离子电荷相反的离子加入到 流动相或固定相中,使其与溶质离子结合形成疏 水性的离子对化合物,从而控制溶质的保留行为

的一种色谱分离方法。

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1.固定相和流动相
固定相:正相键合固定相;反相键合固定相。
流动相:一般含有适当有机反离子的溶剂。 烷基铵盐离子对试剂,用于阴离子的分离; 烷基磺酸盐离子对试剂,用于阳离子的分离。

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2.分离原理
固定相为非极性键合相,流动相为水溶液,于流 动相中加入与待测离子X+相反电荷的离子Y-:
? 组分 ? 流动相 ? ?

X

?Y

?? ? X Y ?
K XY
? ?

疏水性

K XY ?
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[ X Y ]有机相 [ X ]水相 [Y ]水相
? ?

X

? 组分

?Y

? 流动相

?? ? X Y ?
K XY

?

?

疏水性

由于离子对X+Y-具有疏水性,因而被非极性固定 相提取。其它待测离子X1,X2,X3……..因与Y-

离子间的成对能力不同,而形成不同疏水性的离
子对,使得各待测物在柱内的保留值不同,从而

达到分离的目的。

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根据分配系数的定义:

K?

[ X Y ]有机相 [ X ]流动相
?

?

?

K ? K XY ? [Y ]水相

?

组分的保留值取决于组分离子和离子对试剂生成配合物的 平衡常数和反离子的浓度。 离子对色谱对一些生化试样,如核酸、核苷、儿茶酚胺类 物质具有良好的分离效果。尤其是可以借助离子对的生成 引入紫外吸收或荧光基团。
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四、 离子交换色谱
ion-exchange chromatography

1.固定相和流动相
固定相:阴离子交换树脂或阳离子交换树脂; 流动相:盐类缓冲溶液(一定pH和离子强度)。

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2.分离原理

动画演示

基本原理:组分在固定相上发生离子交换反应;组

分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电
荷多少等有关。亲和力大,保留时间长。

阳离子交换反应:R-SO3-Na+ + M+ = R-SO3-M+ + Na+ 阴离子交换反应:R-NR3+Cl- + X- = R-NR3+X- + Cl-

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在离子交换色谱中,常通过改变流动相的pH、 离子强度等条件来控制分配比k,改变离子交换 剂的选择性,进而影响待测物的分离。

pH值:影响酸或碱的离解平衡,控制组分离子形 式所占的分数。离子分数越高,保留值越大。常 用的有柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐和氨水等。

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离子强度I:组分保留值受流动相中盐类总浓度
控制。额外增加阳离子或阴离子将增加它们对

R-SO3-Na+ 或R-NR3+Cl- 的交换竞争力,使组分
保留值减小。通过加入不同种类的盐,可影响

柱的选择性,因为不同物质对交换剂的亲和能
力不同。

应用:它既适于无机离子,也适于有机物分离,
如蛋白质、氨基酸、核酸等。
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五、 尺寸(体积)排阻色谱
size-exclusion chromatography

动画演示

原理:按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙,由 其中通过,出峰最慢;中等分子只能通过部分凝胶空隙, 中速通过;而大分子被排斥在外,出峰最快。

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尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子物质相对分子量 的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点:
(1)保留时间是分子尺寸的函数,有可能提供分 子结构的某些信息; (2)固定相与分子间作用力极弱,趋于零。由于 柱子不能很强保留分子,因此柱寿命长; (3)不能分辨分子大小相近的化合物,相对分子 质量差别必须大于10%才能得以分离。

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1.固定相
凝胶(具有一定大小孔隙分布);指含有大量液

体(一般是水)的柔软而富于弹性的物质,它是
一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。 排阻色谱固定相种类很多,按照耐压的大小一般 可分为软质、半硬质和硬质凝胶三类。

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(1)软质凝胶
如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联

结构,其微孔能吸入大量的溶剂,并能溶胀到它们
干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相,

一般用于小分子质量物质的分析,不适宜用在高效
液相色谱中。

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(2)半硬质凝胶

如高交联度的聚苯乙烯(Styragel)比软质凝

胶稍耐压,溶胀性不如软质凝胶。
常以有机溶剂作流动相。用于HPLC时,流速

不宜过大。

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(3)硬质凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶 剂,又可用有机溶剂作流动相,可在较高压强和较

高流速下操作。
一般控制压强小于7MPa,流速<1cm3·-1;否 s 则将影响凝胶孔径,造成不良分离。

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2.流动相
排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品,而

且与凝胶本身非常相似,这样才能润湿凝胶。当采
用软性凝胶时,溶剂也必须能溶胀凝胶。另外,溶

剂的粘度要小,因为高粘度溶剂往往限制分子扩散
作用而影响分离效果。

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六、 亲和色谱法 affinity chromatography
原理:利用生物大分子和固定相表面存在的某种
特异性亲和力,进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能 的所谓间隔臂(环氧、联胺等),再连接上配基 (酶、抗原等),这种固载化的配基将只能和具

有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。
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生物大分子中具有这种亲和力,例如酶与底物、 抗原与抗体、RNA与DNA等。
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请选择内容
第一节 高效液相色谱的特点与仪器
feature and instrument of HPLC

第二节 主要的分离类型和原理
main separating types and principle

第三节 影响分离的因素与操作条件选择
factors influenced separation and choice of operation condition

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第十章 高效液相色谱法
high performance liquid chromatography(HPLC) 一、影响分离的因素
influenced factors to separation

第三节 影响分离的因素 与操作条件的选择
factors influenced separation and choice of operation condition

二、分离类型的选择
choice of separation types

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一、影响分离的因素
influenced factors of separation

1. 影响分离的因素与提高柱效的途径
在HPLC中,液体的扩散系数

仅为气体的万分之一,则速
率方程中的分子扩散项B/u较 小,可以忽略不计,即: H = A + C· 故液相色谱 u H-u曲线与气相色谱的形状不

同,如图所示。
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H = 2?dp+ C?u
液体的黏度比气体大一百倍,密度为气体的 一千倍,故降低传质阻力是提高柱效主要途径。 由速率方程可知,提高柱内填料装填的均匀性和

减小固定相粒度可提高柱效。
液相色谱中,不可能通过增加柱温来改善传 质。恒温改变淋洗液组成、极性是改善分离的最 直接的因素(梯度洗脱)。
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2. 流速
流速大于0.5 cm/s时, H~u曲线是一段斜率 不大的直线。降低流速,柱效提高不是很大。

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3. 固定相及分离柱

气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相 色谱,其选用原则与气相色谱一样。但在高效液 相色谱中,分离柱的制备是一项技术要求非常高 的工作,一般很少自行制备。

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二、分离类型选择
choice of separation types

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第一节 高效液相色谱的特点与仪器
feature and instrument of HPLC

第二节 主要的分离类型和原理
main separating types and principle

第三节 影响分离的因素与操作条件选择
factors influenced separation and choice of operation condition

结 束
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本章作业
P184 6, 10

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