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应用全基因组PCR扫描方法进行猪链球菌基因组结构的比较分析


中国科学 C 辑: 生命科学 2007 年 第 37 卷 第 6 期: 683~688 http://www.scichina.com

《中国科学》杂志社
SCIENCE IN CHINA PRESS

应用全基因组 PCR 扫描方法进行猪链球菌 基因组结构的比较分析
熊朝晖
①?

卫灿东

①?







彭俊平



徐星烨













①③*

(① 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 病毒基因工程国家重点实验室, 北京 100176; ② 中国疾病预防控制中心, 北京 100050; ③ 中国医学科学院病原生物学研究所, 北京 100730)

摘要

2005 年, 在中国四川局部地区爆发人感染猪链球菌疫情, 因其感染人数多, 病死率高引

起关注, 为了确定该致病菌是否发生变异, 通过应用全基因组 PCR 扫描方法(WGPScaning)、 多位 点序列分型技术(MLST)以及毒力相关基因的序列测定, 比较分别来自本次疫情中的病人和病猪、 以前流行期间感染的病人分离的菌株以及网上公布的来自欧洲的猪链球菌基因组序列, 结果显 示各菌株的基因组结构相似, 毒力相关基因没有差异, 所有菌株都属于 ST1 序列群, 说明本次引 起四川疫情的菌株未发生明显的基因组结构的改变.
关键词 猪链球菌 全基因组 PCR 扫描 多位点序列分型 猪的发病, 表现为急性败血症、脑膜炎、关节炎、支 气管炎、心内膜炎, 可导致急性死亡, 根据荚膜多糖 抗原的不同, 可划分为 35 个血清型, 其中猪链球菌 2 型是与疾病有关的最常见血清型,也是人兽共患病的 主要病原, 人感染猪链球菌可导致脑炎、败血症、耳 聋、肺炎、心内膜炎、关节炎, 严重的病例发生中毒 性休克综合征, 导致多脏器衰竭及死亡. 在过去的报 道中, 该病死亡率约为 7%, 传播途径主要为病猪的 血液或分泌物通过破损的皮肤等侵入人体 [2,3], 人感 染猪链球菌并引起发病的情况比较少见. 1968 年丹麦 学者首次报道了人体感染猪链球菌导致脑膜炎的病 例 [4], 此后, 在中国香港、英国、加拿大、德国、法 国和瑞典也陆续报道了人感染猪链球菌的零星病例. 目前全球大约有 200 余例人感染猪链球菌病例报告
[5~7]

2005 年 7 月 22 日, 中国卫生部向世界卫生组织 正式通报在中国四川局部地区爆发人感染猪链球菌 疫情, 第一例人感染病例于 6 月底发生在四川省资阳 县, 截止到 2005 年 8 月 16 日, 累计报告人感染猪链 球菌病例 215 例, 其中死亡 39 例, 主要症状包括高 热、不适、恶心、呕吐, 严重病例伴随有脑炎、皮下 出血、中毒性休克和昏迷. 据报道, 几乎所有病人均 为当地农民和屠夫, 其中约 80%的病人参与了屠宰、 处理或销售病猪, 超过 40%的病人年龄在 50~60 岁之 间, 对来自人和猪的样本进行检测, 排除包括流感和 尼帕病毒等病原体, 确认为猪链球菌 2 型感染, 同时 由中国农业部进行的研究发现该地区的生猪中存在 猪链球菌 2 型细菌, 没有证据显示发生了人与人之间 的 传 播 (http://www.wpro.who.int/media_centre/news/ news_20050816.htm). 猪链球菌是革兰氏阳性球菌, 兼性厌氧, 可引起
[1]

, 许多病例并不严重, 只有少数病例症状严重,

发生脑炎和中毒性休克综合征(TSS), 导致死亡, 然

收稿日期: 2007-04-16; 接受日期: 2007-08-26 国家高技术研究发展计划(863 计划)项目(批准号: 2005BA711A09)资助 ? 同等贡献 * 联系人, E-mail: zdsys@vip.sina.com

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而, 本次爆发的疫情具有感染人数多(215 人)、病死 率高(18%)以及明显的地域传播等特征. 为了能够进 一步了解这次发生的不同寻常的爆发疫情, 本研究 通过应用全基因组 PCR 扫描方法(WGPScaning)、多 位点序列分型技术(MLST)以及毒力相关基因的序列 测定, 比较分别来自本次疫情中不同症状的病人和 病猪、 以前流行期间感染的病人分离的菌株以及网上 公布的来自欧洲的猪链球菌基因组序列, 以确定该 致病菌是否发生变异.

cps2B, cps2C, cps2D, cps2E, cps2F, cps2G, cps2H, cps2I, cps2J, cps2K, 溶血素基因 sly (suilysin), 细胞 外蛋白因子基因 ef (extracellular protein factor), 溶菌 酶释放蛋白基因 mrp (muramidase-relased protein), 透 明质酸酶基因 hylA (hyaluronidase), IgG 结合蛋白基 因 IgG-BP (IgG binding protein gene), 毒力调节蛋白 基因 revS (regulator of virulence)[8~11], 利用猪链球菌 基因组 DNA 为模板, 用(LA) PCR 试剂盒 (Takara Shuzo, Kyoto)按以下步骤循环 30 次扩增目标片段: 94℃反应 30 s, 68℃反应 15 min; 所获得的产物经纯 化后用 BigDye 化学法(PE Applied Biosystems, 美国) 在 ABI3730 自动测序仪(Perkin Elemer)上进行序列测 定, 应用 DNASTAR 软件包进行序列分析, 所用引物 序列详见表 2.

1
1.1

材料与方法
菌株
本研究中所使用的菌株情况见表 1, 菌株分离自

中国 1998 年及 2005 年猪链球菌流行期间, 由中国疾 病预防控制中心传染病预防控制所提供.

1.5

多位点序列分型(MLST)
根 据 猪 链 球 菌 多 位 点 序 列 分 型 数 据 库 网站 [12]

1.2

引物设计
根据猪链球菌菌株 P1/7 基因组序列, 本项目设

(http://ssuis.mlst.net)所列 7 个看家基因的引物序列合 成引物进行 PCR 扩增基因片段, 包括 5-烯醇式丙酮 酸莽草酸-3-磷酸合成酶 aroA (EPSP sythase), 分子伴 侣基因 cpn60 (60 kD chaperonin), 抗过氧化物基因 dpr(peroxide resistance), 葡萄糖激酶基因 gki(glucose kinase), DNA 错配修复酶基因 mutS (DNA mismatch repair enzyme), 重组蛋白基因 recA (homologous recombination)和天冬氨酸激酶基因 thrA (aspartokinase); 根据数据库网站提供的反应条件进行目的片段的扩 增和序列测定, 片段大小分别为 aroA 366 bp, cpn60 318 bp, dpr 336 bp, gki 321 bp, mutS 339 bp, recA 354 bp 和 thrA 336 bp; 将所获得的基因序列数据与数据 库中已有的数据进行比较, 鉴定各菌株的序列型(ST), 应用 BURST 程序划分各菌株的序列群.

计了 406 对引物来扩增能覆盖整个基因组的 406 个片 段, 这些片段末端两两重叠, 引物平均长度为 21 个 碱基, 该基因组序列信息来自英国 Wellcome Trust Sanger 研究所猪链球菌测序工作组(ftp://ftp.sanger. ac.uk/pub/pathogens/ss), 所 用 扩 增 引 物 序 列 详 见 http://www.mgc.ac.cn/S.suis/Ss_primer.htm.

1.3

基因组 DNA 提取与 PCR 扩增分析
用 Wizard?基因组 DNA 纯化试剂盒(Promega)

提 取 细 菌 基 因 组 DNA, 然 后 用 (LA) PCR 试 剂 盒 (Takara Shuzo, Kyoto)按以下步骤循环 30 次扩增目标 片段: 94℃反应 30 s, 68℃反应 15 min, 使用 0.7%的 琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物.

1.4

毒力相关基因的序列测定
设计引物用于一些已知的毒力相关基因的聚合

1.6

核酸序列登记号
所有核苷酸序列数据已提交 GenBank, 登记号

酶 链 反 应 (PCR) 扩 增 , 包 括 荚 膜 多 糖 基 因 cps2A,
表1
菌株 SC17 SC22 SC152 98015 来源 病猪 (死亡) 病人 (中毒性休克, 死亡) 病人(脑炎, 死亡) 病人 (中毒性休克, 死亡)

为 DQ410817~DQ410884.

菌株来源及分离时间和地点
分离时间和地点 2005 年 7 月于中国四川 2005 年 7 月于中国四川 2005 年 7 月于中国四川 2005 年 7 月于中国江苏

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表2
基因 cps2A 引物 cps2A-F cps2A-R cps2B cps2B-F cps2B-R cps2C cps2C-F cps2C-R cps2D cps2D-F cps2D-R cps2E cps2E-F cps2E-R cps2F cps2F-F cps2F-R cps2G cps2G-F cps2G-R cps2H cps2H-F cps2H-R cps2I cps2I-F cps2I-R cps2J cps2J-F cps2J-R cps2K cps2K-F cps2K-R sly sly-F sly-R ef ef-F ef-R mrp mrp-F mrp-R IgG-BP IgG-BP-F IgG-BP-R revS revS-F revS-R

毒力相关基因的序列测定中所用的引物
序列(5′→3′) ATGAAAAAGAGAAGCGGACGAA GGACTGAATCGCTGCCTTTGA GCGGGGTTGGCATTTGTCTA GTCATCCAAAACCTCCATAACCA GGAGCAGATATTAAGGTTGTTGG TGTTCCAACTGCTCTTTTACTTTT AGAGGCAGTAGCAGAAGTTTATCC CCTTCGCTCTATCCTCACCAT GTATGCCGGTTGAATTTGAGTAT GATATCACTTCTTCCGCTCACTT TCAAAAGGAATACCAGCAAAGT TCATCAACAATAAAATCCCAAGAA GAGCAGAATTATATGGGGCAGAT ACTTTGAGGGAGGTGTAGACTTTC TCTAACGAAAATAATTGCTGAAAA GTGTTTGCAATACCGTTTCTCTGA ATGCAGGCAGATAGGAGAAAAAC ATAAAACAATCCCATACCCTACCA TGGAATACGCAGAGCAAGAT TAATATGCCACTGTAGCGTCTCT GTGAATGACGGTAGTACGGATAAT GCTTCTTTTGCTGTTTGCTCA GTTTGGCACTCGTAGGGGTCAC ACCTCATCCGCATACTGTGG CTTTGGTCTAGCTTCGGCAGTC GATTGCGCTTCGACTGGTTA AACAAATGCTGAAAATACGAGTGC TTTGGCAATTGAGCTTTACCTGA AGACGGCAGATGCATTCCAACTA TCAAGTCAACAACGTCTGGATTT GGGCAAATCATCAAAATCTAACA TTTCAAAAGCATGCACTAAGACA

2
2.1

结果
全基因组 PCR 扫描分析
针对所检测的 4 株细菌, 进行了 1624 个 PCR 反

引物组合不正确. 通过以上的 PCR 扩增, 最终获得了 所有的目的片段, 结果显示所有 4 株细菌 PCR 扩增均 获得与猪链球菌菌株 P1/7 预期大小相似的目的片段, 没有发现明显不同, 部分 PCR 结果见图 1.

应, 当不能获得扩增片段时, 根据以下 3 种可能的情 况使用不同组合的引物进行额外的 PCR 扩增: (ⅰ) 基因片段缺失或序列多态性引起目的片段的缺失; (ⅱ) 大的片段插入使得目的片段过大超出实验扩增 范围; (ⅲ) 基因重排, 例如易位或反转使得所设计的

2.2

毒力相关基因的序列测定
PCR 扩增获得全部所检测的 4 株细菌的待测毒

力相关基因的基因片段, 并获得其基因序列, 结果显 示 4 株细菌所测定的毒力相关基因序列完全相同.

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图1

4 株猪链球菌的全基因组 PCR 扫描结果

(a) 菌株 SC17; (b) 菌株 SC22; (c) 菌株 SC152; (d) 菌株 98015. M1: λDNA Hind Ⅲ Marker; M2: DL15000 Marker (Takara Shuzo, Kyoto)

2.3

多位点序列分型
等位基因序列测定结果显示所检测的 4 株细菌

所报道的 7%, 并且许多病例发生不多见的中毒性休 克综合征, 有可能该菌发生某些变异成为更具致病 力的毒株, 因此通过将本次疫情中分离的菌株与以 往在中国和其他国家分离的流行株进行比较, 将有 助于发现可能的变异. 本研究应用全基因组 PCR 扫描分析技术来分析 这些不同来源的菌株间基因组水平的差异, 这一技 术是近年来发展的用于关系密切的基因组在结构上 的比较 [15], 目前已有一些细菌基因组水平的分析方 法应用于猪链球菌的研究, 例如多位点酶电泳、核糖 体基因分型和随机扩增多态性 DNA 等[16~18], 通过这 些分析方法已经发现了猪链球菌不同菌株间的一些 差异, 也揭示了遗传特征与临床相关的菌株之间的 一些联系, 但是这些分析方法常常只局限于研究部

的序列结果完全一致, 其序列型经分析均为 ST7, 而 本实验中所用对照菌株 P1/7 为 ST1, 但是序列型 ST7 与 ST1 非常接近, 它们之间只有一个等位基因有差 异, 并且只有一个核苷酸的差异, 并且它们都属于 ST1 序列群, 是猪链球菌感染中最常见和高致病性的 一类序列群.

3

讨论
本次四川省由猪链球菌 2 型引起的疫情是到目

前为止曾经报道过的最严重的一次, 甚至超过了 1998 年在中国江苏省爆发的疫情(25 个病例, 死亡 14 人, 80000 头猪生病或死亡)
[1,6,13,14]

, 病死率超过过去

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分的细菌基因组, 目前越来越多的关注集中在种内 基因组比较方面, 因为它能有效提供更为详细的表 型-基因型之间关系的信息, 在所有的全基因组比较 分析方法中, 全基因组序列测定能提供最精确的信 息, 但是测定每一株需要比较的菌株在经济上是不 切实际的. 脉冲场凝胶电泳(PFGE)和 DNA 微阵列技 术也是进行全基因组比较分析的重要工具
[19,20]

(ⅲ) 虽然已经完成了一些猪链球菌的全基因组序列 测定, 但是基因组的 20%~30%的基因功能未知, 尤 其是对于其重要的毒力因子的相关信息所知不多, 可能存在其他未知的重要毒力因子; (ⅳ) 包括贫困、 不卫生的屠宰操作和不正确的病猪尸体处理方式等 相关的客观条件状况. 本研究比较了来自不同宿主、不同临床表现、不 同流行时间和不同国家的猪链球菌菌株, 结果显示 这些菌株有高度的相似性, 在基因组结构和毒力基 因方面未发现差异, 对于本次不同寻常的流行的可 能原因的探讨需要进一步的流行病学研究. 致谢 感谢中国疾病预防控制中心传染病预防控 制所叶长芸博士和杜华茂博士提供菌株.

, 但

是它们不能提供相关基因的定位信息或对照菌株中 缺失的基因的相关信息, 而全基因组 PCR 扫描分析 技术可以满足这一需求, 其可分辨 500~1000 bp 大小 的片段差异, 一旦获得差异片段, 就可通过序列测定 来鉴定基因组结构变异情况, 并且它也能检测遗传 元件的位置变化. 为了比较分别来自本次疫情中不同症状的病人 和病猪、 以前流行期间感染的病人分离的菌株以及网 上公布的来自欧洲的猪链球菌基因组序列, 我们以 欧洲的猪链球菌菌株 P1/7 基因组序列为对照, 对来 自 4 种来源的猪链球菌菌株进行比较, 来源分别是本 次流行中病猪、 中毒性休克病人、 脑炎病人以及 1998 年中国江苏的流行株, 全基因组 PCR 扫描分析结果 显示所有 4 株细菌 PCR 扩增均获得与猪链球菌菌株 P1/7 预期大小相似的目的片段, 没有发现有明显不 同, 提示这 4 株细菌中没有大的插入或缺失发生, 也 没有明显的基因组结构的改变. 目前已有许多针对猪链球菌 2 型相关的毒力因 子的研究
[21]


1 2 3







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5

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, 尽管对于猪链球菌的毒力因子的相关

6

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信息所知有限, 但一般认为猪链球菌中重要的毒力 因子有荚膜多糖(CPS)、溶血素基因(suilysin) 、 细胞 外蛋白因子(EF)、溶菌酶释放蛋白基因(MRP)、透明 质酸酶(hyaluronidase)、IgG 结合蛋白、毒力调节蛋白 (revS)等, 为了确定这些毒力因子是否发生变化, 我 们进行了序列测定, 结果是 4 株细菌的毒力相关基因 序列完全相同, 说明这些毒力因子并未发生任何导 致此次爆发流行的变异; 多位点序列分型结果显示 所检测的 4 株细菌和本实验中所用对照菌株 P1/7 都 属于 ST1 序列群, 这一序列群是猪链球菌感染中最常 见和高致病性的一类序列型别, 没有观察到明显的 变异, 也未发现新的序列型. 根据这些结果, 我们认为造成本次不同寻常的 流行的可能原因为: (ⅰ) 一些未发现的点突变可能 在发病机理方面有重要作用; (ⅱ) 宿主的个体差异;
12 11 10 9 8 7

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