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RNA干扰及其应用


RNAi 是 Napoli C D 等[1]在试图向紫色矮牵牛花转导色素合成基因,用以增加其花色时发现 的。 结果出乎预料,转基因的植株不仅没有新基因的表达,反而自身的色素合成也减弱了,一些 转基因的花出现了全白色或部分白色。 他们把这种导入的基因未表达和植物本身合成色素基 因的失活现象命名为共抑制(cosuppression)。之后,Ramano 等在向粗糙孢菌?(Neurospora crassa)?中导入合成胡萝卜素的基因时造成失活,他们称为基因静止(quelling)。 Guo S 等[2] 发现正义 RNA 与反义 RNA 有相同水平的抑制效应, 但未能就此现象给出合理的解释。 Fire A 等[3]在研究反义核苷酸时发现在线虫体内,双链 RNA( double stranded RNA,dsRNA)能有效 地抑制有互补序列的内源性基因,且抑制效果优于单链反义 RNA。 至此, 正式提出了双链 RNA 诱导的 RNAi 的概念,开启了 RNAi 研究的序幕。 1 RNAi 可能的作用机制及特点 1.1 RNAi 的作用机制 虽然 RNAi 作用的确切机制尚不清楚,但目前普遍认可是 Bass 假说。具体概括为三个阶段。 (1)起始阶段。在细胞内,双链 RNA(dsRNA)由核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ) Dicer 在 ATP 的参与下 被处理为 21 个~23 个碱基的小 RNA, 即小干扰 RNA (small interfering RNA, siRNA) 。 siRNA 是由 19 个~21 个碱基配对形成的双链,并在其 3′末端有两个游离未配对的核苷酸。研究发 现, siRNA 是 RNAi 作用发生的重要中间分子, 序列与所作用的靶 mRNA 的序列具有高度同 源性;双链的两端各有 2 个~3 个突出的非配对的 3′碱基;两条单链末端为 5′端磷酸和 3′ 端羟基。这些是细胞赖以区分真正的 siRNA 和其他双链 RNA 的结构基础。 研究表明,平末 端的 siRNA 或失去了 5′磷酸基团的 siRNA 不具有 RNAi 的功能[4] (2)引发阶段。siRNA 与 Argonaute 蛋白家族及其他未知因素结合,形成 siRNA-核蛋白复 合物(siRNA-ribonucleoprotein complex,siRNP) 。siRNP 在 ATP 及其他未知因素参与下, 使双链 siRNA 解旋形成 RNA 诱导的沉默复合物(RNA inducing silencing Complex ,RISC)。 RISC 可能以完全单链或两条链解旋但不完全分离的形式存在,继而 RISC 在 dsRNA 的介导 作用下与互补 mRNA 结合,并将其降解。mRNA 被降解在转录后水平,抑制基因表达,因而又 称之为转录后基因沉默( posttranscriptional gene silencing,PTGS) (3)循环放大阶段。在 siRNA 诱导的 RNAi 过程中,可能还存在 siRNA 的循环放大过程,以 维持它的 RNA 诱导功能。 此过程推测是以 siRNA 为引物,互补 mRNA 为模板,在 RNA 依赖性 RNA 合成酶(RNA-dependent RNA Polymerase,RdRP) 的作用下,合成新的双链 RNA,再由 Dicer 作用,产生新的 siRNA,完成 siRNA 的放大过程,开始新的 RNAi 循环[5]。 关于对 RNAi 机制中重要酶的作用研究,Zamore P D 等[6]发现,21 nt RNA 指导 mRNA 的 降解; Scharf W D 等[7]发现 ATP 依赖的 RNA 解旋酶为 Mut6;Grishok A 等[8]发现 Let-7 和 lin-4 为内源性的 RNAi 基因(stRNA) ;Dalmay T 等[9]提出 RNA 依赖的 RNA 多聚酶就是 SDE-1; Bernstein E 等[10]证实 RNaseш 样的核酸酶为 Dicer; Elbashir S M 等[11]应用外 源性 21 nt-siRNA 能够抑制同源 mRNA 的表达;Novina C D 等[12]证实无论是针对病毒感染 细胞所需的 CD4 受体,还是针对病毒基因组的 gag 区域,siRNA 都可以有效地使病毒与细 胞的基因沉默,抑制 HIV 的感染与复制。 1.2 RNAi 的作用特点 (1)“共抑制”性。RNAi 是双链 RNA 介导的转录后基因沉默机制,它的启动子相当活跃,外源基 因可以转录,但不能正常积累 mRNA; RNAi 作用不仅使外源基因在转录后水平上失活,同时诱 导与其同源的内源基因沉默。 (2)高效性。 试验证明双链 RNA 干扰 mRNA 翻译的效率比单纯反义或正义 RNA 的抑制效率 提高了几个数量级;RNAi 可在低于反义核酸几个数量级的浓度下,使靶基因表达降到很低水 平甚至完全“剔除”,而产生缺失突变体表型。 它比基因敲除技术更为便捷,科学家称 RNAi 技术 为靶基因或靶蛋白的“剔降”(knockdown)。

(3)高特异性。由 dsRNA 降解成的小干扰 RNA,除其正义链 3′端的两个碱基在序列识别中不 起主要作用外,其余碱基在序列识别中都是必需的,单个碱基的改变即可使 RNAi 失效,RNAi 能特异性降解 mRNA,针对同源基因共有序列的 RNAi 则可使同源基因全部失活。 (4)高穿透性。 RNAi 具有很强的穿透能力,能在不同的细胞间长距离传递和维持, 如在含有双 链 RNA 的溶液中,喂食表达双链 RNA 的细菌等,能向秀丽隐杆线虫导入双链 RNA。 (5)“遗传性”。已在线虫中观察到 RNAi 效应通过生殖系传递到后代,说明 RNAi 具有一定的可 遗传性。 高稳定性。细胞中可能存在天然的稳定 siRNA 的机制。此机制可能是 siRNA 与某种保护性 蛋白结合,从而使其具有相对的稳定性,这些双链 RNA 不像反义核酸那样需要多种化学修饰 来提高其半衰期。 (7)双干扰系统。哺乳动物中存在有非特异性干扰和特异性干扰两条独立的途径。 非特异性 干扰反应是由大于 30 个碱基对的双链 RNA 介导 ,导致整个细胞中非特异性蛋白合成抑 制,RNA 降解;特异性反应由 21 bp~25 bp 的小干扰 RNA 介导,可逃避非特异性干扰系统的 “监控”,只降解与其序列相应的单个基因的 mRNA[11]。 2 研究方法 在研究过程中,科研人员逐渐摸索总结出了成套的研究方法。目前,展开 RNAi 操作主要有 两种方法。一种为直接将靶向特定基因的大约 21 个碱基长短 siRNA,或 45 个~50 个碱基 的发夹结构 RNA(small hairpin RNA,shRNA)转染到细胞,shRNA 在细胞中会自动被加工 成 siRNA,从而引发基因沉默或表达抑制。另一种为构建特定的 siRNA 表达载体,通过质粒 在体内表达 siRNA 而引发基因沉默。 此法的优点是排除了 RNA 酶干扰, 延长 siRNA 半衰期。 更重要的是,该法可以进行稳定表达细胞株的筛选,且随着质粒复制扩散到整个机体,基因 抑制效果可传代。试验表明,可被化学合成或体外合成的 siRNA 抑制的基因同样可被表达 相同序列的载体表达出的 siRNA 所抑制。 3 RNAi 的应用 3.1 基因功能研究 在神经生物学研究中,科学家们通过 siRNA 表达质粒对中脑腹侧神经细胞中的多巴胺能相 关基因进行了有效抑制,还通过病毒介导的 RNAi 建立了此类成年小鼠模型,不仅为建立神 经系统的功能缺失模型找到了一些有价值的表型标记, 对神经系统的基因治疗也有一定借鉴 意义;在癌症研究中,通过 shRNA 表达载体成功抑制成年大鼠脑癌基因,同时对 RNAi 的远 程(穿过血脑屏障)基因沉默方法进行了非常有益的探索;利用细胞凋亡途径,通过 RNAi 抑制凋亡基因 Caspase-8 能提高患急性肝功能衰竭小鼠的成活率,并发现 Caspase 8 siRNA 处理对特异性 Fas 激活剂(Jo2 和 AdFasL)和野生型腺病毒介导的急性肝功能衰竭都有效, 表明这个动物模型能反应人类急性病毒肝炎多分子参与的机制,增强了 siRNA 用于急性肝 炎病人治疗的希望。 除了对某些关键基因的 RNAi 研究外, 还在哺乳动物细胞中探索了 siRNA 在基因组水平上的筛选方法。他们建立了一个包含 8 000 多个基因的 siRNA 表达框文库阵 列,通过它来高通量筛选 NF-kB 信号途径中已知的及 Unique 基因。由此可见,RNA 干扰也 正作为筛选成百甚至上千基因的工具, 发挥着越来越大的作用[13]。 RNAi 为系统地抑制 RNA 分子合成蛋白提供了快速而相对简便的途径。通过在一段时间内对一个基因 RNA 信号的抑 制,研究者可以深入研究基因功能,进而描绘支配从细胞形态到信号系统的遗传网络。 3.2 基因治疗及药物筛选探索 由于 RNAi 是针对转录后阶段的基因沉默,相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除,整个 流程设计更简便,且作用迅速,效果明显,为基因治疗开辟了新的途径。其总体思路是通过 加强关键基因的 RNAi 机制,控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及 表达。尤其针对引起一些对人类健康严重危害的病毒,如 2003 年在全球多个国家和地区流

行的 SARS,病原体是单链核酸的新型冠状病毒,寻找药物靶点,设计核酸药物就更为方便。 目前已经有很多公司在积极开发这方面的药物, 如在 SARS 药物研究中一鸣惊人的美国俄勒 冈州的 AVI BioPharma 生物制药公司等。国内也有很多研究机构及生物技术公司投入了这 方面的工作。如上海生科院成立了 SARS 防治科研攻关小组,其中生化细胞所和药物所的一 些课题组在从 RNAi 的角度努力。此外,北京大学、中南大学,北京动物所等大专院校和研 究机构, 以及北京金赛狮反义核酸技术开发有限公司等, 也开展了 RNAi 药物的研究与开发。 基因治疗方面最引人注目的进展之一是对肝炎病毒的 RNAi 研究。Mccaffrey A P 等通过表达 shRNA 的载体在细胞水平和转染 HBV 质粒后免疫活性缺失的小鼠肝脏中成功抑制了 HBV 复 制。与对照相比,小鼠血清中测得的 HBsAg 下降了 84.5%,免疫组化对 HBcAg 的分析结果 下降率更超过 99%。哈佛大学 Lieberman 研究小组通过注射针对 Fas 的 siRNA,过度激活 炎症反应,诱导小鼠肝细胞自身混乱。然后给测试小鼠注入 Fas hyperdrive 的抗体,发现 未进行 siRNA 处理的对照组小鼠在几天中死于急性肝功能衰竭,而 82%的 siRNA 处理小鼠 都存活下来,其中 80%~90%的肝细胞结合了 siRNA。并且,RNAi 发挥功能达 10 d,3 周 后才完全衰退。由于 Fas 很少在肝细胞外的其他细胞高水平表达,它对其他器官几乎没有副 作用。此外,这个小组还和其他研究者积极开展针对 HIV 的 RNAi 测试,目前报道他们使用 的针对 CCR5 蛋白的 siRNA 能阻止 HIV 进入免疫细胞约 3 周,在已经感染的细胞中也能阻 止感染病毒的复制。 然而,尽管取得了不少研究成果,但要真正用于医疗还需时日。目前大多数还停留在小鼠测 试阶段,siRNA 的导入多采用静脉或腹腔注射,尾部注射,细胞移植等,如何对人进行有效 的给药, 既能确保药效在靶器官靶组织有效释放, 还要具有高度安全性等问题都需进一步研 究。人们期待着 RNAi 引领的新医学革命的到来。 在药物筛选领域,除了线虫这种低等动物的 RNAi 高通量药筛模式外,Lavery K S 等对 RNAi 在药筛领域的应用前景进行了高度评价,RNAi 技术将逐渐成为药物靶点筛选和鉴定的强大 工具。他对如何在药筛的各个阶段应用 RNAi 做了具体描述及展望,并指出将这项技术与高 通量筛选、体外生物检测和体内疾病模式相结合,将提供大量基因功能方面的有用信息,在 药物开发过程的多个阶段促进靶点的有效筛选。 3.3 抗肿瘤治疗 多种癌基因可以作为靶点设计相对应 siRNA[14]。 Brummelkamp T R 等[15]用逆转录病毒载 体将 siRNA 导入肿瘤细胞中,特异性抑制了癌基因 K2RAS (V12)的表达。对急性髓性白血病 的研究已经取得了较好的结果。Scherr M 等[16]以引起慢性髓性白血病和 bcr2abl 阳性急性 成淋巴细胞白血病的 bcr2abl 癌基因为靶基因,设计了对应的 siRNA,并获得了 87% 的有效抑 制率。Wilda M 等[17]用 siRNA 抑制白血病 BCR/ABL 融合基因表达也取得了成功。 因此, 基于 RNAi 技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨大。有报道称,一种全新生物工程药品“RNA 干扰剂”(非干扰素)业已浮出水面,并有望在 3 年内上市。经过多年的探索,科学家终于发 现, 在癌细胞和病毒 RNA 的 22 对碱基中有 1 对碱基专门负责复制工作, 只要能使这对碱基 “休眠”,癌细胞或病毒就会自动停止复制。这一重要发现为一种全新药物——RNA 干扰剂奠 定了基础。科学家们相信,艾滋病、乙型肝炎、恶性胶质瘤(恶性脑瘤)和胰腺癌等疾病有望 成为 RNA 干扰剂的第一批受益者(2004 年经 FDA 批准已开始 RNA 干扰剂的临床试验),艾 滋病、中枢神经系统退行性病变疾病如多发性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病等将成为第 二批受益者。 3.4 抗病毒治疗 由于 RNAi 是机体中古老而天然的抗病毒机制,目前国外科技人员利用此特点,已设计出针 对 HIV gag、 tat、 rev、 nef 等基因的 siRNA, 针对丙型肝炎病毒非结构蛋白 5B 基因的 siRNA, 针对脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白和多聚酶基因的 siRNA,针对口蹄疫病毒 3D 片段 siRNA 等

[18],均在试验中取得理想结果。陆续有关通过 RNAi 抑制其他病毒在细胞内复制的报道如 呼吸道合胞病毒、人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒[19]等,国内也已设计出针 对口蹄疫病毒 VP1 基因的 siRNA, 针对丙型肝炎病毒 5′保守区的 siRNA, 针对口蹄疫病毒 IRES 和 L 串联序列两侧的保守区的 siRNA[20],针对 SARS 冠状病毒的 6 个 siRNA,即 RL001、R L002、RL003、RL004、RL005 和 RL006,均已取得理想结果。针对病原的 siRNA 已经进行 到动物实验阶段[21],向病毒病的有效防治迈出了坚实的一步。由此可见,利用 RNAi 技术 将使病毒病的有效治疗成为可能。 3.5 转基因研究 在动植物的转基因试验中, 经常发生基因沉默。因此, 对转基因沉默机制的探索可以为在转 基因研究中避免基因沉默提供对策。在转基因植物研究中避免基因沉默可提高试验成功率, 且节省时间,而在大型动物转基因研究中避免基因沉默可节约成本,提高产率。 3.6 干细胞研究 在干细胞研究方面,在 dsRNA 阻断大鼠骨髓源性神经干细胞 Hes5 表达的试验中[22],观 察外源性短 dsRNA 在转录后水平 mRNA 水平降低基因表达的效率,并对其影响因素进行了 初步探讨。 同时基于干细胞可能拥有自己的一套基因组, 不同类型的干细胞又拥有各自所特 有的基因,这些基因可能是决定干细胞特性的最关键的实质性因素。因此,RNAi 技术在此 领域应用空间广阔。 3.7 研究信号传导的新途径 Biotech 认为,联合利用传统的缺失突变技术和 RNAi 技术可以很容易地确定复杂的信号传 导途径中不同基因的上下游关系,Clemensy 等应用 RNAi 研究了果蝇细胞系中胰岛素信息 传导途径,取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果。RNAi 技术较传统的转染试 验简单、快速、重复性好,克服了转染试验中重组蛋白特异性聚集和转染率不高的缺点,因 此认为 RNAi 技术可能成为研究细胞信号传导通路的新途径。 3.8 常见病的治疗 Nature 杂志报道了 miRNA(Micro RNA)的应用上一个重要发现,成功采用 miRNA 调节了 胰岛素的分泌, 这为糖尿病的治疗带来新的希望, 也将为糖尿病的新药研究带来新的曙光和 思路。据 Sicence 杂志报道,显示应用 RNAi 技术可有效降低血管内胆固醇含量,对治疗心 血管疾病有明显的作用。 4 展望 综上所述,RNAi 技术在基因功能研究、抗肿瘤治疗、抗病毒治疗、基因应用研究、常见病 的治疗等许多方面都是强有力的工具和手段。 同时做为新兴的生物技术, 还有广阔的研究和 应用空间期待着科研人员的探索。例如,siRNA 在病毒持续性感染过程中扮演怎样的角色? siRNA 在冬眠动物体内的作用如何?RNAi 在雀斑形成中起到怎样的作用?如上述问题得到 解决,将进一步依据其机理及特点,有望应用于病毒持续性感染的鉴别诊断及治疗,利用 siRNA 在冬眠动物体内的作用进行星际航行,以解决能量供应及时间跃迁问题,RNAi 应用 于祛除雀斑等。 尽管在 RNAi 方面的研究已取得许多突破性进展,尤其是哺乳动物细胞中的研究的报道逐渐 增多,但由于 RNAi 机制尚未完全阐明,仍有许多问题尚未得到彻底解答。例如,siRNA 在哺 乳动物细胞中抑制 mRNA 表达是有效的, 但达不到果蝇细胞那样的高抑制率, 可能是因为 生物进化水平越高, 调控基因表达系统的复杂程度相应的越高, 多种抑制机制间相互作用的 频率也越高,抑制作用受到的影响因素也就越多。另外, 在哺乳动物中,RNAi 能否成功地抑 制基因表达以及抑制的程度还取决于细胞类型。对线虫来说,可以采用注射、浸泡或喂食的 方法转入 dsRNA,而对哺乳动物来说,寻找高效的方式来转入 siRNA 以及快速的方式来筛选 siRNA 仍在进一步探索中。 RNAi 在抗病毒感染中的应用令人鼓舞, 但要取得最终的成功还有

很漫长的路要走。其中一个关键的原因是 siRNA 并不能对所有病毒 RNA 发生作用,有些病 毒靶序列可能隐藏在二级结构下 , 或者位于高度折叠的区域中 , 而有些病毒序列可能与蛋 白质形成紧密的复合物, 阻碍了与 siRNA 的识别。因此,不仅要选合适的靶序列,而且需要 反复试验。另一个重要的原因是病毒子代的突变率较高, 这使病毒可逃避 siRNA 的识别。 为了克服这个障碍,所选病毒 RNA 的靶序列必须是高度保守的, 或者设计数对 siRNA 同时作 用[23]。 总之,RNAi 作为一种新发展起来的分子生物学技术,不可避免地会存在潜在的问题,这就 要求研究者在利用该技术时要考虑到生物安全性等诸多问题,以使 RNAi 技术更好地为人类 服务。


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