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无精症的全基因组关联研究进展


无精症的全基因组关联研究进展 文献检索
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综述正文
摘要:无精症是一种复杂的多因素疾病,其发生发展是遗传因素与生活方式 环境因素共同作用的结果,且存在着遗传异质性。全基因组关联分析 (genome wide association study,GWAS)已成为了现阶段研究复杂疾病与基因关系比较有 效和方便的一种方法, 为无精症遗传机制的研究提供了新的途径。 本文主要介绍 了近年来全基因组关联研究对无精症研究领域的一些重要发现, 并总结了全基因 组关联研究在这方面存在的一些问题。 Abstract:Azoospermia is a complex multifactorial disease, which is the result of the combined effects of genetic and environmental factors.Besides, there is obvious genetic heterogeneity.Genome wide association study (GWAS) has become an effective and convenient method for the study of complex diseases and gene, providing a new approach to study the genetic mechanism of azoospermia.This paper mainly introduces some important findings in genome wide association study on azoospermia, and summarizes some problems associated with genome wide association study.

目前世界范围内约有 10%-15%的育龄夫妇患有不孕不育症,其中男方因素 约占 50%[1]。 由遗传缺陷包括基因突变和染色体异常所引起的精子发生障碍估计 占男性不育因素的 30%[2]。长期以来,Y 染色体一直是男性不育遗传因素的重点 研究对象,并取得了很多重要的研究成果,尤其是证实了 Y 染色体长臂 1 区 1 带 ( Yq11 ) 处 存 在 着 与 精 子 发 生 直 接 相 关 的 多 基 因 家 族 , 称 无 精 症 因 子 (azoospermia factor, AZF)[3],AZF 区微缺失可导致男性不育[4]。 男性不育患者中, 相当大的一部分患者为无精症。无精症是一种复杂的多因 素疾病, 其发生发展是遗传因素与生活方式环境因素共同作用的结果,且存在着 遗传异质性。近年来,随着人类基因计划和基因组单倍体图谱计划的完成,通过 应用基因组中数以百万计的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP) 为标记进行病例-对照关联分析,从而确定疾病相关基因、易感区域或疾病的标 记物,从而探究复杂疾病遗传机制的方法 [5],全基因组关联分析(genome wide association study, GWAS)已成为了现阶段研究复杂疾病与基因关系比较有效和方 便的一种方法[6],从 2006 年起,已经陆续报道了糖尿病、乳腺癌、前列腺癌、 精神分裂症等几十种疾病的关联分析结果,确定了一系列疾病的易感位点[7,8,9]。 采用全基因组关联分析在全基因组范围内筛查与疾病关联的 SNP, 已发现了一些 与无精症相关联的易感位点和区域,这有助于无精症遗传机制的研究。本文就近 几年来无精症的全基因组关联研究进展作一综述。 2009 年,尤他大学医学院 Aston 团队发表了第一篇和无精症、严重少精症 有关的 GWAS 文章[10]。该项目选取来自北欧血统的 40 例非梗阻性无精症患者、 52 例 严重少精症 患 者( <5× 106\ml )和 80 例具有正常生 精能 力的正常人 (>20× 106\ml)为研究对象,通过微阵列技术进行基因分型,筛选超过 370,000 个 SNP 位点,发现了 21 个与无精症或少精症相关的 SNP 位点。2010 年,根据 这次的 GWAS 结果和其他被报道的相关 SNPs,该团队通过 Illumina BeadXpress 平台,在来自中欧血统的 80 例非梗阻性无精症患者、141 例严重少精症患者 (<5× 106\ml) 、63 例中等少精症患者(5-10× 106\ml)和 158 例具有正常生精能 力的正常人(>20× 106\ml)中对 172 个 SNPs 开展了一次扩大性的后续研究[11]。 然而,只有数个 SNPs 在这次研究中和无精症或少精症的相关性得到确证。这两 次的研究利用 GWAS 方法为探索男性不育的遗传病因开启了重要的第一步,但

是其实验结果的可靠性都被其样本量不足和种族差异性所限制, 还应该在更大并 且不同种族的人群中重复该实验。 2011 年,南京医科大学胡志斌教授团队在 Nature Genetics 上发表了一篇在 中国人群中和非梗阻性无精症相关的 GWAS 文章[12]。该研究分三个阶段进行, 研究人员在第一阶段(GWAS 阶段)的研究中选取 1,000 例无精症病人和 1,703 例对照,采用了 AffymetrixGenome-Wide Human SNP Array 6.0 芯片进行对 906,703 SNPs 进行分析,在此阶段中,以全基因组统计学 P ≤ 1.0 × 10?7 的标准 选择了 32 个与无精症相关的 SNPs。在第二阶段(确认实验 I)的研究中,针对 第一阶段筛选出的 32 个 SNP 位点在 981 例无精症病人和 1,657 例对照中进行了 重复验证, 确认了 4 个和无精症相关的位点。 在最后一个研究阶段 (确认实验 II) 中,在 766 例无精症患者和 1,995 例对照中针对第二阶段验证出来的 4 个 SNP 进行再次的重复验证,然而 SIRPA-SIRPGrs6080550 并没有超过统计学临界值。 最终得到 PRMT6 rs12097821, PEX10 rs2477686 和 SOX5 rs10842262 这三个位点 和无精症相关。 2012 年, 山东大学医学院陈子江教授团队通过 GWAS 研究发现了 HLA 区域 上两个遗传位点与无精症相关[13]。 此研究也是分为三个阶段: 在第一阶段 (GWAS 阶段) 中, 选取的样本包括来自山东省的 802 例无精症患者和来自山东省和上海 市的 1,863 例对照, 通过 HumanOmniExpressBeadChip 和 AffymetrixGenome-Wide Human SNP Array 6.0 两种技术进行基因分型从而发现了和无精症相关的 37 个 SNPs。在第二阶段的研究中,在来自华北八个省市(山东、黑龙江、吉林、辽 宁、河北、河南、天津和北京)的 818 例无精症病人和 1,755 例对照中对 GWAS 阶段发现 37 个的 SNPs 进行重复和确认。第三阶段中,选取了来自华南和中部 5 个省市(江苏、安徽、上海、湖北和广西)的 606 例无精症病人和 958 例对照为 研究对象,针对第二阶段中确认的 4 个 SNPs 开展进一步的重复确认。第二、三 阶段实验的基因分型皆采用 SequenomiPLEX 平台。经过三个阶段后,发现 HLA-DRArs3129878 和 C6orf10 and BTNL2rs498422 这两个 SNPs 和非梗阻性无精 症的风险性在 P 值上最显著相关。 此外,2012 年,芝加哥大学 Carole Ober 研究团队另辟蹊径,通过家庭人口数和 出生率两个参数来反映生育能力,开展了与这两项相关的 GWAS 研究[14]。在此

研究中,采用了 GeneChip 500K Mapping Array 、GenomeWide Human SNP Array 5.0 和 Genome-Wide HumanSNP Array 6.0 三种方法对 250,000 常见 SNPs 进行基 因分型。 选择了 269 例来自禁止避孕和拥有较大家庭人口的 Hutterite 已婚男士进 行 GWAS 实验,并在 123 个不同种族的芝加哥人群中进行验证实验,研究结果 提示 41 个 SNPs 和家庭人口数或出生率相关,其中四个 SNPs(PSAT1rs7867029、
EPSTI1rs12870438、USP8rs7174015 和 UBDrs724078)被证实和精子浓度或精子总数有

关系。 多个和生精障碍相关的 GWAS 文章发表后,数个研究团队对 GWAS 结果在 不同的人群中进行一系列验证重复实验。 日本团队分别对胡志斌教授团队和陈子 江教授团队发表的 GWAS 结果在日本人群中做了进一步的验证实验[15,16],在这 四个位点(rs12097821 、rs2477686 、rs10842262 和 rs6080550 )上并没有得 到与 GWAS 一致性的结果, 反而是这 HLA 上两个位点 (rs3129878 和 rs498422) 在日本人口中得到阳性结果。国内上海交通大学医学院对 PRMT6、PEX10 和 SOX5 这 三 个 位 点 也 进 行 了 一 次 重 复 验 证 实 验 , 然 而 该 研 究 结 果 只 支 持 SOX5rs10842262 与无精症的相关性[17]。 此外,南京医科大学的团队在 GWAS 研究结果的基础上又陆续开展了多项 关于无精症或少精症的研究, 对生精障碍的遗传病因有了更加深入的研究和认识。 2013 年,为了在基因组水平上对 GWAS 研究得出的和无精症相关的五个基因 (PRMT6、PEX10、SOX5、SIRPA 和 SIRPG)有进一步的了解,研究人员对基因 的编码区和蛋白功能区域进行了二代测序,从而鉴别出和无精症相关的罕见、低 频和常见的基因变异,然后在大样本人群中进行重复验证 [18],他们进行了一个 两阶段实验, 分别是由 96 例无精症患者和 96 个健康男性组成的基因外显子深度 测序和由 522 例无精症患者和 484 健康男性组成的重复验证试验,实验结果表 明 SIRPA 和 SIRPG 蛋白编码区的突变和无精症风险性相关。考虑到 PRMT6、 PEX10、SOX5、SIRPA 和 SIRPG 这五个基因和无精症相关,那是否和少精症有 关联呢?于是他们在中国汉人中也进行了一个两阶段的研究[19],在 96 例少精症 患者和 96 例健康对照中对五个基因进行二代测序从而寻找和少精症相关的遗传 位点, 在 688 例少精症病人和 496 例对照中对第一阶段发现的位点进行重复确认 实验, 最终 SIRPA rs3197744 和 SOX5rs11046992 被证实和少精症易感性有关系。

然而 PRMT6、PEX10、SOX5、SIRPA 和 SIRPG 这五个位点是在严格的 GWAS 统 计学 P 值下得到和无精症的相关性, 仍有一大部分的位点因为罕见或者风险效应 较小而被排除,为了克服这种限制性,2014 年,他们选取了 40 个存在于影响精 子发生的多条已知生物功能途径中的未达到全基因组意义阈值的位点, 并在较大 的人群中进行确认实验[20],并且发现了 CHD2rs1406714、GNAO1rs2126986 和 BCL2rs7226979 三个遗传位点和无精症相关。此后,他们在 3,608 例无精症患者 和 5,909 例正常对照中对那些突出而且处于 10-5<P<10-7 的 GWAS 位点再次进行 研 究 , ABLIM1rs7099208 、 HLA-DRArs7194 、 MIR133B-L17Ars13206743 和 CDC42BPArs3000811 被发现和无精症相关,并且他们还以果蝇为动物模式对基 因 CDC42BPA 开展了和不育方面的实验[21]。 随着 GWAS 技术的日益成熟,无精症或少精症相关 GWAS 研究发展迅速, 取得了一系列的成果,发现了大量相关 SNP 位点和区域。虽然目前完成的相关 GWAS 项目均对发现的 SNP 位点作用机制进行了分析与探讨, 但结论还不完善, 部分基因位点的具体机制和多个 SNP 位点间的协同作用尚不明了,还远远没能 达到解释疾病,辅助治疗的目标,还有待相关研究进一步展开。此外,无精症相 关 GWAS 研究仍存在着许多问题。第一,选取样本:样本数量对研究把握度的 正相关性,特别是 SNP 筛选阶段;样本来源的单一性降低罕见 SNP 位点被发现 的可能。第二,SNP 位点覆盖范围:SNP 芯片随着技术的不断发展而容量不断 增大, 但是现有芯片对于可能与疾病存在相关性的罕见变异位点的涵盖度还较低。 第三,GWAS 研究的把握度:GWAS 研究为了保证实验结果可靠性,在分析校 正时统计学 P 值设置严格, 从而降低了研究把握度, 漏掉了很大一部分有相关性 的常见 SNPs 和罕见 SNPs。第四,GWAS 研究的可重复性:样本人群差异、实 验方法设计、统计效能等都可能是造成 GWAS 研究的可重复性不一致的原因, 比如说除了 HLA 与无精症的相关性在多项研究结果中有较好的一致性,PRMT6 rs12097821, PEX10 rs2477686 和 SOX5 rs10842262 这三个位点在几个重复实验都 没有得到一个很好的一致性。尽管 GWAS 研究还存在许多问题去解决,但随着 相关技术的进步成熟,无精症相关 GWAS 研究将会不断深入,与生物功能学会 不断结合,整合多中心实验数据并会将研究成果向临床转换。

参考文献
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