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发酵工程期末复习资料


第一章
第二节 种子的扩大培养与保藏 种子扩大培养的目的:接种量的需要;缩短发酵时间、保证生产水平 优质种子必须具备下列五项条件: (1)菌种细胞的生长活力强,移种到发酵罐后能迅速生长以缩短迟滞期, (2)生理性状稳定,菌体生长过程稳定, (3)具有适宜的菌体总量及浓度以能满足大容量发酵的要求; (4)无杂菌污染,以确保整个发酵过程正常进行, (5)保持稳定的生产能力,使最终产物的生物合成量持续稳定高产。 一、实验室种子的制备 实验室种子的制备一般采用两种方式: 对于产孢子能力强的及孢子发芽、 生长繁殖快的菌种 可以采用固体培养基培养孢子,孢子可直接作为种子罐的种子,这样操作简便,不易污染杂 菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种,可以用液体培养法。 (一)液体种子制备 1,好氧培养: 试管→三角瓶→摇床→种子罐 2,厌氧培养:对于酵母菌(啤酒,葡萄酒,清酒等) :试管→三角瓶→卡式罐→种子罐 二、生产车间种子制备 实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养,种子罐的培养基虽因不同菌种而异, 但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等,如果是需氧菌,同时还需 供给足够的无菌空气,并不断搅拌,使菌(丝)体在培养液中均匀分布,获得相同的培养条 件。 1,种子罐的作用: 主要是使孢子发芽,生长繁殖成菌(丝)体,接入发酵罐能迅速生长,达到一定的菌体量, 以利于产物的合成。 2,种子罐级数的确定 种子罐级数:是指制备种子需逐级扩大培养的次数,取决于: 菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度;所采用发酵罐的容积 确定种子罐级数需注意的问题: 种子级数越少越好,可简化工艺和控制,减少染菌机会 种子级数太少,接种量小,发酵时间延长,降低发酵罐的生产率,增加染菌机会 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。 但也与所选用工艺条件有关。 如改变种子罐 的培养条件,加速了孢子发芽及菌体的繁殖,也可相应地减少种子罐的级数。 种子质量的控制 一、影响孢子质量的因素及控制 ? 培养基 ? 培养条件 ? 培养时间和冷藏时间 1,培养基 生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象, 其主要原因是原材料质量波动。 例如在四环素、 土霉素生产中,配制产孢子斜面培养基用的麸皮,因小麦产地、品种、加工方法及用量的不 同对孢子质量的影响也不同。蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同。 原材料质量的波动,起它要作用的是其中无机离子含量不同,如微量元素 Mg2+ 、Cu2+ 、 Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。

水质的影响:地区不同、季节变化和水源污染,均可造成水质波动,影响种子质量。 菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落, 氮源品种越多, 出现的菌落类型也越 多,不利于生产的稳定。 措施:培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用;严格控制灭菌后培养基的质量;斜面 培养基使用前, 需在适当温度下放置一定时间; 供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源, 作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源 2,培养条件 (1)温度温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。如土霉素生产菌种在高于 37?C 培养 时, 孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢, 氨基氮回升提前, 菌丝过早自溶, 效价降低等现象。 一般各生产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。 2)湿度 3,培养时间和冷藏时间 1)培养时间 一般来说,衰老的孢子不如年轻的孢子,因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段,核物质趋 于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。 措施:孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。 2) 冷藏时间: 斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。 如土霉素生产菌种孢子斜面培养 4 天左右 即于 4?C 冰箱保存,发现冷藏 7~8 天菌体细胞开始自溶。而培养 5 天以后冷藏,20 天未发 现自溶。 4, 接种量:接种量大小影响到培养基中孢子的数量,进而影响菌体的生理状况 二、影响种子质量的因素及控制 孢子的质量 培养基 培养条件 种龄 接种量 1, 培养基:营养成分适合种子培养的需要 选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基; 营养上要易于被菌体直接吸收和利用; 营养成分 要适当丰富和完全,氮源和维生素含量要高 ? 营养成分要尽可能与发酵培养基相近。 2,培养条件 (1)温度 (2)通气量:在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外,有足够的通气量可 以提高种子质量。 例如, 青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到 的种子分别接入发酵罐内,它们的发酵单位可相差 1 倍。但也有例外,例如土霉素生产菌, 一级种子罐的通气量小对发酵有利。 3, 种龄:是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期, 菌体量还未达到最大值时的培养时间较 为合适。时间太长,菌种趋于老化,生产能力下降,菌体自溶;种龄太短,造成发酵前期生 长缓慢。 不同菌种或同一菌种工艺条件不同,种龄是不一样的,一般需经过多种实验来确定。嗜 碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶,12 小时最好。 4,接种量 接种量:是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度, 采用较大的接种量可以缩短发酵 罐中菌丝繁殖达到高峰的时间,使产物的形成提前到来,并可减少杂菌的生长机会。但接种 量过大或者过小,均会影响发酵。过大会引起溶氧不足,影响产物合成;而且会过多移入代

谢废物,也不经济;过小会延长培养时间,降低发酵罐的生产率。 通常接种量,细菌 1~5%,酵母菌 5~10%,霉菌 7~15%,有时 20~25% 三、种子质量的控制措施 种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。 因此首先必须保证生 产菌种的稳定性,其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入,以获得优良种子。 四、种子质量标准 1,细胞或菌体 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观(色素、颗粒等) 单细胞:菌体健壮、菌形一致、均匀整齐,有的还要求有一定的排列或形态; 霉菌、 放线菌:菌丝粗壮、 对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。 2, 生化指标:种子液的糖、氮、磷的含量和 pH 变化。 3, 产物生成量;在抗生素发酵中,产物生成量是考察种子质量的重要指标,因为种子液中 产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。 4,酶活力:种子液中某种酶的活力,与目的产物的产量有一定的关联。 五、种子异常分析 菌种生长速度,过快或过慢;菌丝结团;菌丝粘壁
一、谷氨酸生产的种子制备

制备过程

斜面菌种

→一级种子培养

→二级种子培养

→发酵

2. 一级种子(摇瓶) 培养基:葡萄糖 2%,尿素 0.5%,玉米浆 2.5%K2HPO4 0.1% 培养条件:于 1000ml 三角瓶中,装液 200-250ml,32℃培养 12 小时。 培养基特点:有利于菌体的生长,所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基 3. 二级种子(种子罐) 培养基:和一级种子相似,其中葡萄糖用水解糖代替,浓度为 2.5% 培养条件:在种子罐中培养(容积为发酵罐的 1%)32℃培养 7-10 个小时 培养基的特点:长菌体,更接近于发酵培养基 1.表面培养法 表面培养是一种好氧静置培养方法 针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和固态表面培养。 相对于容器内培养基体积而言,表面积越大,越易促进氧气由气液(气固)界面向培养基内 传递。这种培养方法菌的生长速度与培养基深度有关,单位体积的表面积越大,生长速度也 越快。 氧的供给常成为发酵的限速因素,所以发酵周期长,占地面积大。 优点是不需要深层培养时的搅拌和通气,节省动力。如醋酸、柠檬酸发酵和曲盘制曲。

2.固体培养法:固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养,统称曲法培养。它起源于我 国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。 固体培养具有以下优点: ①原料:以谷物和农业废物为主要原料,只需外加适量水分、无机盐等。培养基组成简单。 ②防止污染:利用霉菌能在水分较低的基质表面进行增殖的特性,在这种条件下,细菌生长 不好,因此不易引起细菌污染。 ③通气: 无论浅盘或深层固体通风制曲, 可以在曲房周围使用循环的冷却增湿的无菌空气来 控制温湿度,并且能根据菌种在不同生理时期的需要,灵活加以调节。在固体培养中,氧气 是由基质粒子间空隙的空气直接供给微生物,比液体培养时的用通气搅拌供给氧气节能 3.液体深层培养 用液体深层发酵罐从罐底部通气, 送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶 解。 这种由罐底部通气搅拌的培养方法, 相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养 法来讲,称为深层培养法。 特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、 与培养基中氢离子浓度等条件,选择最佳培养条件。 几种深层培养法 ①控制培养法 ②载体培养法 ③两步法 菌种的保藏与复壮 一、菌种保藏的意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料,特别是利用微生物进行有关生产如 抗生素、氨基酸、酿造等工业,更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物 育种工作的重要组成部分。 其任务首先是使菌种不致死亡, 同时还要尽可能设法把菌种的优 良特性保持下来而不致向坏的方面转化。 二、菌种保藏的原理 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量 降低,以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态,干燥和低温, 使菌种处于“体眠”状态,抑制其繁殖能力。 一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变, 同时还需考虑到方法本身的 简便和经济,以便生产上能推广使用。 基本原则:1、挑选典型菌种的优良纯种 2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体 3、创造有利于休眠的保藏环境(如干燥、低温) 4、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株

四、菌种的衰退与复壮

1,菌种衰退:菌种经过长期人工培养或保藏,由于自发突变的作用而引起某些优良特性变 弱或消失的现象 衰退:菌种出现或表现出负变性状 菌种衰退的原因:大量群体中的自发突变 2,菌种退化的原因: ◆ 基因突变; ◆ 变异菌株性状分离; ? 诱变的单菌落是由—个以上孢子或细胞形成 ? 菌落由—个孢子或单个细胞形成,但它是多核细胞 ? 单核孢子发生突变时,双链 DNA 上仅—条链上某个位点发生变化 ◆ 连续传代 连续传代也是菌种退化的直接原因。个别细胞性状改变不足以引起菌种退化,经多次传代, 退化细胞在数量上占优势,于是退化性状表现逐步明朗化,最终成为一株退化菌株。 其它因素:菌种保藏不当;长条件不满足(培养基组成、培养条件) 3、防止衰退的措施 1)减少传代次数;2)创造良好的培养条件;3)利用单核体传代 4)经常进行纯种分离,并对相应的性状指标进行检查;5)采用有效的菌种保藏方法 4.菌种复壮:使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性。 复壮措施: (1)对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化(2)淘汰衰退的个体 (3)选择合适的培养基 空气的灭菌是好氧培养过程中的一个重要环节。 第一节 空气中的微生物与除菌方法 (一) 、空气除菌 ?工业发酵对空气处理的要求随发酵产品和菌种不同而异。 ?半固体制曲和酵母生产中无菌要求不十分严格,一般无需复杂的空所净化处理; ?密闭的深层通气发酵需严格的纯净培养,进入发酵罐前空气必须进行冷却、脱水、脱油和 过滤除菌等处理。 (二)发酵对空气无菌程度的要求 ?在工程设计中一般要求 1000 次使用周期中只允许有一个菌通过,即经过滤后空气的无菌 -3 程度为 N=10 二、空气除菌的方法 (一)热杀菌(二)静电除菌 (三)过滤除菌(四)辐射杀菌 第二节 介质过滤除菌 按过滤除菌机制不同而分为绝对过滤和深层介质过滤。 2、影响过滤效率的因素 (1)介质填充厚度与过滤效率的关系 (2)介质填充密度与过滤效率的关系:增加填充密度,可以提高过滤效率。 (3)空气流速与过滤效率的关系:在空气流速很低时,过滤效率随气流速度增加而降低, 当气流速度增加至临界值后,过滤效率随气流速度增加而提高。 3、常用过滤介质 (1)棉花(2)玻璃纤维(3)活性炭 4)超细玻璃纤维纸(5)烧结材料过滤介质 (6)新型过滤介质 4、提高过滤除菌效率的措施 (1)减少进口空气的含菌数

①加强生产场地的卫生管理, 减少生产环境空气中的含菌数②正确选择进风口, 压缩空气 站应设在上风口③提高进口空气的采气位置,减少菌数和尘埃 ④加强空气压缩前的预处理 (2)设计和安装合理的空气过滤器,选用除菌效率高的过滤介质 (3)设计合理的空气预处理设备,以达到除油、水和杂质的目的 (4)降低进入空气过滤器的空气的相对湿度,保证过滤介质能在干燥状态下工作。 ①使用无油润滑的空气压缩机②加强空气冷却和去油、水 ③提高进入过滤器的空气温 度,降低其相对湿度 三、空气预处理 空气预处理的目的: (1)提高压缩前空气的洁净度(2)去除压缩后空气中所带的油水 四、空气除菌流程分析 ?要保持过滤器有比较高的过滤效率,应维持一定的气流速度和不受油、水的干扰。 ?气流速度可由操作来控制; ?要保持不受油、水干扰则要有一系列冷却、分离、加热的设备来保证空气的相对湿度在 50%~60%的条件下过滤。 空气净化的流程 吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤---进入空气压缩机(120-150 度)---冷却(20-25 度) ,除去油、水,再加热至 30-35 度---最后通过总过滤器和分过滤器除菌,获得洁净度、 压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。 一、培养基的营养成分 微生物的营养活动,是依靠向外界分泌大量的酶.将周围环境中大分子的蛋白质、糖类、 脂肪等营养物质分解成小分子化合物, 再借助细胞膜的渗透作用, 吸收这些小分子营养来实 现的。 所有发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的能源,包括碳源、氮 源、无机元素、生长因子及水、氧气等。 对于大规模发酵生产,除考虑上述微生物的需要外, 还必须重视培养基原料的价格和来源。 糖蜜预处理的方法 由于糖蜜干物质浓度很大,糖分高,产酸细菌多,灰分与胶体物质很多,如果不预先进行 处理,微生物是无法直接进行发酵的。因此必须进行预处理,糖密的处理程序包括稀释、酸 化、灭菌、澄清和添加营养盐等过程。 1、加酸通风沉淀法 2、加热加酸沉淀法 3、添加絮凝剂澄清处理法 淀粉水解糖的制备 一、淀粉水解糖的制备方法 1.酸解法 2.酶解法(双酶水解法) : 优点:①反应条件温和 ②专一性强,转化率高;③可高浓度水解; ④可使发酵培养基的组 成简化;⑤糖液质量高。 缺点:反应时间长、设备多、需专门的培养条件、糖液过滤难。 3.酸酶结合法 (1)酸酶法: (2)酶酸法: 二、培养基的分类 (1)按培养基组成物质的化学成分:合成培养基、天然培养基。 (2)按物理性质:固体,液体 (3)按用途: 选择性培养基、鉴别培养基、富集培养基等 (1)天然培养基

是采用化学成分还不清楚或化学成分还不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、 水解液等物质(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等)制成的。

?

适合于各类异养微生物生长,而一般自养微生物都不能生长。 (2)合成培养基 ?是用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的。成分精 确,重复性强,可以减少不能 控制的因素 适用于在实验室范围作有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析等定量 研究工作。 但一般微生物在合成培养基上生长较慢,有些微生物营养要求复杂,在合成培 养基上不能生长。 (3)半合成培养基 ?多数培养基配制是采用一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源,再适当加入一 些化学药品以补充无机盐成分,使其更能充分满足微生物对营养的需要。 ?大多数微生物都能在此培养基上生长繁殖。因此,在微生物工业生产上和试验研究中被广 泛使用。

?液体培养基:常用于大规模的工业生产及生理代谢等基本理论研究工作。
发酵工业多用作培养种子和发酵的培养基。 根据微生物对氧的要求情况, 分别作静止或通风 搅拌培养。 在菌种筛选工作和菌种培养工作中, 也常用液体培养基进行摇瓶培养微生物在液 体培养基中生长的情况有时也可用作鉴定菌种的参考。

?固体培养基

分类:斜面试管、平板等 是在液体培养基中加入凝固剂配成的,最常用的凝固剂是琼脂。 作用:固体培养基在菌种的分离、保藏、菌落特征的观察、活菌计数和鉴定菌种方面是不可 缺少的。 在制曲、酶制剂、柠檬酸等生产中,用来培养霉菌等的固体种子和发酵培养基是由麸皮等农 作物加无机元素等制成的。

?选择培养基:是在培养基内加入某种化学物质以抑制不需要菌的生长,而促进某种需要菌
的生长。

?增殖培养基:可以配制成适合某种微生
物生长而不适合其他微生物生长,从而达到从自然界分离这种微生物的目的。

?鉴别培养基:是根据微生物能否利用培养基中某种营养成分,借助指示剂的显色反应,以
鉴别不同种类的微生物。 三、发酵生产中的培养基类型 工业发酵中培养基往往是依据生产流程和作用分为: 斜面培养基, 种子培养基, 发酵培养基, 摇瓶培养基 1.斜面培养基 作用:这是供微生物细胞生长繁殖用的,包括细菌,酵母等的斜面培养基以及霉菌、放线菌 生孢子培养基或麸曲培养基等。 这类培养基主要作用是供给细胞生长繁殖所需的各类营养物 质。 特点:1.富含有机氮源,少含或不含糖分。有机氮有利于菌体的生长繁殖,能获得更多的细 胞。2.对于放线菌或霉菌的产孢子培养基,则氮源和碳源均不宜太丰富,否则容易长菌丝而 较少形成孢子。3.斜面培养基中宜加少量无机盐类,供给必要的生长因子和微量元素。 2.种子培养基(包括摇瓶种子和小罐种子培养基):

?培养种子的目的: ?1.扩大培养,增加细胞数量; ?同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。

?种子培养基特点: ?1. 必须有较完全和丰富的营养物质,特别需要充足的氮源和生长因子。 ?2. 种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基,可添
加一些易被吸收利用的碳源和氮源。 ?3. 种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。 3.发酵培养基 ?发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基,它不仅耗用大量的原材料,而且也是决定发酵 生产成功与否的重要因素。 ?(1)根据产物合成的特点来设计培养基:对菌体生长与产物相偶联的发酵类型,充分满 足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。 对于生产氨基酸等含氮的化合物时,它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外,还应该添 加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。 (2)发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些,这样在同等或相近的转化率条件下 有利于提高单位容积发酵罐的利用率,增加经济效益。

?(3)发酵培养基需耗用大量原料,因此,原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以
重视。 四、发酵培养基的选择

?(1)必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。 ?(2)有利于减少培养基原料的单耗,即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。 ?(3)有利于提高培养基和产物的浓度,以提高单位容积发酵罐的生产能力。 ?(4)有利于提高产物的合成速度,缩短发酵周期。 ?(5)尽量减少副产物的形成,便于产物的分离纯化。 ?(6)原料价格低廉,质量稳定,取材容易。 ?7)所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响,利于提高氧的利用率,降低能耗。 ?(8)有利于产品的分离纯化,并尽可能减少产生“三废”的物质。
发酵培养基的设计和注意事项

?

1.提供必要的营养成分:培养基成分必须满足细胞生长,代谢活动和合成产物所需的基 本要求。

?2.配制合适的浓度:可以从发酵动力学有关生长、产物合成和基质利用物料平衡的关系
中大致推算所需原料或大致计算出所需主要原料的需要量。

?3. 主成分与其他成分的配比。 ?4.控制合适的 pH:微生物的生长繁殖或产物的合成往往需要已一定的

pH 环境,在最适 pH 值下有利于加快各种酶的反应。 因此在整个发酵过程中应使培养基的 pH 适合于微生物生 长或产物合成所需。 pH 的具体控制方法 ?1. 可以在微生物培养过程中加入酸或碱或流加某些营养物质调节培养基的 pH,但更应在 配制培养基时考虑所用营养物质的组成成分,使其 pH 值适合该微生物生长或合成代谢产物 的需要。 ?2. 还要注意有些营养物质被利用后培养基的 pH 变化情况.

?3.

控制 pH 最常用的方法是在培养基中添加具有一定缓冲能力的物质作为营养物,如以磷 酸盐作为磷的成分;或者避免使用容易产生生理酸性或碱性使培养基 pH 波动太大的物质。 ?4.避免产生微生物不能利用的物质或形成沉淀 ?葡萄糖与铵盐或氨基酸的氨基在灭菌高温下作用形成深褐色物质。这种物质不被微生物利 用。因此这两类营养物不宜直接配在一起进行灭菌,而应采用分开灭菌后再加入发酵罐内。

?硫酸铵中的 SO42-与钙盐易形成难溶的硫酸钙,因此二者也不宜直接配成培养基。 ?5.注意代谢调节物的影响: ?有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或抑制发酵产物的形成。
前体物质,诱导剂,阻遏物,抑制剂,金属离子 (二)发酵培养基的设计和优化 目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方, 只能用 生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论,参照前人所使用的较适合某一类菌种的经 验配方,再结合所用菌种和产品的特性,采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备,按照一定的实 验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。 1.培养基设计的步骤 ①根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题,初步确定可能的培养基成分; ② 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分; ③ 当培养基成分确定后,剩下的问题就是各成分最适的浓度,由于培养基成分很多,为减 少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。

生产用菌种的保藏
1、 意义:菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料,特别是发酵生产如抗生素、 氨基酸、酿造等工业,更离不开菌种,所以菌种保藏是进行微生物学以及和微生物育种 工作的重要组成部分,是微生物工业生产的重要环节。 菌种不变异是相对而言的, 实际上没有一种方法可使菌种绝对不变化。 所以菌种保藏就是要 采用最合适的保存方法,使菌种的变异和死亡减少到最低限度。 2、主要目的

?保证菌种在长时间内尽可能保持原有菌株优良的生产性能,提高菌种的存活率,减少菌种
的变异,以及不被杂菌污染以利于生产上的长期使用。 3、原理:菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性,人工创造条件使菌体的代谢活动处 于休眠状态,使其生长繁殖受到抑制。人工创造条件① 挑选优良纯种,且为菌种的休眠体 (孢子、芽孢等) ;② 创造最有利休眠状态的环境条件,如低温、干 燥、缺氧、缺乏营 养物质等。 一个较好的菌种保藏方法, 应能保持菌种的优良特性和较高的存活率, 同时也因考虑到 方法本身的经济、简便。由于微生物种类繁多,代谢特点各异,对各种外界环境因素的适应 能力不一致,因此一个菌种具体采用什么方法,要根据具体情况而定。 例如:某些细菌在其生长发育后期,在细胞内形成一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低, 抗逆性极强的休眠体,称为芽孢。芽孢是整个生物界中抗逆性最强的生命体,在抗热、抗化 学药物、抗辐射和抗静水压等方面,更是首屈一指。 一、操作方法 (一) 、干燥保藏法 干燥包括从培养物中除去水分和防止再吸水。 1、砂管保藏法和土壤保藏法(该法适用于芽孢杆菌、放线菌、曲霉菌等的保藏) 2、硅胶干燥法 3、纸条保藏法 4、陶瓷珠干燥保藏下干燥的环境中密封保存。 5、冷冻干燥保藏法 (二)冷冻保藏法 1、在 20%(体积分数)甘油中-50℃保藏 2、玻璃珠中甘油保藏 3、液氮冷冻保藏法 (三)中间培养物保藏法 1、冰箱中的琼脂上 2、室温下的琼脂上 3、室温下的琼脂块上 4、矿物油保藏法 5、中间培养与单孢子选择结合保藏法

(四)基因工程菌的保藏 三、菌种保藏管理 1、活力测定: 活力、纯度、理想性状的保留的测定。 菌株保藏后的活力筛选应以菌株产生次级代谢产物的能力为依据。 2、培养记录及计算机管理 菌株标记包括: (1) “室内”收集及参考数字(2)来源及参考数字的来源,或其他收集的相当数字 (3)菌株名或同义词(4)交替状态(5)分类(6)存放日期(7)产品产量(8)致病 性/许可状况(9)培养条件:培养基、生长温度、PH 及营养需要(10)分离培养基及方法 (11)一定范围培养基的培养(12)培养物使用(13)保藏方法 3、螨的防止 螨会破坏以某些保藏方式保藏的菌种或吃掉培养物或将培养物的孢子粘在身 上,导致交叉感染。 4、安全 (1)病原体:操作应在通风厨中进行,各种器皿应进行消毒处理;废物处理前应进行灭菌; 液氮保存时不能用玻璃器皿。 (2)干燥剂-P2O5: P2O5 是腐蚀性的,应在通风厨中进行,分装时戴面具、手套。 (3)液氮: 脸部全面防护,铁手套,样品解冻未达到室温时需保护。 防止菌种退化的措施 菌种的退化:菌种退化通常是指在较长时期传代保藏后,菌株的一个或多个生理性状和形 态特征逐渐减退或消失的现象。 常见的菌种衰退在形态上表现为分生孢子的减少或菌落颜色 的改变。在生理上常指菌种发酵力的降低,或抗噬菌体能力降低。对通过诱变育种而获得的 高产变异株则常表现出恢复野生型性状等。 引起菌种退化的原因: ★ 核基因突变:菌种退化的主要原因是有关基因的负突变,这些负突变都是自发形成的。 在发酵生产中常用营养缺陷型突变株,如缺陷型发生回复突变就会使产量水平下降。 ★ 连续传代: 连续传代也是菌种退化的直接原因。 个别细胞性状改变不足以引起菌种退化, 经多次传代,退化细胞在数量上占优势,于是退化性状表现逐步明朗化,最终成为一株退化 菌株。 ★ 其它因素:温度、湿度、培养基成分及各种培养条件都会引起菌种的基因突变。例如在 菌种保藏中基因突变率就随温度降低而减少。 菌种的复壮 纯种分离的方法 : (1)稀释分离法 :是通过不断的稀释手段使被分离的样品分散到最低限度,然后吸取一定 量注入平板,这样分散的菌种就被固定在原处而形成菌落 。 (2)平板划线法 :是用划线的方法将混杂的微生物在平板表面分散开来,最后以单个菌体 细胞生长繁殖,形成单个菌落,达到分离,得到纯种 。 (3)组织分离法 :用子实体的某一部分来分离菌种的方法,称为组织分离法。组织分离法 简便,后代不易发生变异,能保持原菌株的优良特性。

第二章:菌种的来源
第一节 微生物的特性及工业微生物的要求 一、微生物的特性 有些微生物能在厌氧的条件下生长; 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身的 生长;有些微生物能进行复杂的代谢;有些微生物能利用较复杂的化合物;有些微生物能在

极端的环境下生长。 二:工业化菌种的要求 ①能够利用廉价的原料,简单的培养基,大量高效地合成产物 ②有关合成产物的途径尽可能地简单,或者说菌种改造的可操作性要强 ③遗传性能要相对稳定 ④不易感染它种微生物或噬菌体 ⑤产生菌及其产物的毒性必须考虑(在分类学上最好与致病菌无关) ⑥生产特性要符合工艺要求 代谢控制发酵: 用人工诱变的方法, 有意识地改变微生物的代谢途径, 最大限度地积累产物, 这种发酵形象地称为代谢控制发酵,最早在氨基酸发酵中得到成功应用。 氨基酸生产菌的要求:代谢途径比较清楚,代谢途径比较简单 谷氨酸发酵的菌种:棒杆菌属,短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌 其它氨基酸生产菌:常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成;工程菌,大肠杆菌,枯草 芽孢杆菌 三、食品酶制剂生产有关的微生物 α —淀粉酶:黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌 四、常用的基因表达系统 一)原核生物:大肠杆菌(1977 年 Boyer)、枯草牙胞杆菌,沙门氏菌 生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速;外源基因的导入相对容易; 已建立了整套表达理论及技术。 (二) 真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞): 生长迅速,营养要求不高,易培养;安全性好;比哺乳动物细胞操作简单;具有一定的修饰 蛋白的能力。 一、菌种分离的一般过程: 土样的采取→土样预处理→ 富集培养→ 菌种初筛-----菌种复筛----性能鉴定--菌种保藏 目的:高效地获取一株高产目的产物的微生物。 二、目的微生物富集的一些基本方法 富集的目的:让目的微生物在种群中占优势,使筛选变得可能。 三、菌落的选出 从产物角度出发: 在培养时以产物的形成有目的的设计培养基, 利用简单、 快速的鉴定方法, 如抗生素 从形态的角度:菌落的外观形态,是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基 上生长,从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。 第四节 菌株选育、分子改造目的:防止菌种退化;解决生产实际问题;提高生产能力;提 高产品质量;开发新产品。 方法:基因突变,自然选育,诱变育种,基因的直接进化,基因重组。 自然选育定义:不经过人工处理,利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程。由于促 使变异产生的环境因素的影响较溺,不可能产生大的变异,也就难以依赖自然选育来获得 高产突变株。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 自然选育操作步骤: 单细胞(孢子)悬液的制备-----平板分离-----挑选单菌落(注意形态的观察)-----发酵试验 稀释涂布平板法 步骤: 1、倒平板: 牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌) ,高氏 I 号培养基(培养放线菌的

淀粉硝酸盐培养基) ,查氏培养基(培养真菌的蔗糖硝酸盐培养基)冷却至 55-60℃时,混 匀后倒平板,牛肉膏蛋白胨培养基、高氏 I 号培养基和查氏培养基各倒 3 皿。 2.制备污水稀释液:10g 土样,加入 90ml 无菌水中,在三角瓶中振摇 20min。取 1ml 加入 盛有 9ml 无菌水的试管中,以此类推,制成不同稀释度。 3、涂布:将上述每种培养基平板底面标记稀释度,然后用无菌吸管从最后三种稀释度,即 10-4、10-5 和 10-6 的试管中吸取 0.2ml 对号放入平板上,用玻棒涂布。 4、培养:高氏 I 号和查氏倒置培养于 28℃培养箱中培养 3-5days,牛肉膏蛋白胨琼脂 培养基在 37℃培养 1-2days。 5、挑菌落:转至斜面,保存。 平板划线法: 1、倒平板,标记培养基名称,编号和实验日期。 2、划线方法 二、诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选,称为诱变育种。诱变剂:能够提 高生物体突变频率的物质称为诱变剂 诱变剂:物理:紫外,快中子、β 射线等 化学:硫酸二乙酯,亚硝基胍、5-溴嘧啶等 生物 :噬菌体 、转座子 诱变育种工作中应考虑的几个原则:选择简便有效的诱变剂;选优良的出发菌株;处理单 孢子(或单细胞)悬液;选用最适剂量;利用复合处理的协同效应;利用和创造形态,生 理与产量间的相关指标;设计或采用高效筛选方案或方法。 紫外线的诱变育种:紫外线诱变一般采用 15W 紫外线杀菌灯,波长为 2537A.灯与处理物的 距离为 15~30cm,照射时间依菌种而异,一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死 亡率表示,希望照射的剂量死亡率控制在 70~80%为宜。 由于紫外线照射后有光复活效应,所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。 充分利用复合处理的协同效应:青霉菌的选育中先用不足以引起突变的氮芥短暂处理,再 用紫外线处理,可使诱变频率大大提高。 ① 杂交育种:杂交育种(Hybridization)一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性 生殖或原核微生物的接合、F 因子转导、转导和转化等过程,促使两个具不同遗传性状的菌 株发生基因重组,以获得性能优良的生产菌株。 ②原生质体融合优点: (1) 去除了细胞壁的障碍,亲株基因组可直接触合、交换,实现重组而不需要有已知的遗传 系统; (2)原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交换,产生各种各样的基因组而得 到多种类型的重组子,参与融合的亲株数并不限于一个,可以多至三个、四个,这是一般常 规杂交所达不到的; (3)重组频率特别高,因为有聚乙二醇作助融剂。 (4)可以和其他育种方法相结合,把由其他方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到 一个单株中。 (5)可以先用温度、药物、紫外线等处理钝化亲株的一方或双方,然后使之融合,再在再生 菌落中筛选重组子,这样往往也可以提高筛选效率。 ④基因工程育种 一个完整的基因克隆过程包括以下步骤 1、获得待克隆的 DNA 片段(基因) ;2、目的基因与载体在体外连接;3、重组 DNA 分子

导入宿主细胞;4、筛选、鉴定阳性重组子;5、重组子的扩增或表达。 本章小结: ①涉及到工业化生产对于某一种特定的产品, 只有特定的微生物(动、 植物)才具有大量表达 的潜力;②目前土壤中已分离的微生物不到总数的 1%,微生物的多样性仍然是以后若干年的 研究重点; ③传统的诱变方法仍然是一种采用的方法, 特别是自然选育是工业发酵稳产高产 的重要保证④基因重组、直接进化技术的应用,大大加快了生物产品开发的进程。

培养基和设备的灭菌
在发酵生产中,为什么要进行灭菌操作? 1 由于杂菌的污染, 使生物反应中的基质或产物因杂菌的消耗而损失, 造成生产能力的下降; 2、由于杂菌所产生的一些代谢产物,或在染菌后改变了培养液的某些理化性质,使产物 的 提取和分离变得困难,造成收率降低或使产品的质量下降; 3、杂菌会大量繁殖,会改变反应介质的 PH 值,从而使生物反应发生异常变化; 4、杂菌可能会分解产物,从而使生产过程失败; 5、发生噬菌体污染,微生物细胞被裂解,而使生产失败,等等 工业上具体的措施: 1.使用的培养基和设备须经过灭菌 2.好氧培养中使用的空气应除菌处理 3.设备应严密,发 酵罐维持正压环境 4.培养过程中,加入的物料应经过灭菌 5.使用无污染的纯粹种子 一、灭菌的原理和方法 消毒与灭菌在发酵工业中均有广泛应用。消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、 器具内外的病源微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如,用于消牛奶、 啤酒和酿酒原汗等的巴氏消毒法,是将物料加热至 60 维持 30min,以杀死不耐高温的物料 中的微生物营养细胞。 灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物,包括营养细胞、细菌芽孢和 孢子。 消毒不一定能达到灭菌要求,而灭菌则可达到消毒的目的。 1、 化学试剂灭菌法:化学试剂:甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 ; 适用范围:环境 空气、皮肤及器械的表面消毒 2、 射线灭菌法:电磁波、紫外线或放射性物质 适用范围:无菌室、接种箱 3、 干热灭菌法 ;常用烘箱,灭菌条件为在 160℃下保温 1h 适用范围:金属或玻璃器皿 4、湿热灭菌法 :利用饱和蒸汽进行灭菌、条件为:121℃,30min 适用范围:广泛应用于生产设备及培养基的灭菌 例:高压灭菌锅 5、过滤除菌法 :利用过滤方法阻留微生物 适用范围:制备无菌空气 6、火焰灭菌法 :火焰 :适用范围:接种针、玻璃棒、三角瓶口 、酒精灯 二、培养基的灭菌 湿热灭菌原理:由于蒸汽具有很强的穿透能力,而且在冷凝时会放出大量的冷凝热,很容易 使蛋白质凝固而杀死各种微生物。 灭菌条件:121℃,30min。 灭菌不利方面:同时也会破坏培养基中的营养成分,甚至会产生不利于菌体生长的物质。因 此,在工业培养过程中,除了尽可能杀死培养基中的杂菌外,还要尽可能减少培养基中营养 成分的损失。 衡量热灭菌指标 : 热死时间:即在规定温度下杀死一定比例的微生物所需要的时间。 致死温度:杀死微生物的极限温度。

致死时间:在此温度下,杀死全部微生物所需要的时间。 热阻:对热的抵抗力,指微生物在某一特定条件(主要是温度和加热方式)下的致死时间。 相对热阻: 几种微生物对热的相对抵抗能力。 指微生物在某一特定条件下的致死时间与另一 微生物在相同条件下的致死时间的比值。 三、微生物的热死规律和影响灭菌的因素 在发酵工业中,对培养基和发酵设备的灭菌,广泛使用湿热灭菌法。工厂里,蒸汽比较容易 获得,控制操作条件方便,是一种简单而又价廉、有效的灭菌方法。用湿热灭菌的方法处理 培养基, 其加热受热时间与灭菌程度和营养成分的破坏都有关系。 营养成分的减少将影响菌 种的培养和产物的生成, 所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾, 恰当 掌握加热受热时间是灭菌工作的关键。 1、 微生物的死亡速率:对数残留定律 2、死亡速率常数 ? (比死亡速率) 3.灭菌温度的选择 灭菌温度的选择应考虑的因素主要有: a.微生物的热致死温度。选择的温度应高于该温度。通常以芽孢为准。 b.营养成分的破坏。灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程 因此,灭菌温度的选择, 应是在保证灭菌效果的前提下,尽可能减少培养基中营养成分的破坏。因此,可择合适的灭 菌温度和时间来调和二者之间的矛盾。 4、影响培养基灭菌的其他因素 (1) 值的影响 : 值对微生物的耐热性影响很大, 为 6.0~8.0 时微生物最不易死亡, pH pH pH pH <6.0 时氢离子易渗入微生物的细胞内。从而改变细胞的生理反应,促其死亡。所以培养 基的 PH 值越低,灭菌所需的时间越短。 (2)培养基成分 :培养基的成分中,油脂、糖类、蛋白质都是传热的不良介质,会增加微 生物的耐热性,使灭菌困难。浓度较高的培养基相对需要较高温度和较长时间灭菌。高浓度 的盐类、色素则削弱其耐热性,故较易灭菌。 (3)培养基中的颗粒物质 :培养基中的颗粒物质大,灭菌困难,反之,灭菌容易。一般说 来,含有颗粒对培养基灭菌影响不大,但在培养基混有较大颗粒,特别是存在凝结成团的胶 体时,会影响灭菌效果,必须过滤除去。 (4)泡沫: 泡沫中的空气形成隔热层,使传热困难,热难穿透过去杀灭空气中的微生物。 所以,对易产生泡沫的培养基在灭菌时,可加入少量消泡剂。 (5)细胞含水量: 细胞含水越多,蛋白质变性的温度越低 (6)细胞菌龄:老细胞水分含量低,低龄细胞水分含量高。 (7)空气排除情况 在灭菌过程中,为什么要排除罐内空气? 蒸汽灭菌过程中, 温度的控制是通过控制罐内的蒸汽压力来实现。 压力表显示的压力应与罐 内蒸汽压力相对应, 即压力表的压力所对应的温度应是罐内的实际温度。 但是如果罐内空气 排除不完全,压力表所显示的压力就不单是罐内蒸汽压力,还包括了空气分压,因此,此时 罐内的实际温度就低于压力表显示压力所对应的温度,以致造成灭菌温度不够而灭菌不彻 底。 四、分批灭菌和连续灭菌比较 培养基的工业灭菌通常涉及到以下几个概念: 1.空消: 意义:由于空消时反应器内的死角少,蒸汽的传热效率高,对于反应器灭菌效果好,通 常在较长时间没有使用的反应器、染菌的反应器、更换菌种时都要进行空消。采用培养基连

续灭菌的工艺,需要空消。 2.实消(实罐灭菌) :与空消对应,反应器里装有培养基。 3、分批灭菌与连续灭菌的比较 分批灭菌或连续灭菌都有各自的优点和缺点,现比较如下 :

灭菌方式





缺 点
1.对设备的要求高,需另外设置加热、 冷却装置; 2.操作较麻烦; 3.染菌的机会较多; 4.不适合于含大量固体物料的灭菌; 5.对蒸汽的要求高。

连续 灭菌

1.灭菌温度高, 可减少培养基 中营养物质的损失 ; 2.操作条件恒定, 灭菌质量稳 定 ; 3.易于实现管道化和自控操 作 ; 4.避免了反复的加热和冷却, 提高了热的利用率; 5.发酵设备利用率高。 1.设备要求低, 不需另外设置 加热、冷却装置; 2.操作要求低,适于手动操 作; 3.适合于小批量生产规模; 4.适合于含有大量固体物质 的培养基的灭菌。

分批 灭菌

1.培养基的营养物质损失较多, 灭菌后 培养基的质量下降; 2.需进行反复的加热和冷却能耗较高; 3.不适合于大规模生产过程的灭菌; 4.发酵罐的利用率较低。

由表可见,无论在理论上或者在实践上,与间歇灭菌过程相比,连续灭菌的优点十分明显。 因此,连续灭菌越来越多地被用培养基的灭菌。 但是出于对设备的考虑,中小型罐还是采 用分批灭菌比较好。 第四章 柠檬酸发酵机制 柠檬酸又名枸橼酸,学名α -羟基丙烷三羧酸,是生物体主要代谢产物之一。 分子式 C6H8O7,分子量 192.12 有两种形式 水合物:100℃时融解,密度 1.542g/cm3(18℃) ; 无水物:无色晶体或粉末,熔点 153℃ 有强酸味。溶于水、乙醇和乙醚 用途:1)食品行业 2)医药行业 3)化工行业 4)其它行业 柠檬酸的生产: 1874 年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体; 1913 年首次实现利 用黑曲霉发酵生成柠檬酸。 1953 年,Jagnnathan 等证实了黑曲霉中存在 EMP 途径的所有酶; 1954 年,Shu 提出葡萄糖分解代谢中约 80%走 EMP 途径; 1958 年,MeDomough 等发现黑曲霉还存在 HMP 途径的酶,但 HMP 途径主要存在于孢子 形成阶段; 1954-1955 年,Ramakrishman 和 Martin 研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环; + + 存在两个 CO2 固定系统(需 Mg2 、K ) : 1) 丙酮酸(PYR)在丙酮酸羧化酶作用下,生成草酰乙酸(此作用更强) 2) 2)磷酸烯醇丙酮酸(PEP)在 PEP 激酶的作用下,生成草酰乙酸 碳平衡和能量平衡 二、柠檬酸生物合成的代谢调节
?

(一) 、糖酵解及丙酮酸代谢的调节 1、正常情况下,柠檬酸、ATP 对磷酸果糖激酶有抑制作用,而 AMP、无机磷、铵离子对该 酶则有激活作用,特别是还能解除柠檬酸、ATP 对磷酸果糖激酶的抑制作用。 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系, 正是由于细胞内浓度升高, 使磷酸果糖激酶对细 胞内积累的大量柠檬酸不敏感。 2.比较底物锰充足、 锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现, 锰缺乏时黑曲霉的组成 (合成) 代谢受损伤,这与柠檬酸的积累有关。 + 锰缺乏时,细胞内 NH4 浓度高,Aa 浓度高(蛋白合成受阻,导致升高) 。因此,锰离子 + 效应是通过 NH4 升高而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的。 3.丙酮酸激酶是 EMP 途径的第 2 个调节点,在某些真菌得到证实,但黑曲霉未被证实。 (二) TCA 循环的调节 1、TCA 环的起始酶:柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中,柠檬酸合成酶没有调 节作用,这是黑曲霉 TCA 环的第一个特点。 ? 顺乌头酸酶失活,阻断 TCA 环是柠檬酸积累的必要条件,顺乌头酸水合酶需要 Fe2+。顺 乌头酸酶、异柠檬酸酶在 pH2.0 时失活,线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸:顺乌头酸: 异柠檬酸=90:3:7 的平衡,这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累而使 pH 值降低。

?2.第二个特点:黑曲霉菌体内α -酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低(TCA 环被阻断) ,它被
葡萄糖和 NH4 抑止 。 (是 TCA 循环中唯一不可逆的反应步骤) ?3 氧和 pH 值对柠檬酸发酵的影响很大。 ?氧是发酵过程(EMP 途径和丙酮酸脱氢)生成的 NADH2 重新氧化时所需 ?标准呼吸链产生 ATP 积累,侧呼吸链不产生 ATP,缺氧导致侧呼吸链失活,使 ATP 积累, 柠檬酸积累减少。 TCA 循环在柠檬酸积累中所起作用可归纳为: (1)大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键 (2)丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或其控制及微弱,而且这两 个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供,增加了柠檬酸的合成能力 (3)TCA 循环的阻断微弱,导致循环中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡状态,使柠檬 酸积累, 当柠檬酸浓度超过一定水平时, 就通过抑止异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。 ③丙酮酸氧化脱羧生成乙酰 CoA 和 CO2 固定两个反应的平衡, 以及柠檬酸合成酶不被调节, 增强了合成柠檬酸的能力。 ④由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡: 柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸=90:3:7 同时控制 Fe2+含量时,顺乌头酸酶活力降低,使柠檬酸积累。 ⑤随着柠檬酸积累,pH 降低到一定程度时,使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活,更有利 于柠檬酸的积累及排出细胞外。


三、乙醛酸循环和醋酸发酵柠檬酸 丙酮酸脱羧反应是不可逆的,草酰乙酸的供给只能由乙醛酸循环来完成 存在异柠檬酸裂解酶,合成柠檬酸的 C4 二羧酸只能由乙醛酸提供。 作业:简述柠檬酸生物合成的代谢调节 第五章 氨基酸发酵机制 第一节 氨基酸发代谢调控酵的 氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵, 所生氨基酸作为微生物发酵的一大类代谢中间 产物, 其代谢调控一般采用下述方法中的一种或几种方法结合起来, 以实现对生产菌种的代 谢调控、大量合成和积累氨基酸。 一、控制旁路代谢 二、降低反馈作用物的浓度:控制反馈作用物浓度能克服反馈抑制和阻遏,使氨基酸的生物 合成反应顺利进行;利用营养缺陷型突变株进行氨基酸发酵必须限制所要求的氨基酸的量。 三、消除终产物的反馈抑制与阻遏作用:使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法。是一种与 初级代谢产物结构类似但缺乏生理功能的化合物。 四 控制细胞渗透性 生物素、油酸和表面活性剂,引起细胞膜的脂肪酸成分的改变。 青霉素:抑制细胞壁的合成,由于细胞面内外的渗透压而泄露出来。 六 促进 ATP 的积累以利于氨基酸的生物合成 氨基酸的生物合成需要能量,ATP 的积累可促进氨基酸的生物合成.P67 第二节 谷氨酸发酵机制 谷氨酸,学名:α -氨基戊二酸;其单钠盐:谷氨酸钠,商品名称味精,是重要的调味品。 谷氨酸生产菌能够在体外积累为菌体最大生长需要量 300 多倍的谷氨酸, 研究发现: 大量积 累并非是当初设想的由于特异代谢途径导致,而是: ①代谢调节控制 ②细胞膜通透性的特异调节 ③发酵条件的适合; 一、谷氨酸生产菌:节杆棒状杆菌属 (Corynebacterium)短杆菌属 (Brevibacterium) 小杆菌属 (Microbacterium)菌属 国内常用菌株:北京棒杆菌;钝齿棒杆菌;天津短杆菌 2、谷氨酸生产菌的主要特征

1) GA 产生菌体内的 NADPH 的在氧化能力欠缺或丧失. 2)都是需氧型;3)多为生物素缺陷型 4)发酵中菌体发生明显的形态变化,同时发生细胞膜渗透性的变化 5) 二氧化碳固定反应酶系活力强;6)异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱、乙醛酸循环弱; 7)异柠檬酸脱氢酶活力强,提供 NADPH,用于还原α -酮戊二酸生成谷氨酸.形成氧化还原共 轭体系.8)柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶活力强; 9)具有向环境中泄漏谷氨酸的能力; 10)菌体有强烈的 L—谷氨酸脱氢酶活性 二、谷氨酸发酵机制 1) 谷氨酸脱氢酶(GHD)催化的还原氨基化反应 2) 转氨酶催化的转氨反应 ?-酮戊二酸 + NH4+ + NADPH2 ——→ 谷氨酸 + H2O + NADP 3) 谷氨酸合成酶(GS)催化的反应 2、谷氨酸生物合成途径 酵解途径 (EMP) 己糖一磷酸途径 (HMP 三羧酸循环 (TCA) 乙醛酸循环 二氧化碳固定反应 在 GA 产生菌菌体内 CO2 固定反应有以下两条途径: 需要 Mn+做催化剂,所以,在 GA 发酵过程中需要向培养基中补充 Mn+ 实际上,发酵过程中不可能控制柠檬酸合成所需的 C4 二羧酸完全来自于 CO2 固定反应, 体系也不可能完全不存在 CO2 固定反应, 因此, GA 发酵的糖酸转化率应在: 54.4%-81.7%。 乙醛酸循环 标志酶:异柠檬酸裂解酶 DCA 循环 作用:1。在谷氨酸发酵中,DCA 环一方面可以作为 TCA 循有缺陷时 C4 二羧酸的补充 2.在谷氨基酸生产菌的生长中提供能量 谷氨酸生成期中要封闭 DCA 环? 通过 DCA 环提供 C4 二羧酸时谷氨酸对糖的转化率仅为 54.4% 谷氨酸积累机理: 1)谷氨酸产生菌丧失或仅有微弱的 ?-酮戊二酸脱氢酶活力,使 ?-酮戊二酸不能继续氧化; 但谷氨酸脱氢酶活力很强,同时 NADPH2 再氧化能力弱,这样就使 ?-酮戊二酸到琥珀酸的 过程受阻;在有过量铵离子存在时, ? -酮戊二酸经氧化还原共轭的氨基化反应而生成谷氨 酸。 2)谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型,谷氨酸发酵时通过控制生物素亚适量,引起代谢失 调,使谷氨酸得以积累。3)生成的谷氨酸不形成蛋白质,而分泌泄漏于菌体外。 4)谷氨酸产生菌不利用菌体外的谷氨酸,而使谷氨酸成为最终产物。 但是,当环境条件发生变化时,菌体的生物代谢也会发生变化,谷氨酸发酵会向其他发酵 转换,谷氨酸积累减少,而其他副产物积累量增加。如:溶氧适中----产生谷氨酸,不足— 产乳酸,过量—产α -酮戊二酸;磷酸盐适中---产谷氨酸 过量----产缬氨酸 3、控制细胞膜的通透性 谷氨酸发酵的关键在于发酵培养期间谷氨酸生产菌细胞膜结构与功能上的特异性变化, 使细胞膜转变成谷氨酸就会在细胞内继续不断地被优先合成。 有利于谷氨酸向膜外渗透的样 式,即完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变。这样,由于终产物谷氨酸不断 地排出细胞外,使细胞内的谷氨酸不能积累到引起反馈调节的浓度, 控制细胞膜渗透性的方法: 1、化学控制法 通过控制发酵培养基中的化学成分,达到控制磷脂、细胞膜的形成或阻碍细胞壁正常的生 物合成, 使谷氨酸生产菌处于异常的生理状态, 以解除细胞对谷氨酸向胞外漏出的渗透障碍。

生物素缺陷型: 生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰 CoA 羧化酶的辅 酶,参与了脂肪酸的合成,进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右时, 细胞变形,谷氨酸向膜外漏出,积累于发酵液中。控制的关键:亚适量控制生物素 2)添加表面活性剂或饱和脂肪酸 作用机制: 在不饱和脂肪酸合成过程中作为抗代谢物对生物素有拮抗作用, 通过拮抗脂肪 酸的生物合成,导致磷脂合成不足,结果形成磷脂不足的细胞膜,提高细胞膜对谷氨酸的渗 透性。关键:必须控制好添加表面活性剂、饱和脂肪酸的时间与浓度 3)油酸缺陷型 作用机制:油酸缺陷型菌株丧失了自身合成油酸的能力,也即丧失脂肪酸合成能力,必须由 外界供给油酸才能生长;油酸含量的多少直接影响到磷脂合成量的多少和细胞膜的渗透性; 通过控制油酸,使磷脂合成量减少到正常量的一半左右时,细胞变形,谷氨酸分泌积累于发 酵液。关键:必须控制油酸的亚适量(细胞内生物素含量的多少影响甚微) 4)甘油缺陷型 甘油缺陷型不能合成 ?-磷酸甘油和磷脂,必须由外界供给甘油才能生长;在甘油限量供应 下,由于控制了细胞膜中与渗透性有直接关系的磷脂含量,使谷氨酸得以积累。 控制的关键: 必须控制添加亚适量的甘油或甘油衍生物 以上都是通过控制磷脂的合成,导致形成磷脂合成不足的不完全的细胞膜 5)添加青霉素法 在发酵对数生长期的早期添加青霉素抑制细胞壁的合成, 使细胞膜处于无保护状态, 又由于膜内外的渗透压差, 进而导致细胞膜的物理损伤, 增大了谷氨酸向胞外漏出的渗透性。 2、物理控制法 如利用温度敏感突变型(Ts) 突变发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜结构基因上 关键:在生长的什么阶段转换温度是影响产酸的关键 总结:谷氨酸积累的理想途径,应具备: (1)一定的糖酵解速度,不能走向乳酸等的发酵。 (2)生成丙酮酸后,一部分氧化脱羧生成乙酰 CoA,一部分固定 CO2 生成草酰乙酸或苹果 酸,草酰乙酸与乙酰 CoA 在柠檬酸合成酶作催化作用下,缩合成柠檬酸,再经下面的氧化 还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸。 (3)生成的乙酰 CoA 不向脂肪酸途径转化,全部趋于合成柠檬酸。 4)α -酮戊二酸氧化能力微弱,即不转化为琥珀酸,而成为马蹄形不完整的三羧酸环。 (5)异柠檬酸裂解酶活性弱,即不形成二羧酸环。 (6)异柠檬酸脱氢酶活性强。 (7)L-谷氨酸脱氢酶活性强,在 NH4 存在下,由α -酮戊二酸转化为谷氨酸。 (这点特别重 要) (8)NADPH 再氧化能力欠缺。谷氨酸菌有两种该类酶,即异柠檬酸脱氢酶和 L-谷氨酸 脱氢酶。 (9)造成强的细胞膜透性,以便克服终产物反馈抑制和阻遏,使生产菌产生的谷氨酸不断 地渗到细胞外进入培养基中。

第七章

抗生素的发酵机制

一. 微生物的次级代谢与初级代谢的关系 1.初级代谢产物,次级代谢产物的概念 初级代谢产物:是指微生物产生的、生长和繁殖所必需的物质。 次级代谢产物:是指由微生物产生的,与微生物生长和繁殖无关的一类物质 2.次级代谢产物的特征:

1)次级代谢产物是由微生物产生的,不参与微生物的生长和繁殖。 (2)次级代谢产物的生物合成与初级代谢产物合成无关的遗传物质有关。 (3)次级代谢产物发酵经历两个阶段,即营养增殖期(trophophase)和生产期(idiophase) 。 (4)一般都产生结构上相类似的多种副组分。 (5)生产能力受微量金属离子和磷酸盐等无机离子的影响。 (6)次级代谢酶的底物特异性在某种程度上是比较广泛的。 (7)培养温度过高或菌移植次数过多,会使抗生素的生产能力下降。 (8)次级代谢中与一个酶相对应的底物和产物也可以成为其他酶的底物。 (9)在多数情况下,增加前体是有效的。 生物合成抗生素与初级代谢的关系: (1)从菌体生化代谢方面分析 次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的 (2)从遗传代谢方面分析 次级代谢产物除与初级代谢产物一样受核内 DNA 的调剂控制外,还受到与初级代产物 合成无关的遗传物质的控制,即核内遗传物质和核外遗传物质的控制。 二、抗生素的生物合成类型 A. 蛋白质衍生物 B.糖类衍生物 C.以乙酸为单位的衍生物 4、抗生素生物合成的代谢调节方式 (1)、细胞生长期到抗生素产生期的过渡 次级代谢产物是在菌体生长到达相对静止期才产生。在细胞生长阶段,负责次级代谢产 物合成的酶受到阻遏。 A.诱导因子在生长期末积累或从外源加入; B.初级代谢的终点产物耗尽; C.易被利用的糖源分解代谢物被利用后,便解除了阻遏作用; D.高能化合物 ATP 形成减少后,阻遏作用也就解除; E.在生长期,RNA 聚合酶只能启动生长期基因的转录作用;当生长停止后,酶的结构改变, 允许 RNA 聚合酶启动生产期基因的转录作用,负责抗生素合成的酶开始生成。 (2)、酶的诱导作用 在抗生素合成期,参与次级代谢的有些酶是诱导酶。 需要底物或底物的结构类似物(外源和内源诱导剂) (3)、分解代谢产物的调节控制 碳、氮分解代谢产物(如葡萄糖)阻遏和抑制作用,抑制抗生素合成。解除分解产物阻遏的 方法: (1).选育对葡萄糖代谢产物类似物抗性突变型; (2)在培养过程中逃避分解产物阻遏. A.培养过程中利用缓慢的碳源,连续流加葡萄糖; B.使用能慢慢向培养基内渗透营养物质的颗粒。 (4) 、磷酸盐的调节 抗生素只有在磷酸盐含量控制在生长的“亚适量”时才能合成。 磷酸盐抑制抗生素合成的机制可能有以下二方面: A.抑制或阻遏抗生素生物合成途径中有关酶的活力和合成。 B.改变代谢途径。

C.磷酸盐可调节细胞内 ATP 的形成。 5) 、次级代谢产物的自身反馈调节 在多种次级代谢产物的发酵中都发现了末端产物的反馈调节作用。 产生菌抗生素的生产能力与自身抑制所需抗生素浓度呈正相关性。 因此要选育生产能力 强的抗反馈调节的突变菌株。 6). 初级代谢产物的调节 某些初级代谢产物可以调节次级代谢产物的合成的原因: A.有一条共同的合成途径,当初级代谢产物积累时,反馈抑制了某一步反应的进行,而最 终抑制了次级代谢产物的合成。 B.初级代谢产物直接参与次级代谢产物的生物合成,反馈抑制了它自身的合成时,必然也 同时影响了次级代谢产物的合成。 7).细胞膜透性的调节 细胞膜的运输影响胞内合成及代谢物分泌和发酵产物收获。 在青霉素发酵中,生产菌细胞膜输入硫化物能力的大小影响青霉素发酵单位的高低 8).次级代谢的能荷调节 A.能荷调节机制对次级代谢途径的控制是有效的。 B.金霉菌菌株的 ATP 含量在生长期中迅速增加,而在金霉素形成期 ATP 含量迅速下降, 并保持在较低的水平上。低产菌株的 ATP 量始终比高产茵株大 2—4 倍。 C.高浓度的磷酸盐可增加细胞内 ATP 的形成。 第八章 发酵过程动力学的基本概念 一.发酵动力学的研究内容 发酵动力学:是研究发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律。 研究内容:包括了解发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率的相互关系, 环境因素对三者的影响,以及影响其反应速度的条件。 研究发酵动力学的目的 (1)确定最佳发酵工艺条件 (2)建立发酵过程中菌体浓度、基质浓度、温度、pH、溶氧等工艺参数的控制方案 (3)可在此研究基础上进行优选。 一、菌体生长速率 比生长速率 dX ?x ? ? ?X t ?时间, ; h dt

? x ? 菌 体 生 长 速 率 , g /( L ? h ); ? ?
1 dX X dt X ? 微生物浓度

单位时间内单位菌体消耗基质或形成产物(菌体)的量称为比速,是生物反应中用于描述反 应速度的常用概念 比生长速率除受细胞自身遗传信息支配外,还受环境因素的影响。 1 dX 由? ? 可 知 , ? 与 倍 增 时 间 (doubling tim e) t d 的 关 系 为 : X dt ln 2 0.693          ? ? ? td td 以菌体得率系数为媒介,可确定基质的消耗速率与生长速率之间的关系。

基质的消耗速率

??S ?

?X
YX / S ?-

YX / S — 菌 体 得 率 系 数 , g / g

基质的比消耗速率

?=

?S
X

?
Y X /S

当基质既是能源又是碳源时: 碳源总消耗速率=用于生长的消耗速率+用于维持代谢的消耗速率
基质的消耗速率 ??S ? 1 YG

?X ? m ? X

m — 基 质 维 持 代 谢 系 数 , m ol /( g , 菌 体 ? h ) - ? S — 碳 源 总 消 耗 速 率 , m ol /( L ? h )

? X — 菌 体 生 长 速 率 , g /( L ? h )
Y G — 菌 体 生 长 得 率 系 数 , g / m ol 两 边 同 除 X ,则 , ?? ? 1 YG

??m

说明:菌体得率 定义:消耗单位基质量Δ S(每克或每摩尔)与生成的干菌体Δ X(g)之间的比值定义为菌 体得率(YX/S) 。[消耗 1g 基质生成细胞的克数]
YX ? ? ?X ?S    / g 或 g / mol ) (g

/S

通常,菌体 X 以干重表示;基质 S 是培养液中某一限制性底物。 三、代谢产物的生成速率
代谢产物的生成速率 代谢产物的比生长速率

?P
Q=

?P
c( X )

CO 2的 Q 值,常表示为

Q CO 2 CO 2 相对于氧的消耗。 ? Q CO 2 Q O2

呼吸商( RQ ):好氧微生物中 RQ = ? c ( CO 2 ) ? c (O 2 ) ?

? CO ?O
2

2

发酵过程反应速度的描述 X S(底物) ─→ X(菌体) + P(产物) 菌体的生长比速: ? ?
1 dX X dt

基质的消耗比速: v ? ?

1 dS X dt 1 dP X dt

产物的形成比速

Qp ?

第二节、生物反应模式 一、生物反应模式 根据产物生成速率与细胞生成速率的关系分类 根据产物生成速率与细胞生成速率的关系分类 (1)类型Ⅰ(偶联型模型) 产物的形成与细胞生长呈相关的过程。产物是细胞能量代谢的结果,此时产物通常是基质 的分解代谢产物。例如乙醇、乳酸发酵。 其动力学方程可表示为:
d[P] dt 式中 ? YP / X dX dt ? YP / X ? X 或 Q P ? YP / X ?

Y P /X — 系 以 菌 体 细 胞 量 为 基 准 的 产 物 生 成 系 数 , g / g ; [ P ] — 产 物 浓 度 , g / L; X — 菌 体 浓 度 , g / L; d[P] dt Q P — 产 物 形 成 的 比 速 率 , g 产 物 / ( g 细 胞 ? h) 。 — 产 物 生 成 速 率 , g /( L ? h );

(2)类型Ⅲ(非偶联型) 产物的形成与细胞生长不相关或无直接关系, 其特点是细胞生长期基本无产物合成, 细胞停 止生长产物则大量合成。属于这类的产物是次级代谢产物。例如青霉素、链霉素等抗生素发 酵。 其动力学方程可表示为:
d[P] dt ? ? X  或 QP ? ?

? 中 : ? — 非 生 长 偶 联 的 比 生 产 速 率 , g /( g 细 胞 ? h )。 式 (3)类型Ⅱ(混合型) 产物的形成与细胞生长部分相关或具有间接关系,例如柠檬酸、谷氨酸发酵等。 其动力学方程可表示为:
d[P] dt ?? dX dt ? ? X ? ?? X ? ? X 或 Q P= ? ? + ?

式 中 : ? — 与 生 长 偶 联 的 产 物 形 成 系 数 , g / g细 胞 ;

? — 非 生 长 偶 联 的 比 生 产 速 率 , g /( g 细 胞 ? h )。

说明:代谢产物收率 定义:生成的代谢产物量Δ P 对底物的消耗量Δ S(g)之比定义为代谢产物收率(YP/S) 。
YP / S ? ? ?P ?S    / g 或 mol / mol ) (g

假如完全没有菌体生成,则理论代谢产物收率可达到最大值。 第三节、微生物发酵动力学 ? 生物反应动力学是研究生物反应过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡 及其内在规律。 ? 研究内容包括发酵过程菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率的相互联系, 环境因素对三者的影响,以及影响其反应速率的条件。 ? 按微生物生长和方式分为分批培养,连续培养,补料分批培养三种类型. 2、微生物反应动力学 (一)生长速率: (二)细胞生长动力学 1.无抑制的细胞生长动力学 1942 年,Monod 提出了在特定温度、pH 值、营养物质类型、营养物浓度等条件下,微生 物细胞的比生长速率与限制性营养物的浓度之间存在着一个关系式。 Monod 方程 ? mc(S ) ? ?
K S ? c(S ) 式中: ? m — 微生物最大比生长速率 c ( S ) — 限制性营养物质浓度, K S — 饱和常数, mg / L 。 ,h ; g / L;
?1

单一限制性基质:就是指在培养微生物的营养物中,对微生物的生长起到限制作用的营养 物。 Monod 方程式适用于条件: 适用于单一基质限制及不存在抑制性物质的情况, 其他营养是过量的, 且没有抑制物的生成。 一.分批发酵法 (1) 停滞期 停滞期是微生物细胞适应新环境的过程。接种物的生理状态和浓度影响停滞期的长短。 d x ? 0 解决途径: dt ? 一是尽量选择处于指数生长期的种子。 ? 二是扩大接种量。但是,如果要扩大接种量,又往往需要多级扩大制种,这不仅增 加了发酵的复杂程度,又容易造成杂菌污染,故而应从多方面考虑。 (2)对数生长期:处于对数生长期的微生物细胞的生长速率大大加快,单位时间内细胞的数 ? ? ? max 目或质量的增加维持稳定,并达到最大值。 此时,如以细胞数目或生物质量的对数值对培养时图,将得一直线,该直线的斜率就等于μ 微生物的最大比生长速率在工业上的意义 为保证工业发酵的正常周期,要尽可能地使微生物的比生长速率接近其最大值。 最大比生长速率不仅与微生物本身的性质有关,也与所消耗的底物以及培养的方式有关。 限制微生物生长代谢的并不是发酵液中营养物质的浓度,而是营养物质进入细胞的速度。 (3)稳定期 在细胞生长代谢过程中, 培养基中的底物不断被消耗, 一些对微生物生长代谢有害的物质在 不断积累。受此影响,微生物的生长速率和比生长速率就会逐渐下降,直至完全停止,这时 就进入稳定期。 d x
?0 dt

X ? X m ax

由于细胞的自溶作用,一些新的营养物质,诸如细胞内的一些糖类、蛋白质等被释放出来, 又作为细胞的营养物质,从而使存活的细胞继续缓慢生长。 (二次或隐性生长) 微生物的很多代谢产物,尤其是次级代谢产物,是在进入稳定期后才大量合成和分泌的。 (4)死亡期:在死亡期,细胞的营养物质和能源储备已消耗殆尽,不能再维持细胞的生长和 代谢, 因而细胞开始死亡。 在发酵工业生产中. 在进入死亡期之前应及时将发酵液放罐处理。 2.分批发酵的优缺点 缺点:效率低, 尽管微生物的活性和机能因其所处的环境大幅度变化,也根本不控制培养 基组分浓度等环境因素,而任其自然变化,这样不利于生产。在每一批主反应(生产阶段) 之前,必须进行几级种子培养。 但由于操作相对较易,目前仍是发酵工业的主要方式 二、补料分批发酵法 定义:所谓分批补料培养技术,是指在分批培养过程中,间歇或连续的添加新鲜培养基的方 法。特点:与传统分批发酵相比,其优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。 低基质浓度的优点为:①可以除去快速利用碳源的阻遏效应,并维持适当的菌体浓度,使不 致于加剧供氧的矛盾。②避免培养基积累有毒代谢物。 分批补料培养特点 批补料培养技术是介于分批培养相连续培养之间的一种发酵技术。 由于在发酵过程中向发酵 罐中补加了物料, 分批补料系统不再是一个封闭的系统。 分批补料系统并不连续地向罐外放 出发酵液, 因而发酵罐内的培养基体积不再是个常数, 而是随时间和物料流速而变化的变量。 补料分批培养应用: 1)细胞的高密度培养 ◇ 一般培养基中的营养物质浓度有一定的限度,过高的底物浓度会抑制菌体的生长; ◇ 采用补料的方法将高浓度的营养物质逐渐加入反应器,可使发酵液中的菌体浓度达到很 高的程度,如大肠杆菌浓度可达 145g/L。 2)发生底物抑制的过程 一些微生物能利用甲醇、乙醇、乙酸、某些芳香族化合物等,但它们在较高浓度下会对菌 体的生产产生抑制。 ◇ 以某些很容易被微生物利用的物质(如葡萄糖)作为碳源时,其某些分解代谢物会使 细胞某些酶的合成受到阻遏; 3)分解代谢物的阻遏。 ◇ 采用补料的手段将葡萄糖逐渐加入反应器中,使发酵液中的葡萄糖保持在低水平,避 免分解代谢物的积累,从而可以有效去阻遏。 4)营养缺陷型菌株的培养 一些营养缺陷型菌株可以积累某种有用产物,如氨基酸、核苷、核苷酸等,利用这些菌株 进行生产时须补充其不能合成的物质供生产所需; 但这些物质过量存在时,可能产生反馈抑制或阻遏作用,影响产物的合成。 采用补料的方法可将这些物质保持在低浓度水平,有助于提高产物的生产。 5)前体的补充 ◇ 在一些发酵过程中,加入前体可使产物的生产大大增加; ◇ 但许多前体对菌体有毒性; ◇ 通过补料加入前体既满足产物合成的需要,又不使前体大量积累而产生抑制作用。 (一)补料分批培养的类型 1、按补料方式:连续流加、不连续流加、多周期流加 2、按流加速度:快速流加、恒速流加、指数流加、变速流加

3、按反应器发酵体积:变体积、恒体积 4、按反应器数目:单级、多级 5、按补加培养基成分:单一组分补料、多组分补料 6、按物料流入速率和流出速率来分 三)补料分批培养的动力学 1、单一补料分批培养 在开始时投入一定量的基础培养基,到发酵过程的适当时期,开始连续补加碳源和(或) 氮源或其它必须的基质,直到发酵液体积达到发酵罐最大工作容积后,停止补料,最后将发 酵液一次全部放出。 (1)特点:补料一直到培养液达到额定值为止,而且在培养过程中不取出培养液 (2)动力学 在某一瞬间培养液细胞浓度 X 可用下式表示: X=X0+YX/S(S0-S) 式中:X0------刚接种时培养液中细胞浓度 S0--培养基中限制性营养物的浓度 YX/S--细胞生长得率系数 2、重复补料分批培养 特点:是在培养过程中,每隔一段时间,取出一定体积的培养液,同时又在同一时间间隔内 加入相等体积的培养基,如此反复进行的培养方式。 动力学:培养液体积、稀释率、比生长率以及其它与代谢有关的参数都将发生周期性变化。 补料分批培养法适用范围: 补料分批发酵广泛应用于抗生素、氨基酸、酶蛋白、核苷酸、有机酸及高聚物等的生产。 补料分批培养的优点 与分批培养方式比较 与连续培养方式的比较

1、可以解除培养过程中的底物抑制和葡萄糖 1、不需要严格的无菌条件 的分解阻遏效应 2、不会产生微生物菌种的老化和变 2、对于好氧过程,可以避免在分批培养过程 异 中因一次性投糖过多造成的细胞大量生长、耗 3、最终产物浓度较高,有利于产物 氧过多以至通风搅拌设备不能匹配的状况;在 的分离 某种程度上可减少微生物细胞的生成量、提高 4、使用范围较广 目的产物的转化率。 3、微生物细胞可以被控制在一系列连续的过 滤态阶段,可用来控制细胞的质量;并且可重 复某个时期细胞培养的过渡态,可用于理论研 究

三 连续培养 一、基本概念 连续培养又称连续发酵,是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基,同时以相同的速 度流出培养液, 从而使发酵罐内的发酵液总量维持恒定, 使培养物在近似恒定状态下生长的 微生物培养方式。 特点:微生物细胞的生长速度、代谢活性处于恒定状态,达到稳定高速培养微生物或产生大

量代谢产物的目的。 二、连续培养的类型 (一)均匀混合的生物反应器二)活塞流反应器 三、连续培养的应用 目前,连续培养主要用于生产微生物细胞、一级代谢产物以及与能量产生和细胞增殖有关 的代谢产物,包括面包酵母、单细胞蛋白、 啤酒、 酒精、葡萄糖异构酶以及处理工业污水等。 四、连续培养的控制技术 连续发酵分类 开放式连续发酵系统 :单罐均匀混合连续发酵、多罐均匀混合连续发酵、管道非均匀混合 连续发酵、塔式非均匀混合连续发酵 封闭式连续发酵系统: 连续发酵优点: ①高效,它简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等许多单元操作,从而减少了非生产时间 和提高了设备的利用率; ②自控,便于利用各种仪表进行自动控制;③产品质量较稳定;④生长与代谢产物形成的两 种类型节约了大量动力、人力、水和蒸汽,且使水、汽、电的负荷均匀合理。 连续发酵缺点:菌种易于退化;其次是易遭杂菌污染;在连续培养中,营养物的利用率一般 亦低于单批培养。 第九章 发酵供氧 第一节 微生物的需氧和溶解氧的控制 一般发酵工业采取的供氧方式:通无菌空气,搅拌。 一般认为,在通风发酵中,微生物利用空气气泡中的氧的过程可分成两个阶段进行: 供氧:空气中的氧溶解在液体中; 耗氧:微生物利用液体中的溶解氧进行呼吸代谢活动 微生物不断消耗掉发酵液中的溶解氧, 同时通入的空气又不断地予以补气, 使整个过程达到 平衡。 一、供氧与微生物呼吸及代谢产物的关系 (一)氧的重要性 供氧对于需氧微生物是必不可少的, 这些微生物的生长发育合代谢活动都需要消耗氧气。 (1)氧是生物体生存的重要元素,既是细胞的组成成分和各种产物的构成元素,又是生物 能量代谢的必需元素。 (2)氧是好气性微生物氧化代谢的电子最终受体,转化为 H2O;同时通过氧化磷酸化反应 生成生物体生命活动过程中所需要的能量。 (二)Kd 与吸氧量 好气性深层发酵中微生物只能利用溶于培养液中的氧--即溶解氧(DO) ,DO 的多少一 般以溶解氧系数 Kd 值表示,单位为『molO2/L.min.MPa』 。 1、吸氧量(又称耗氧量) 微生物吸氧量常用呼吸强度和耗氧速率(又称摄氧率)来表示。 呼吸强度(QO2) :表示单位重量干菌体在单位时间内所吸收的氧量。 单位为『mmolO2/(g 干菌体.h) 』 耗氧速率(r) :表示单位体积培养液在单位时间内的吸氧量 单位为『mmolO2/(L.h) 』 关系:r= QO2X 式中 X--发酵液中菌体浓度(g/L) 三)、供氧大小对菌体生长及产物合成的影响

供氧大小对菌体生长及产物积累有很大影响。供氧过量或不足,都会影响产物的积累,而 且还可能导致微生物代谢途径的改变,影响产品质量。 如:谷氨酸发酵 发酵不同阶段对氧要求不同 长菌阶段:对溶氧要求低,要求 Kd 为(4.0~5.9)×10-6。供氧过量,在生物素限量情况 下,抑制菌体长大,表现为耗糖慢,PH 值偏高,且不易下降; 形成谷氨酸阶段:对溶氧要求较高,要求 Kd 为(1.5~1.8)×10-5;供氧不足,则造成乳 酸、琥珀酸的增多,谷氨酸产量下降;生产上表现为耗糖快,PH 值低,尿素消耗快,长菌 而不产谷氨酸。供氧过量,则不利于α -酮戊二酸进一步还原氨基化而积累谷氨酸。 当氧浓度低时,呼吸强度 QO2 随溶解氧浓度 CL 增加而增加; 当溶解氧浓度达某一值后, 增加而 QO2 不变, CL 此时的溶解氧浓度称为呼吸临界氧浓 度用 C 临界表示。它是维持微生物细胞进行正常呼吸所需的最低浓度。 三、氧在液体中的溶解特性 ◆ 难溶:25°C、一个大气压,空气中的 O2 在纯水中的溶解度仅 0.25mol/m3。发酵液中含 有各种成分,其溶解度更低。 ◆ 饱和浓度:气体和溶液接触一定时间后,气体分子在气-液二相中的浓度,就会达到动态 平衡,此时溶解到溶液中的气体分子数等于逸出溶液的气体分子数。若外界条件不变,气体 在溶液中的浓度就不再随时间而变化,此浓度为饱和浓度或 平衡浓度,用 C*表示。 影响饱和浓度值的因素 1)温度 随着温度升高,气体分子运动加快,使饱和浓度下降。 2) 溶液的性质溶质种类:气体在不同性质的溶液中的溶解度是不同的。溶质浓度:通常浓 度越高,溶解度越低 3)氧分压在系统总分压小于 5 个大气压的情况下,氧的溶解度与总压和其他气体的分压无 关,只与氧分压成直线相关,可用 Henry 定律表示: C* = PO2/H 四、影响微生物需氧量的因素 在需氧发酵中,影响微生物需氧的因素很多,归纳如下: (一)微生物的种类和生长阶段 1、 微生物种类不同, 其生理特性不同, 代谢活动的需氧量不同 一般为 25~100mmolO2/ (L.h) 2、同一菌种的不同生长阶段,其需氧量不同。 一般生长阶段的摄氧率>合成期的摄氧率 种子培养阶段总耗氧量<发酵阶段的总耗氧量 (二) 、培养基的组成 培养基的组成(成分和浓度)对产生菌的需氧量的影响是很显著的,特别是碳源。一般 C 源浓度增加,需氧量就增加。 (三) 、培养条件:与 PH、T 等有关。 一般,T ↑ ,营养愈丰富,QO2 ,C 临界 。 (四)CO2 的影响: CO2 是菌体代谢产生的气态终产物,在相同条件下,其溶解度为氧的 30 倍。如不能及时去除 CO2,就会影响菌体的呼吸,进而影响代谢活动 第二节 传 质 理 论 一、氧的传递途径与传递阻力 ◆ 在好氧发酵中,对微生物的供氧过程,首先是气相中的氧溶解在发酵液中,然后传递 到细胞内的呼吸酶位置上而被利用。 ◆ 这是一系列的传递过程,这些传递过程又可分为供氧及耗氧两个方面。 氧传递可分供氧和耗氧两个方面: 供氧方面 包括通过气膜、气-液界面、液膜及液体主流的扩散

耗氧方面 包括氧分子自液体主流通过液膜、菌丝丛、细胞膜及细胞内的扩散。 氧分子在一系列的扩散中,各步均有一推动力(氧的分压或浓度差)来克服各自的阻力。 1、供氧方面的阻力 1)气膜阻力( 1/k1 ) :为气体主流及气-液界面的气膜阻力,与空气情况有关。 2) 气液界面阻力(1/k2) :与空气情况有关,只有具备高能量的氧分子才能透到液相中去, 而其余的则返回气相。 3)液膜阻力(1/k3)为从气-液界面至液体主流间的液膜阻力,与发酵液的成分和浓度有关。 4)液流阻力(1/k4) :液体主流中传递的阻力;也与发酵液的成分和浓度有关。 2、耗氧方面的阻力 1)细胞周围液膜阻力(1/k5)与发酵液的成分和浓度有关。 2)菌丝丛或团内的扩散阻力(1/k6)与微生物的种类、生理特性状态有关,单细胞的细菌 和酵母菌不存在这种阻力;对于菌丝,这种阻力最为突出。 3)细胞膜的阻力(1/k7) :与微生物的生理特性有关。 4)细胞内反应阻力(1/k8)氧分子与细胞内呼吸酶系反 应时的阻力;与微生物的种类、生 理特性有关。 供氧方面 ◇ 由于氧很难溶于水,所以供氧方面的液膜阻力(1/k3 )是氧溶于水时的限制因素。 ◇ 良好的搅拌使气泡和液体充分混合而产生湍流,可减少 1/k3、1/k4,加速氧的传递。 耗氧方面 ◇ 实验表明,细胞壁上与液体主流中氧的浓度差很小,即 1/k5 很小;而菌丝丛(或菌丝 团)的阻力(1/k6)对菌丝体的摄氧能力影响显著。 ◇ 在耗氧方面的主要阻力是 1/k6、1/k7、1/k8。 ◇ 在搅拌和合理的 工艺条件下,结团现象减少,因而能降低 1/k6。 ◇ 1/k8 与微生物生长及代谢的条件有关,若生长条件合适,代谢产物能及时移去,则 1/k8 就会减少,否则就会增大。 第三节 影响氧传递速率的因素 根据气液传质方程式 N= KLa (C*-CL)看出,影响发酵过程中传递速率 N(或供氧)的 主要因素有推动力(C*-CL)和液相溶氧系数 KLa。若能改变这两个因素,则能改变 N,即 改变发酵罐的供氧能力。 (一) 、影响氧传递推动力的因素 若想 ↑(C*-CL) ↑ C*或 ↓ CL 提高 C*的方法 前面讲过影响 C*的因素有温度、 溶液的性质、 氧分压等, 即↑ C*, T ↓ 则 或营养物质含量↓ 或氧分压↑(即提高罐压或通入纯氧) 这几种方法的实施均有较大的局限性。 因为 1) 培养基的组成和发酵温度是根据菌种的特性和最适发酵条件而定的, 不可任意改动。 (2)提高罐压,增加设备负担,减少气泡体积,减少了气液接触面积,降低氧的溶解度, 增加有害气体溶解度。 (3)通入纯氧,能显著提高 C*,但该方法既不经济又不安全,同时易出现微生物氧中毒现 象;而且纯氧价格高且易燃易爆。 2、降低 CL 降低 CL 可通过减少空气流量等方法来达到,但 CL 不能<C 临界,否则会影响微生物的呼 吸。同时减少空气流量本身会使 KLa 。 (二) 、影响 KLa(液相体积溶氧系数)的因素 影响 KLa 的因素主要有搅拌、空气线速度(或空气流速) 、空气分布器的形成、

发酵液的理化性质、发酵罐的结构等。 1、搅拌 好气性发酵罐通常设有通风搅拌装置。 (1)搅拌的作用 搅拌的作用主要有以下几个方面: ①使发酵罐内温度和营养物质均一,使气、液、固三相系统充分混合; ②把大的空气气泡打成细泡,增加气-液接触面积,而且细泡上升比大泡慢,使气液接触时 间增长; ③使液体形成涡流,增加了气液接触时间; ④增加液体的湍流程度,从而 减少气泡周围的液膜厚度,减少液膜阻力,而且降低液流阻力,因而增大 KLa; ⑤减少菌丝结团现象,有利于增加固液接触面积,使推动力均一,同时减少菌体液膜厚度, 降低液膜阻力。 注意:过度强烈的搅拌不但浪费动力,而且其产生的剪切力作用会损伤菌体,引起菌体自溶 及减产等后果。 2)搅拌器的设计对 N 的影响 ①搅拌器的型 径向式:涡轮式,产生径向液流,气液 混合效果好。 特点:直径小,转速快,搅拌效率高, 功率高,功率消耗较低。 ②搅拌器相对位置 下组距罐底一般以(0.8~1)d 为好,不宜太远,否则造成局部缺氧; 上组与下组之间的距离太大或太小都会降低混合效果。 ③搅拌转速 n 和叶径 d n、d 对溶氧水平和混合程度有很大的影响。 当搅拌功率不变时,即 n3d5=常数 所以 d 升高,对液体混合均匀有利;提高 n,对增加溶氧水平有利。因此要根据具体情况 决定 n 和 d 一般①空气流量较小,动力消耗较小时,以 n 高,d 小为宜;动力消耗较大时,d 影响不大 ②空气流量大 动力消耗较小时,以 d 大,n 小为好;动力消耗较大时,以 d 小,n 大为好 ③粘度大,如非牛顿型发酵液,以采用大 d,低 n,多组搅拌为好; 粘度小,如牛顿型发酵液,以采用小 d,高 n,两组搅拌为好。 ④档板;档板能使液体形成某些轴向运动,因而提高了混合效果,改善氧的传递条件,特别 是低搅拌速度时更为显著 档板宽度为罐径的 1/12-1/10,与罐壁垂直,距罐壁 10~40mm, 略高于液面,下端接罐底。一般发酵罐可装 4 个档板。 ⑤搅拌组数对溶氧的影响: 搅拌组数对溶氧也有较大的影响, 确定装几组搅拌器要考虑到有 利于提高溶氧水平,又要保证混合均匀 5、发酵液的理化性质 (1)在发酵过程中,菌本身的繁殖及其代谢可引起发酵液物理性质的不断变化,如改变培 养液的表面张力、粘度和离子强度等,从而影响气泡的大小、稳定性和氧传递速率。 ①许多细菌、 酵母菌发酵时, 发酵液粘度 u 低时, 呈现牛顿流体性质对氧传递没有什么影响; ②霉菌和放线菌发酵液多数时间属于非牛顿型流体,u 较大,对氧的转移有较大影响。 通常发酵液浓度 ,粘度 u 时,则 KLa 2)发酵过程中流加糖、花生饼粉等营养物质、前体或无菌水、消泡剂等均可改变培养液的 理化性质,进而改善氧的传递速率 ①分批补料

如:有些抗生素采用“半连续发酵”,即发酵在一定时间后,放掉一部分发酵液,再补进 新鲜的培养液,这样既能增加每一罐批的总产量,又能降低发酵液的粘度 u,改善 KLa ②消泡剂:在发酵过程中,由于通气和搅拌会产生泡沫,其在粘稠的发酵液中是难以消除的, 直接影响微生物的呼吸。如:搅拌叶轮处于泡沫的包围之中,就会影响气液的充分混合, KLa;加入消泡剂,可消除气泡,改善气液混合效果,提高氧传递速率;但过多的消泡剂会 聚集在菌体细胞的表面,妨碍菌体对氧和营养物质的吸收。 第十章 发酵过程的控制 第一节 发酵过程的主要控制参数 微生物的发酵是在一定条件下进行的, 其内在代谢变化是通过各种检测装置测出的参数反映 出来的。近代的发酵设备,都是利用各种仪表甚至计算机来控制的。这样就可在严格的监视 下进行发酵,使产物的产量达到理想的程度。 与微生物发酵有关的 参数,可分为物理、化学、生物三类。 一、物理参数 1、温度 (对发酵是第一重要的) 温度的高低影响酶的反应,氧的溶解和传递速率,菌体 生长和产物合成等。 2、压力(Pa) 罐内维持正压,一般在 0.2-0.5×105Pa(比外界压力大 0.2-0.5 个大气压) 可防止外界空气中的杂菌侵入而避免污染,以保证纯种培养;同时还与 O2 和 CO2 的溶解 度有关。在一定压力下,有利于 O2、CO2 的溶解,但罐压不宜过大。 3、搅拌转率(r/min)其大小与 O2 传递速率和发酵液均匀性有关。 4、搅拌功率(kw) 搅拌器搅拌时所消耗的功率。它的大小与氧容量传递系数 KLa 有关 5、空气流量(v/(v.min) 需氧发酵的控制参数,指每分钟内每单位体积发酵液通人空气 ) 的体积。一般控制在 0.5~1.0 (v.min)范围内。 6、粘度(Pa.s) 其大小可作为细胞生长或细胞形态的一项标志,也能反映罐内菌丝分裂过 程的情况。其大小可改变氧传递的阻力。 7、浊度(%)反映单细胞生长状况的参数。一般细胞愈多,发酵液愈浑浊。 8、料液流量(L/min)控制流体进料的参数。 二、化学参数 1、pH(酸碱度)发酵工艺控制的重要参数之一,它的高低与菌体生长和产物合成有着重要 的关系。 2、基质浓度(g 或 mg%) 发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度。重要参数之一。 发酵过程中,必须定时测定糖(还原糖和总糖) 、氮(氨基氮或铵氮)等基质的浓度。 3、溶解氧浓度(ppm 或饱和度,%)了解产生菌对氧利用的规律,反映发酵的异常情况, 也可作为发酵中间控制的参数及设备供氧能力的指标。 4.氧化还原电位(mv)影响微生物生长及其生化活性的因素之一. 5.产物的浓度(ug(u)/ml) 决定发酵是否正常以及发酵周期长短的根据. 6.废气中的氧浓度(Pa) 与 r 和 k2a 有关 7.废气中的 CO2 浓度(%) 产生菌呼吸放出 CO2,因而从 CO2 浓度可了解产生菌的呼吸代谢 规律。 8.跟踪细胞生物活性的其它化学参数 如 NAD-NADH 体系等。 三、生物参数 1、菌丝形态 作为衡量种子质量,区分发酵阶段,控制发酵过程的代谢变化的代谢和决定发 酵周期的依据之一。 2、菌体浓度 控制微生物发酵的重要参数之一。 在生产上,常常根据菌体浓度阶段合适的补料量和供氧量以保证生产达到预期的水平。

第二节 温度的影响和控制 微生物的生长和产物合成都是在各种酶催化下进行的,温度是保证酶活性的重要条 件。因此在发酵过程中必须保证稳定而合适的温度环境 一、 发酵热:发酵过程中释放出的净热量。[ J / m3 · ] 或 单位体积的发酵液在单位时间 h 内释放出来的净热量。 Q 发酵 = Q 生物 + Q 搅拌 - Q 蒸发 - Q 显 – Q 辐射 1、生物热 (Q 生物) ◇ 产生菌在生长繁殖过程中本身会产生大量的热,此为生物热。 ◇ 这种热的主要来源是培养基中的碳水化合物、脂肪和蛋白质等的分解。 ◇ 释放出的能量部分用来合成高能化合物(ATP),部分用来合成产物,其余的则以热的形 式散发出来 生物热大小的影响因素: 1)随培养时间不同而不同(时间性) 发酵初期 菌数少,呼吸作用缓慢 ,Q 生物小 对数生长期 菌体较多,呼吸作用强烈 ,繁殖 盛 Q 生物大,温度升高快,此时生产上 必须控制温度。 发酵后期 停止繁殖,菌体衰老自溶, Q 生物小。 即发酵旺盛期的生物热大于其它时间的生物热。 ②随菌种和培养基成分不同而变化 一般同一菌株在同一条件下,培养基成分愈丰富,营养被利用的速度越快, Q 生物愈大。 ③与菌体呼吸强度有对应关系: Qo2 愈大, Q 生物愈大。 2、搅拌热 (Q 搅拌) 搅拌带动发酵液作机械运动,造成液体之间、液体和设备之间的摩擦,产生数量可观的热 搅拌热与搅拌轴功率有关,可用下式计算: Q = P × 3601(KJ / h) P --- 搅拌轴功率,kW 影响因素: 搅拌器的类型及搅拌速度 3、蒸发热 (Q 蒸发): 空气进入发酵罐后,就和发酵液广泛接触进行热交换,同时必然会 引起水分的蒸发,蒸发所需的热量即为蒸发热。 4、显热 (Q 显)排出气体所带的热 5、辐射热 (Q 辐射) :因罐内外的温度不同,发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。 辐射热的大小决定于罐内外的温差,温差愈大,Q 辐射愈多 总结:由于 Q 生物,Q 蒸发和 Q 显,特别是 Q 生物在发酵过程中是随时间变化的,因此 Q 发酵在整个发酵过程中也随时间变化, 引起发酵温度的波动。 为了使发酵维持在适当的温度 下进行,在整个发酵过程中要密切注意温度的变化,并加以控制。 发酵温度可以通过温度计或自动记录仪表进行检查; 通过在夹套或蛇形管中通入冷水, 热水 或蒸气加以调节。 在工业生产上,大发酵罐一般不需要加热,因发酵中释放大量的 Q 发酵,而需要冷却的情 况较多。对于南方气温较高,冷却水冷却效果差时,可采用冷冻盐水进行循环式降温,迅速 降至恒温。 三、温度对微生物生长的影响 在影响微生物生长繁殖的各种物理因素中,温度起着重要的作用。 1、温度直接影响酶反应和蛋白质性质,从而影响微生物的生命活动。 通常在生物学范围内,每升高 10℃,生长速度加快 1 倍。温度不但决定一种微生物的生长 旺盛与否,且决定其是否能生长发育。T>T 生长时,温度愈高,微生物死亡愈快;因为高

温使蛋白质变性或凝固,酶活性丧失,从而杀死微生物。 耐高温能力大小与微生物的种类和数量、 菌龄、 芽孢的有无、 湿度以及 pH 等有密切关系。 一般 有芽孢>无芽孢 湿度小>大 老龄>幼龄 微生物对低温的抵抗力一般比高温的强 抗低温的原因:低温抑制微生物的生长,但致死作用较差。因为微生物细胞体积小,其 细胞内不能形成冰结晶体,不能破坏细胞内的原生质,所以可利用低温保存菌种 2、最适的生长温度范围 各种微生物在一定条件下都有一个最适的生长温度范围,此范围内,微生物生长繁殖最快。 大多数微生物大多为中温菌,最适生长温度为 25~27℃; 种类不同或培养条件不同,生长最适温度也不同; 培育耐高温菌种有一定的意义,可较少污染增加机会和夏季培养所需的降温等辅助设备。 3、温度与微生物生长的关系 (1)最适生长温度范围内,温度升高,生长速率加快,生长周期缩短。 (2)不同生长阶段的微生物对温度的反应不同; 如:处于迟滞期(延滞期或缓慢期)的细胞对温度敏感; 置于生长最适温度附近,可缩短迟滞期; 低于最适温度,则延长迟滞期; 对于对数生长期的细菌,对温度适应性相对较强;所以在生长最适范围内提高对数 生长期的培养温度,既有利于菌体生长,又避免热作用的破坏。 四、温度对发酵的影响 1) 温度影响产物合成的速率及产量 ● 温度对发酵的影响是各种因素综合表现的结果 从酶动力学来看,温度升高,反应速率加大,代谢加快,生产期提前;但因酶本身很 易因热而失去活性,温度越高,酶的失活也越快,表现在菌体易于衰老,发酵周期缩短,影 响产物的最终产量。 ● 温度除了直接影响发酵过程中各种反应速率外,还通过改变发酵液的物理性质,间接影 响菌的生物合成。 例如: 温度会影响氧在发酵液中的溶氧和传递速率以及菌对某些营养成分 的分解吸收速度等。 2)温度可能会影响终产物的质量 例如:苏云金杆菌的发酵,一般在 30-31℃进行,这样形 成的晶体毒力强。若发酵温度提高到 37℃以上,虽然菌体生长繁殖较快,最终含菌数也较 高,但生物毒力较低,直接影响产品的质量。 3)温度还可能影响生物合成的方向 例如: 四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。 在低于 30℃下,该菌合成金霉素能力较强;温度提高,合成四环素的比例提高;在温度达 到 35℃时,则只产生四环素,金霉素的合成停止 4)影响酶系组成及酶的特性 例如:用米曲霉制曲时,温度控制在低限,有利于蛋白酶生 成,a-淀粉酶活性受到抑制。 五、最适温度的选择 最适温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物的形成。 对于不同的菌种和不同的培养条件以及不同的酶反应和不同的生长阶段, 最适温度应有所不 同. 在发酵的整个周期内仅选一个温度不一定好。 因为最适合菌生长的温度不一定适合产物的合成。 (1)最适温度的选择应考虑不同的发酵阶段 菌体生长(最适生长温度) ;产物合成(最适生产温度) 例如:青霉素产生菌的最适生长温度是 30℃,而最适于青霉素合成的温度是 20℃。 (2)温度的选择还要参考其它发酵条件灵活掌握

● 通气条件:在通气条件差的情况下,最适的发酵温度应比在正常良好通气条件下低 一些;这是由于在较低的温度下,氧溶解度相应大些,菌的生长速率相应小些,从而弥补可 能因通气不足而造成的代谢异常。 ● 培养基成分和浓度: 在使用较稀薄或较易利用的培养基时,提高培养温度则养料往 往过早耗竭,导致菌丝过早自溶,使代谢产物产量降低 实验证明, 在不同发酵阶段控制不同最适温度进行发酵, 则能更好的发挥微生物的生产潜力。 如四环素发酵: 前期 0~30h,以稍高温度促使菌丝迅速生长,尽可能缩短非生物合成所占用的发酵周期。 30~150h,以稍低温度尽可能维持较长的抗生素分泌期 150h 后,升温培养,以刺激抗生素的分泌 青霉素发酵: 开始 5h 维持在 30℃ →↓ 25℃, 培养 35h → ↓20 ℃ , 培养 85h→ ↑ 25 ℃ , 培养 40h → 放罐 采用这种变温培养,在这种条件下比 25 ℃恒温培养的青霉素产量提高 14.7% 第三节 PH 的影响及其控制 一、PH 对菌体生长和产物合成的影响 通常对发酵合适的 PH 范围在 4~8 之间,但不同种类的微生物对 PH 的要求不同。 如:大多数细菌的最适 PH 6.5~7.5 霉菌的最适 PH 4.0~5.8 酵母的最适 PH 3.8~6.8 放线菌的最适 PH 6.5~8.0 微生物的生长和产物合成的最适 PH 也不同 如: 生长最适 PH 产物合成最适 PH 丙酮丁醇菌 5.5~7.0 4.3~5.3 青霉素菌 6.5~7.2 6.2~6.8 链霉素产生菌 6.3~6.9 6.7~7.3 在发酵过程中,PH 值对菌体生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面: 1、PH 影响酶的活性。 当 PH 抑制菌体中某些酶的活性时,使菌体的新陈代谢受阻; 2、PH 影响微生物细胞膜所带电荷的状态,从而改变细胞膜的渗透性,影响微生物对营养物 质的吸收及代谢产物的泄漏; 3、PH 影响培养基中某些组分和中间代谢产物的离解,从而影响微生物对这些物质的利用 4、PH 不同,往往引起菌体代谢过程的不同,使代谢产物的质量和比例发生改变 例如:黑曲霉:PH2~3 时,发酵产生柠檬酸 PH 接近中性,发酵产生草酸 酵母: PH4.5~5.0,发酵产物主要是酒精 PH8.0,发酵产物不仅有酒精还有酸和甘油 谷氨酸产生菌: PH7.0~8.0,发酵产生谷氨酸 PH5.0~5.8,发酵谷酰胺和 N-乙酰谷酰胺 二、影响 PH 值变化的因素 1、发酵过程中 PH 的变化:发酵过程中由于菌在一定温度及通气条件下对培养基中碳源、 氮源等加以利用,随着有机酸或氨机酸的积累,会使 PH 产生一定的变化。 (1)生长阶段 PH 有上升或下降的趋势 (2)生产阶段 PH 趋于稳定,维持在最 适产物合成范围(PH7.0~7.5) (3)自溶阶段 随着基质的消耗,菌体蛋白酶的活跃,培养液中氨基氮上升,使 PH 上升

2、引起发酵液中 PH 变化的因素:取决于微生物的种类,培养基的组成和发酵条件 (1)引起发酵液中 PH 下降的因素 凡是导致酸性物质生成或释放,碱性物质的消耗都会引起发酵液的 PH 值下降。 ①培养基中 C/N 比例不当,碳源过多,特别是葡萄糖过量,或者中间补料过多加上溶解氧不足, 致使有机酸大量积累而 PH 下降; ②消泡油过量; ③生理酸性物质的存在,氨被利用,PH 下降. 如(NH4)2SO4,其中 NH4+被菌体利用后,残留的 SO42-就会引起发酵液 PH 下降 (2)引起发酵液中 PH 上升的因素 凡能造成碱性物质的生成或释放,酸性物质的利用将使发酵液的 PH 上升. ①培养基中 C/N 比例不当,氮源过多,氨基氮释放,PH 上升;②生理碱性物质存在,PH 上升 如 NaNO2 ③中间补料中氨水或尿素等碱性物质的加入过多使 PH 上升。 二 发酵 PH 的确定和控制 (2)PH 控制的方法 应根据具体的情况,选用适宜的方法调节控制 PH 值。 ①使发酵培养基的基础配方有适当的配比,特别是代谢产酸、产碱物质以及缓冲剂(如磷酸 盐 CaCO3 等)等成分的用量. ②直接补加酸(如 H2SO4)或碱(如 NaOH)来控制,现常用生理酸性物质(NH4)2SO4 和碱性物质氨水来控制。 氨水在发酵过程中常作为 PH 调节剂,同时它是容易利用的氮源,且其价格便宜,来源 容易;许多抗生素的生产工艺中都采用“通氨工艺”。 通氨工艺:一般使用压缩氨气或工业用氨水(浓度 20%左右) ;采用多次少量间歇添加或少 量自动流加,以防止一次加入过多造成局部偏碱。 ③通过中间补料的方法调节控制 PH 值 既调节培养液的 PH 值,有利于灭菌,又可补充营养,增加培养基的浓度和减少阻遏作 用,进一步提高发酵产物的产率。 (即可同时实现补充营养、延长发酵周期、调节 PH 和培 养液特性等几个目的) . 第四节 泡沫的控制 一、泡沫的性质:在大多数微生物发酵过程中,由于培养基中有蛋白质类表面活性剂存在, 在通气搅拌下,使发酵液产生一定数量的泡沫,这是正常现象。其中基质中的有机氮源(如 黄豆饼粉等)是起泡的主要因素。泡沫是气体被分散在少量液体中的胶体体系,泡沫之间被 一层液膜隔开,彼此不相通。 1、泡沫的类型 按发酵液的性质不同,泡沫一般有两种类型: (1)机械性泡沫:存在于发酵液的液面上,气相所占的比例特别大,与下面的液体之间有 明显的界限。一般由搅拌通气引起。在一些稀薄的种子液,前期发酵液中常见到 (2)发酵性泡沫:出现在粘稠的发酵液中,泡沫分散很细且均匀,比较稳定,泡沫与液体 无明显界限。其产生与菌种、培养基组分有关。 2、泡沫生成的原因 (1)由外界引进的气流被机械地分散而形成 (2)由发酵过程中产生的气体聚结而成 3、泡沫的优缺点 优点:少量泡沫,可增加气液接触面积,延长停留时间,导致氧传递速率增加,加速氧的溶 解,有利于微生物呼吸作用产生的 CO2 的逸出。 缺点 1) 降低发酵罐的装料系数 大多数罐的装料系数为 0.6~0.7, 余下的空间用于容纳泡

沫。 (2)增加了菌群的非均一性 不同生长周期的微生物随泡沫漂浮,或粘在罐壁,使附着 的菌体改变了环境,有的分化,有的瓦解,影响了菌群的整体效果。 (3)增加了污染杂菌的机会 发酵液随泡沫从排气管路或轴封出逃出,容易染菌。 (4)导致产物损失:大量起泡引起“逃液” (5) 加入消泡剂将给提取工序带来困难。 另外泡沫过多还会严重影响通气搅拌的正常进行, 影响氧的传递,妨碍菌的呼吸,结果造成代谢异常,导致产量下降或菌体提前自溶。 二、泡沫对发酵的影响 1)降低了发酵罐的装液系数 2)增加了菌群的非均一性 3)增加了污染杂菌的机会 4)导致产物的损失 2、影响泡沫的因素 1)与通气量、通气速度和搅拌速度等有关 2)与所用培养基的成分有关 3)与培养基的灭菌方法、灭菌温度和时间有关 四、泡沫的控制 一) 机械消泡 优点:不需引入外界物质(如消泡剂) ,可减少培养液性质复杂化程度,便于产物的提取。 缺点:不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素 二) 化学消泡 1、消泡机理 1)降低泡沫的机械强度,使泡沫破裂 当泡沫表层存在着由极性的表面活性物质形成的双电层时, 可以加入另一种具有相反电荷的 表面活性剂, 以降低泡沫的机械强度; 或加入某些具有强极性的物质与发泡剂争夺膜上的空 间,降低液膜强度,使泡沫破裂。 2)降低液膜的表面黏度,使液膜的液体流失,导致泡沫破裂 当泡沫的液膜具有较大的表面黏度时, 可以加入某些分子内聚力较小的物质, 以降低液膜黏 度 2、消泡剂选择的原则: ① 对发酵过程无毒,对人、畜无害,不影响生物合成。② 消泡作用迅速,效果高和持久性 能好。 能耐高压蒸汽灭菌而不变性, ③ 在灭菌温度下对设备无腐蚀性或不形成腐蚀性产物。 ④ 不影响以后的提炼过程。⑤ 不干扰分析系统,如溶解氧、pH 测定仪的探头。 ⑥ 消泡剂的来源多,价格低,添加装置简单。⑦ 最好还能做到不影响氧的传递。 5.化学消泡的优缺点: 优点:化学消泡剂来源广泛, 消泡效果好,不需改造现有设备,适用于大、小规模的发酵, 易实现自动控制等。 缺点:需加消泡剂,增加了原料的投入和染菌机会 第五节 补料控制 补料作用:产生菌的自溶期被推迟,生物合成期延长,可维持较高的产物增长幅度和增加发 酵的总体积,使产量大 幅度上升;作为纠正异常发酵的一个重要手段。 目前,大部分发酵品种如谷氨酸、赖氨酸、酶制剂、有机酸、抗生素等均采用补料措施。 一、补料的内容 补料--指在发酵过程中补充某些养料以维持菌的生理代谢活动和合成的需要。 大致可分为四个方面: (一)补充微生物能源和 C 源 如添加葡萄糖、液化淀粉、天然油脂等

(二)补充 N 源 如蛋白胨、豆饼粉、花生饼、玉米浆、酵母粉、尿素等有机 N 源,或采 用通氨工艺 (三)补充微量元素或无机盐 如磷酸盐、硫酸盐、氯化钴等 (四)对于产诱导酶的微生物,补充酶的作用底物,提高酶产量 如:α -淀粉酶 → 补充淀粉或麦芽糖 纤维素酶 → 补充纤维素 二、补料的原则 控制微生物的中间代谢,使之向着有利于产物积累的方向发展。 早期发酵生产:采用分批发酵,即一次投料发酵,到放罐结束。 菌体生长阶段: 具有丰富的 C、 源以及适合生长条件, N 则菌体 → 生成大量菌丝方向发展, 使养料主要耗在菌丝生长上。 生物合成阶段:养料不足,导致菌丝过早自溶,生物合成阶段缩短,发酵周期缩短,产量 下降。 采用补料工艺后,发酵周期延长。补加量:为基础料的 1~3 倍。 补料方式:连续流加、不连续流加、多周期流加,而每次流加又分为快速、恒速、变速、指 数速率流加等,体积有变体积、恒体积、补料的组分有单组分、多组分等。 (三)补料控制应注意的几个问题 1、料液配比要合适;过浓会影响消毒及料液的输送,过稀则料液体积增大. 2、加强无菌控制,对设备和操作须从严掌握; 3、考虑经济核算,节约粮食,注意培养基碳氮平衡等。 第六节 菌体浓度与基质对发酵的影响 一、菌体浓度对发酵的影响 菌体浓度--指单位体积中菌体的含量。 菌体浓度与菌体生长率直接相关, 而菌体生长速率与微生物的种类和自身的遗传特性有关: (1)取决于细胞结构的复杂程度和生长机制--随着物种等级的升高,细胞结构越复杂, 细胞增殖速率越慢; (2)与营养物质和环境条件有密切关系--营养物质丰富有利于细胞的生长,但也存在基 质抑制作用。 菌体浓度的大小对发酵产物得率会产生重要的影响: 1、初级代谢产物 产率与菌体浓度成正比。 2、 次级代谢产物 存在浓度范围, 当菌体浓度过高可能引起培养液中营养成分明显改变 和有毒物质积累,导致菌体代谢途径改变。 ●菌体浓度的控制: 1、控制培养基中营养物质的含量来控制菌体浓度。 (1)确定培养基中各种成分的配比; (2)采用中间补料的方式进行控制; 2、通过菌体代谢产生的 CO2 量来控制生产过程的补糖量,以控制菌体的生长和浓度。 二、基质对发酵的影响:基质--培养微生物的营养物质。 1、碳源对发酵的影响及控制 (1)容易利用碳源--能较迅速地参与代谢、合成菌体 和产生能量,并产生分解产物 对菌体生长有利 对产物的合成不利 (2)难利用碳源--菌体利用缓慢:有利于延长代谢产物的合成。 发酵培养基一般选用含有快速和慢速利用的混合碳源。 2、氮源的种类和浓度对发酵的影响及控制 分为无机氮源和有机氮源两大类。 (1)容易利用氮源--促进菌体生长,对代谢产物合成产生调节作用而影响产量。

(2)难利用氮源--可延长次级代谢产物的分泌期,提高产物的产量;一次性投入也容易 促进菌体生长和养分过早耗尽,导致菌体过早衰老而自溶,从而缩短产物的分泌期。 发酵培养基一般选用含有快速和慢速利用的混合氮源。生产上采用流加方法控制氮源: (1)补加有机氮源(2)补加无机氮源 3、磷酸盐浓度对发酵的影响及控制 微生物生长良好时所允许的磷酸盐浓度为 0.32~300mmol/L;次级代谢产物合成良好时所 允许最高平均浓度为 1.0mmol/L,提高到 10mmol/L 可明显抑制其合成。 第七节 染菌的防治 什么是染菌? 一、染菌的影响 发酵过程中除了生产菌以外,还有其它菌生长繁殖 发酵过程污染杂菌,会严重的影响生产,是发酵工业的致命伤。 造成大量原材料的浪费,在经济上造成巨大损失;扰乱生产秩序,破坏生产计划;遇到连 续染菌,特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性;影响产品外观及内 在质量。 (一)染菌对发酵的影响 生产不同的品种,可污染不同种类和性质的微生物。 不同污染时间,不同污染途径,污染不同菌量,不同培养基和培养条件又可产生不同后果 1、发酵染菌对不同品种的影响 放线菌由于生长的最适 pH 为 7 左右,因此染细菌为多,而霉菌生长 pH 为 5 左右,因此染 酵母菌为多。 青霉素发酵染菌, 绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶, 而另一些杂菌则可被青霉素诱导而 产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期,染有能产生青霉素酶的杂菌,都能使青霉素 迅速破坏。 链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得,但也会造成不 同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代谢;改变 pH,降低产量。 灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌,对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。 2、污染不同种类和性质的微生物的影响 (1)污染噬菌体 噬菌体的感染力很强,传播蔓延迅速,也较难防治,故危害极大。污染噬菌体后,可使 发酵产量大幅度下降,严重的造成断种,被迫停产 (2)污染其它杂菌 有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫,即使添加消泡剂也无法控制逃液,影响发酵 过程的通气搅拌。 有的杂菌会使发酵液发臭、发酸,致使 pH 下降,使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌, 由于芽孢耐热,不易杀死,往往一次染菌后会反复染菌。 3、不同时间染菌对发酵的影响 污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时间,不是杂菌窜入培养液的时间。 杂菌进入培养液后,需有足够的生长、繁殖的时间才能显现出来,显现的时间又与污染菌量 有关。污染的菌量多,显现染菌所需的时间就短,污染菌量少,显现染菌的时间就长。 (1)种子培养期染菌由于接种量较小,生产菌生长一开始不占优势,而且培养液中几乎没 有抗生素(产物)或只有很少抗生素(产物) 。因而它防御杂菌能力低,容易污染杂菌。如 在此阶段染菌,应将培养液全部废弃 (2)发酵前期染菌发酵前期最易染菌,且危害最大。

原因 发酵前期菌量不很多,与杂菌没有竞争优势;且还未合成产物(抗生素)或产生很 少,抵御杂菌能力弱。 在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。 染菌措施 可以用降低培养温度,调整补料量,用酸碱调 pH 值,缩短培养周期等措施予 以补救。如果前期染菌,且培养基养料消耗不多,可以重新灭菌,补加一些营养,重新接种 再用。 (3)发酵中期染菌 发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸,培养液 pH 下降;糖、氮消耗快, 发酵液发粘,菌丝自溶,产物分泌减少或停止,有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会 使发酵液发臭,产生大量泡沫。 措施 降温培养,减少补料,密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以 提前放罐,或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐,抑制杂菌。 (4)发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物,特别是抗生素,对杂菌有一定的 抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多,对生产影响不大。如果染菌严重,又破坏性较大,可 以提前放罐。 造成染菌的主要原因总结 1、设备渗漏 2、空气带菌 3、种子带菌 4、灭菌不彻底 5、技术管理不善 四、染菌情况分析 1、单罐染菌 不是系统问题,而是该罐本身的问题。如种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤 器失效 2、多罐染菌 系统问题,如空气过滤系统有问题,特别是总过滤器长期没有检查,可能受潮失效;移种或 补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底 3、前期染菌 种子带菌、培养基灭菌不彻底 4、中后期染菌 补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门渗漏,一般不会是种子问题 五、染菌的防止 1、防止种子带菌 制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制; 沙土制备时要多次间歇灭菌; 注意接种时的无菌 操作;子瓶、母瓶的移种和培养;无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要供给恒温恒湿 的无菌空气,还要装紫外灯用以灭菌,或用化学药品灭菌。 2、防止设备渗漏 发酵设备及附件由于化学腐蚀、 电化学腐蚀, 物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不 良等原因会导致设备及附件渗漏。 3、防止培养基灭菌不彻底 培养基灭菌方法——高压蒸汽灭菌 分批灭菌 1210C,30 分钟 连续灭菌 罐温 125-1300C,30-45 分钟 什么蒸汽灭菌时会产生大量泡沫呢? 培养基和水的传热系数比空气的传热系数大,如果灭菌时升温太快,培养基急剧膨胀,发酵 罐内的空气排出较慢,就会产生大量泡沫,泡沫上升到发酵罐顶,泡沫中的耐热菌就不能与 蒸汽直接接触,未被杀死。 防止方法: 缓慢开启蒸汽阀门,或加入少量消泡剂。 灭菌时还会因设备安装或污垢堆积造成一些“死角”。这些死角蒸汽不能有效达到,常会窝藏

耐热芽孢杆菌,所以设备安装要注意不能造成死角,发酵设备要经常清洗,铲除污垢。 4、防止空气引起的染菌 5、发酵染菌后的措施 染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。灭菌方法:可通蒸汽灭菌,也可加入过氧乙 酸等化学灭菌剂搅拌半小时, 才放下水道。 否则由于各罐的管道相通, 会造成其它罐的染菌, 而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。 凡染菌的罐要找染菌的原因, 对症下药, 该罐也要彻底清洗, 进行空罐消毒, 才可进罐。 染菌厉害时,车间环境要用石灰消毒,空气用甲醛熏蒸。特别,若染噬菌体,空气必须用甲 醛蒸汽消毒。 四、染噬菌体的防治 (一)染噬菌体对发酵的影响 发酵过程中如果受噬菌体的侵染,一般发生溶菌,随之出现发酵迟缓或停止,而且受噬菌体 感染后,往往会反复连续感染,使生产无法进行,甚至使种子全部丧失。 第八节 发酵终点的判断 要确定一个合理的放罐时间,须要考虑下列几个因素: 一、经济因素:发酵产物的生产能力是实际发酵时间和发酵准备时间(放罐、洗罐、装料、 灭菌等)的综合体现。 实际发酵时间要以最低的成本来获得最大生产能力的时间为发酵时间; 尽量缩短准备时间。 生产能力:是指单位时间内单位罐体积的产物积累量,g/(L.h)。 一般在产物合成速率较低 时放罐。 如继续延长时间,产物量 ↑→ 电力消耗 ↑ ,设备消耗等费用↑ 使产物成本↑ 二、产品质量因素 发酵时间长短对后续工艺和产品质量有很大的影响 时间较短(即放罐太早) ,营养残留物较多,对提取不利 时间太长,成本上升,菌体自溶,释放出菌体蛋白或体内的酶,增加提取工序的难度,使 过滤时间延长,甚至有些产品被破坏。 接近放罐时,补料要慎重;一般放罐前 16h,停止加糖、加油。 三、特殊因素 出现异常发酵现象时,要进行适当处理,并及时放罐。如染上杂菌、停电等。确定放罐的指 标有:产物的产量、过滤速度、氨基氮含量、菌丝形态、PH 值、发酵液的外观和粘度等。 发酵工艺的控制还包括菌体浓度的控制、基质的控制、CO2 控制等。

第十二章

发酵产物的提取与精制概论

一、下游加工过程在发酵工程中的地位 1.下游加工过程的定义:发酵产品系通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培 养获得。从上述发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程称为下游加工过程 (Down stream processing)。 2.地位 传统发酵工业(如抗生素、乙醇、柠檬酸),分离和精制部份占整个工厂投资费用的 60%。 对重组 DNA 发酵、精制蛋白质的费用可占整个生产费用的 80%~90%。 二、发酵产物的分类 1)菌体:主要以菌体细胞作为发酵产品,如单细胞蛋白、食用酵母、饲料酵母等。 2)酶:发酵产物为酶制剂,包括胞外酶和胞内酶 3)代谢产物:发酵产物为代谢产物,包括各种有机酸、有机溶剂、氨基酸、核苷酸类物质、 抗生素、多糖、维生素等。

三、微生物工程下游工程的一般程序 离心和过滤(发酵液的预处理和过滤)-----提取(萃取、吸附、沉淀)----精制(层析、膜分离、 离子交换、沉淀)----成品加工(结晶、干燥、蒸馏) 第二节、发酵液预处理和过滤 一、发酵醪的一般特性 1)发酵醪大部分是水,一般含量达 90%-99%2)发酵醪中发酵产物含量较低。 3)大多较黏稠 4)含有各种其他杂质(色素、热原质、毒性物质、无机盐、培养基成分、 其他代谢产物等) 二、发酵醪预处理的目的和要求 1、目的:改变发酵液的物理性质,加快悬浮液中固形物沉降的速度;尽可能使产物转入便 于以后处理的相中;能够除去部分杂质。 发酵液中杂质多且成分复杂,其中对纯化影响最大的是高价无机离子(Ca 2+、Mg 2+、Fe 3+ 等)和杂蛋白等 一、菌体的分离的方法 1)过滤:如:霉菌、放线菌 2)离心:如:细菌、酵母菌 过滤: 1)对于细胞体形较大的丝状菌,包括霉菌和放线菌的菌丝体分离,一般多采用过 滤方法。2)发酵醪属于非牛顿型液体,粘度大,过滤速度慢且劳动强度大。所以必须设法 提高发酵液的过滤速度。 杂蛋白的存在会降低离子交换树脂和大网格树脂的吸附量,如采用溶剂萃取,会发生乳化, 影响两相分离。此外,在常规过滤和膜过滤时,还会使滤速下降,使膜受到污染。 1) 沉淀法:调等电点 2)变性法 3)吸附法 重金属离子的去除 钙离子的去除:常用草酸 镁离子的去除:常用三聚磷酸钠 铁离子的去除:常用黄血盐 三、细胞破碎:目的代谢产物并非都是分泌型的,许多是存在于细胞内的,特别是基因工程 菌在细胞内形成的包含体是不分泌的,故需进行细胞破碎。 生命大分子的提取可分:胞内和胞外两种情况。 第十三章 发酵产物的提取与精制方法 发酵产物的提取与精制方法可分为三类: 1、产物的提取方法:萃取、吸附 2、产物的精制方法:离子交换、膜分离法、 层析法、浓缩法、沉淀 3、成品阶段:结晶、干燥、蒸馏 萃取 溶媒萃取的基本原理:溶剂萃取法是以分配定律为基础的。 四、影响溶媒萃取的主要因素: 1)乳化与去乳剂(乳化:液体分散在另一不相溶的液体中的分散体系) 常用去乳剂:阳离子表面活性剂(溴代十五烷基吡啶,PPB) 阴离子表面活性剂(十二烷 、 基硫酸钠,SDS) 2)PH 值 3)温度 4)盐析 5)带溶剂 五、溶媒的选择 1)选择萃取用的溶剂应考虑对产物有较大的溶解度和较好的选择性。 2)溶剂与被萃取液的互溶度要小,黏度低,界面张力适中,对相的分散和相的分离有利; 3)溶剂的化学稳定性高,回收和再生容易;

4)价格低廉,安全(如无毒) 常用:乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁醇 六、溶媒的回收:溶媒回收过程中必须注意安全! 吸附 原理:吸附法是利用吸附剂与杂质、色素物质、有毒物质、产品之间分子引力的差异,从而 起到分离的作用。 二、吸附法的优缺点 优点:1)可不用或少用有机溶剂;2)操作简便、安全、设备简单;3)生产过程中 pH 变化小,适用于稳定性较差的生化物质。 缺点:1)吸附法选择性差、收率不高。2)无机吸附剂性能不稳定,不能连续操作,劳动 强度大。3)炭粉等吸附剂影响环境卫生 离子交换法 一、 离子交换的原理: 离子交换树脂是具有一定空隙度, 有酸性或碱性功能的高分子化合物, 因而能交换阴、阳离子。而大多数有活性的发酵产物都具有酸性或碱性功能团,在溶液中能 以离子状态存在,并能与树脂的活性功能团交换。 二、基本理论:1)物理吸附 2)晶格理论 3)双电层理论 4)膜理论 四、离子交换剂的分类 1.阳离子交换剂 1)强酸型:含有磺酸基团(-SO3H) 2)中强酸型:含有磷酸基( -PO3H2 ) 、亚磷酸基(-HPO2H) 3)弱酸型:含有羧基(-COOH)及酚羟基(-OH) 2.阴离子交换剂 1)强碱性:含有季铵盐( -N(CH3)2 ) 2)弱碱性:叔胺(-N(CH3)2) 、仲胺(-NHCH3) 、伯胺(-NH2) 3.树脂的保存:使用过的交换树脂必须用水充分洗涤干净,以中性的盐型保存。 膜分离法 ? 1.透析 2.超滤(UF)和微滤(MF)3.反渗透 4、电渗析 5、渗透气化 6、液膜分离技 术层析法


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