当前位置:首页 >> 医学 >>

04-4.RNA干扰


RNA 干涉

近年来的研究表明,一些小的双链 RNA 可以高效、特异的阻断体内特定基因表达,促使 一些小的双链 可以高效、特异的阻断体内特定基因表达, 降解, 诱使细胞表现出特定基因缺失的表型, 干扰( interference, mRNA 降解 , 诱使细胞表现出特定基因缺失的表型 , 称为 RNA 干扰 ( RNA interference , RNAi, 干预或者干涉) RNAi,也译作 RNA 干预或者干涉)。它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。由于可 以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具,可以毫不夸张的说,RNAi 正在功能基因 组学领域掀起一场真正的革命,并将彻底改变这个领域的研究步伐。为此被 Science 评为 2001 年最重要的的成果之一。

RNA 干涉的作用机理
在植物中,基因沉默发生于转录和转录后两种水平,而动物中迄今仅报道了转录后水平 的 RNAi。 目前认为 RNAi 至少包括两步 RNA 降解过程。 第一步,dsRNA 降解形成特征性的与靶基因同源的 22 个核苷酸的 RNA; 第二步,这些短核苷酸序列参与形成多亚基复合物,并引导复合物中的核酶降解特异性 的信使 RNA。

RNA 干涉的作用特点
1.特异性抑制目的基因。 针对某些特定的内源基因的 dsRNA 转入动物体内或胚胎内, 特异性抑制目的基因 能特异性抑制该基因的功能。而单链正义或反义 RNA 的抑制 作用较弱或缺失。 广泛分布且可遗传。 2.广泛分布且可遗传。 DsRNA 分子能够在线虫体内被有效转运至全身各处,用经小 肠微注射或浸润喂食线虫的方法都能得到各组织中对靶基因 的抑制,在体细胞和生殖细胞中能检测到 RNA 的表达,并且 其子代也产生了对相应继因强烈而特异的抑制效应。但这种 遗传只限于子一代,子二代往往又回复到野生型。 3.靶序列的选择性。 靶序列的选择性。 RNAi 的靶序列需要慎重选择,实验证明,外显子序列的

1

dsRNA 能产生特异和高效的基因抑制作用,而只针对内含子 序列的 dsRNA 不能产生这种作用。 dsRNA 的长度对 RNAi 的效率有影响,但最短的有效长度目前 还不清楚,一般认为应大于 500bp。 选择靶序列时应避免高度同源序列之间的交叉干扰。例如对 线虫的体壁肌球蛋白重链的编码区基因进行 RNAi 实验,当 选择其 5’端高度保守区作为靶序列进行 dsRNA 注射时产生 致死表型,而选择其他部分进行实验则产生预期的瘫痪表 型。

RNA 干涉的导入方式
1.电转化。 电转化。 2.微注射。 微注射。 简单生物常用电转化方式导入 dsRNA. 多细胞真核生物的生殖细胞或早期胚胎,可采用微注射的方式

的溶液中。 3.喂食表达 dsRNA 的细菌或浸浴到含 dsRNA 的溶液中。 线虫 喂食表达

RNA 干涉的应用

2

RNAi 的回顾
前言 转录后基因沉默(Postsilencing,PTGS) 转录后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing,PTGS),原来曾经一度被认 为是矮牵牛和少数几种植物的特殊现象,如今已成为分子生物学领域最热门的研究课题之一 了(1)。在过去的几年中,研究表明这种现象在植物和动物中都会发生,并且参与抵抗病毒感 染、转座子沉默机制(transposon silencing mechanisms)等过程。其中最引人注意的,就 干扰(RNA interference,RNAi,也有译作 RNA 干预或者干涉)——引入双链 RNA 是 RNA 干扰 (dsRNA), 通过特异性结合互补链从而抑制基因的表达,或者说是通过双链 RNA 引发转录 后沉默,从而作为一种抑制细胞中某个基因表达的有力工具。(reviewed in 1-3). RNAi 是如何被发现的?以怎样一种机制工作?更重要的是如何利用这项强大的技术进行 功能基因组的研究?本文将概要的介绍并将提供大家一些相关的资料。 20 多年前,在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发现:Rich Jorgensen 和 同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜 色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen 将将这种现 象命名为协同抑制“cosuppression”,因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。 (1-5). 开始这被认为是矮牵牛的特有的怪现象,后来发现在其他许多植物中,甚至在真菌中也 有 类 似 的 现 象 , 特 别 是 在 脉 孢 霉 Neurospora 中 进 行 了 详 细 的 研 究 ( 在 这 里 被 称 为 “quelling”)(1-3)。 然而是什么原因导致这种基因沉默的现象呢?尽管对于部分植物来说,转基因引发的基 因沉默可能是因为基因特异的甲基化而导致,这被称为转录阶段基因沉默(transcriptional gene silencing, or TGS),但是,确实有部分的植物中的基因沉默是在转录后发生的,称 为 post-transcriptional gene silencing, or PTGS ) 。 实 验 ( Nuclear run-on

3

experiments)表明同源转录本确实有出现,但是很快在胞浆中被降解,没有积聚(1, 3, 6)。 转基因会引发 PTGS,然而 silencing 也可能被一些病毒诱发(2, 3)。一旦被引发, PTGS 由一种可扩散的反式作用分子介导。这首先在脉孢霉 Neurospora 中得到证实:Cogoni 和他的同事发现基因沉默可以在异核体的细胞核之间传递(1, 7)。后来 Palauqui 和同事进 一步证实,在植物中,将出现转基因导致基因沉默的植物嫁接到另一没有基因沉默的植物 中,同样可以导致 PTGS。在后来线虫和果蝇的实验中我们知道导致植物中的 PTGS 的反式作 用因子是双链 RNA(1-3)

是在线虫中发现的 RNAi 是在线虫中发现的 首次发现 dsRNA 能够导致基因沉默的线索来源于线虫 Caenorhabditis elegans 的研究。 7 年前(1995)康乃尔大学的研究人员 Guo 和 Kemphues 尝试用反义 RNA 去阻断 par-1 基因 的表达以探讨该基因的功能,结果反义 RNA 的确能够阻断 par-1 基因的表达,但是奇怪的 是,注入正义链 RNA 作为对照,也同样阻断了基因的表达(9)。 这个奇怪的现象直到 3 年后才被解开——华盛顿卡耐基研究院的 Andrew Fire 和马萨诸 塞大学癌症中心的 Craig Mello 首次将 dsRNA——正义链和反义链的混合物注入线虫,结果 表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因 Silencing。实际上每个细胞只要很 少几个分子的 dsRNA 已经足够完全阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫消化道中注 入双链 RNA 不但可以阻断整个线虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉 默。他们将这种现象称为 RNA 干扰(RNA interference,简称 RNAi,10) RNAi 潜在的作用促使 Fire 和 Timmons 继续实验,将能够表达与 C. elegans unc-22 基 因同源的 dsRNA 的细菌喂食线虫,结果线虫表现出类似 unc-22 缺陷的表型(11—13)。后 继的实验表明将线虫浸入 dsRNA 中同样可以诱导基因沉默——这种技术使得大规模筛选线虫 RNAi 诱导的功能缺失突变体成为可能,并引发后继的大量针对这种模式生物基因敲除的研 究。

果蝇中的 RNAi 在果蝇的研究中同样发现 RNAi。尽管采用能生产 dsRNA 的酵母喂食果蝇的实验失败告 终,但是通过显微注射或者通过基因枪将 dsRNA 注入果蝇胚胎中、或者将带有反向重复序列 的 DNA 导入果蝇中能够引发基因沉默。在过去的几年中 RNAi 技术在果蝇的研究中成为一种反 向遗传工具,用于鉴定功能缺失表型。(19—23)
4

注射的 RNAi 如何引发基因沉默?在过去的数年中多个研究小组进行了不懈的努力。 Baulcombe 和 Hamilton 首先在发生协同抑制的植物中鉴定了一些在没有发生基因沉默的植物 中并不存在的大约 25 个碱基大小的 RNA,这些 RNA 分别与沉默基因的正义和反义链互补 (24)。这成为揭示 RNAi 秘密的第一条关键线索。 后来在果蝇细胞中的实验进一步揭示这个秘密(3, 25, 26)。在一系列著名的实验中, Zamore 和同事发现注入果蝇细胞的 dsRNA 被切割为 21—23 碱基长短的 RNA 片段,他们同时 发现:与 dsRNA 同源的内源基因的 mRNA,只在和 dsRNA 对应的部位被切割成为 21—23 核苷 酸长的片断(26)。很快,RNAi 的机制越来越清楚了。

机制的模型 现有的 RNAi 机制的模型 通过生化和遗传学研究,产生了现有的 RNAi 作用机制模型,包括起始阶段和效应阶段 (initiation and effector steps , 27, 点 击 看 看 Flash 演 示 动 画 "How Does RNAi Work?")。在起始步骤,加入的 dsRNA 被切割为 21-23 核苷酸长的小分子干扰 RNA 片段 ( small interfering RNAs , siRNAs , 又 被 称 为 引 导 RNAs : “ guide RNAs ” 3, 18, 27 ),证据表明:一个称为 Dicer 的酶,是 RNaseIII 家族中特异识别双链 RNA 的一员,能 以一种 ATP 依赖的方式逐步(processive)切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种 方式引入的双链 RNA,切割将 RNA 降解为 19—21bp 的双链 RNAs(siRNAs),每个片断的 3' 端都有 2 个碱基突出(27, 28)。 在 RNAi 效应阶段,siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓 RNA 诱导沉默复合物 (RNA-induced silencing complex, or RISC)。激活 RISC 需要一个 ATP 依赖的将 siRNA 解 双链的过程。激活的 RISC 通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录本上,并在距离 siRNA3'端 12 个碱基的位置切割 mRNA(3, 18, 27, 29)。尽管切割的精确机制现在还是未知,研究表明每 个 RISC 都包含一个 siRNA 和一个不同于 Dicer 的 RNA 酶。 由于在一些生物中 RNAi 的影响格外显著,有人提出在 RNAi 途径中可能存在某个(信 号)扩增的步骤。这种扩增可能是复制外源注入的 dsRNA 从而产生更多的 siRNA,也可能是 直接扩增 siRNA 本身(参见下一段文字)。这种扩增可能在 RNA 诱导沉默复合物(RISC)形成 过程进行,作为 RISC 形成的补充,或者独立于 RISC(3, 18, 27)。

RNA 依赖的 RNA 聚合酶的潜在作用 对脉胞菌、线虫和拟南芥的基因筛查过程中鉴定了几个显然对转录后基因沉默(PTGS) 和 RNAi 过程起关键作用的基因。其中包括 Neurospora qde-1, Arabidopsis SDE-1/SGS-2
5

和 C. elegans ego-1 在内的几个基因,都是编码 RNA 依赖的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerases,RdRPs)的。初步的结论,很可能就会推断这是“RNA 依赖的 RNA 聚合酶活 性是 RNAi 所必须的”证据。当然,如果真的存在聚合酶扩增 dsRNA 或者 siRNA 这一步的话, RNA 依赖的 RNA 聚合酶的存在就有助于解释何以 dsRNA 诱导基因沉默有如此强大作用。但是 这些基因的突变体有不同的表型,这使得在 RNAi 过程中 RNA 依赖的 RNA 聚合酶的作用难以确 定(1, 3, 17, 18)。 线虫 C. elegans ego-1(ego 代表 "enhancer of glp-1")突变体中,RNAi 在肌肉细胞中 正常出现,但在生殖系细胞中,也就是 ego-1 主要表达的地方,RNAi 没有发生。在拟南芥 Arabidopsis SDE-1/SGS-2("SGS" 代表 suppressor of gene silencing)突变体中,通过内 源复制的 RNA 病毒引入 dsRNA 可以产生 siRNA,但是通过转基因引入的 dsRNA 则不会产生 siRNA。有人推断说可能是病毒本身的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶(RdRP)取代了拟南芥突变体中 的这些酶(1, 3, 17, 18)。虽然在果蝇和人类体内还未发现 RdRP 的类似物,近来的一篇文章 报道了在果蝇胚胎细胞中发现 RdRP 活性(30)。一种称为随机降解 PCR“random degradative PCR” 的模型认为:RdRP 以 siRNA 为引物扩增模版 mRNA,产生 dsRNA 底物提供给 Dicer 酶, 结果产生更多的 siRNA。在线虫的实验中找到了支持这种模型的证据(27, 30),但是同样在 果蝇胚胎细胞的实验结果则反驳了这种理论模型(26, 27)。

RNAi 的起始 两个线虫基因, rde-1 和 rde-4 (“rde”代表 “RNAi deficient”)据信是参与 RNAi 的起始步骤。这些基因的突变体线虫即使注入 dsRNA 也不会出现基因沉默,但是如果没有沉 默缺陷的杂和亲代将 siRNA 传递到这种突变体中则会引发基因沉默。线虫 rde-1 基因属于一 个大的基因家族,和脉胞菌 qde-2 (“qde” 代表 "quelling deficient") 、拟南芥 ago1 基因(“ago” 代表 “argonaute”,早前被鉴定参与拟南芥的发育)同源,尽管这些基因 在转录后基因沉默(PTGS)中的作用不明,RDE-1 家族在哺乳动物中的一个成员已经被证实 是一个翻译起始因子。有趣的是拟南芥中的 AGO1 突变体表现为协同抑制缺陷的同时也表现为 叶发育缺陷。所以,PTGS 相关的一些酶或者过程可能参与发育过程(1, 3, 17, 18)。

RNAi 的效应物 转录后基因沉默(PTGS)的效应步骤的重要基因包括线虫 rde-2 和 mut-7 基因。这些基 因首先是在一种杂和突变体线虫中发现的,这种杂和突变体不能将 RNAi 传递给他们的纯和子 代。有这两个基因突变的线虫表现为 RNAi 缺陷,但是引人注意的是他们同时表现出转座子活
6

性提高。因此保持转座子沉默的某种机制看来与 RNAi 和 PTGS 相关。尽管 rde-2 基因产物还 未经识别, mut-7 编码的蛋白有着和 RNase D 的核酸酶结构域同源的区域,以及一个人类 Werner 综合症(一种快速老化的疾病)中出现的蛋白的同源区域(1, 3, 17, 18, 31)。这个 蛋白有可能是降解靶 RNA 所需要的核酸酶。

PTGS 有着古老的根源 从遗传和生化的角度分别进行的研究同样指出转录后基因沉默(PTGS)可能在生命进化 的早期就存在。有人提出转录后基因沉默可能是进化过程中一种抵御转座子或 RNA 病毒的防 御机制,可能在植物和动物分化之前就已经出现(1, 3, 17, 18)。 有趣的是,许多研究人员都注意到:破坏 RNAi 相关的基因通常导致严重的发育缺陷,这 个发现提示 RNAi 与至少一个发育过程有着某种联系。 一组小分子 RNA,就是 small temporal RNAs (stRNAs),可以通过对特定目标转录本的翻 译抑制来调控线虫的发育时钟,研究结果表明:线虫 lin-4 和 let-7 stRNAs 是由那些大约 70 个碱基的转录产物折叠成茎环节构后形成的。折叠的 RNA 分子被 Dicer 酶(在线虫中称为 DCR-1)切割成为 22 个碱基的 stRNAs,Dicer 酶可以产生 siRNAs 和 stRNAs,表明 RNAi 和 stRNA 途径有一个交叉点(32-34)。 最近,在果蝇、线虫和 Hela 细胞中有大约 100 个新的大约 22 个碱基的小分子 RNA—— microRNAs (miRNAs)被鉴定出来(35-38),就像 lin-4 和 let-7,这些 miRNAs 是在 RNA 前体 分子折叠成茎环二级结构后形成的,这些新发现的大约 22 个碱基大小的 miRNAs 被认为是在 基因表达调控过程中起某种作用。其中至少有两个的产生已知需要 Dicer 酶参与(37)。显 然,在进化的过程中,利用小分子 RNA 调控基因表达和 RNAi 有共通之处。

由长 dsRNA 引起的非特异基因沉默 在各种生物中(植物、原生动物、昆虫、线虫)中陆续发现了自然存在的 RNAi 现象,哺 乳动物细胞中存在 RNAi 的证据则费了一番功夫才找到。将较长的双链 RNA(超过 30 个碱基对) 转染哺乳动物细胞会引起非特异的基因表达抑制,这和在其他生物中的特异抑制不同,这种 抑制可能由于一种抗病毒应答反应,是通过以下两种途径之一进行的。 其中一条途径,长的 dsRNA 激活蛋白激酶 PKR,激活的 PKR 通过一系列的磷酸化使翻译 起始因子 eIF2a 失活,导致翻译抑制(39)。在另外一个途径中,长 dsRNAs 激活 RNase L,导 致非特异的 RNA 降解(40)。

7

多个研究小组证实在小鼠胚胎干细胞和至少一个胚胎来源的细胞株中没有 dsRNA 介导抗病 毒应答(41, 42)。因此可能用长 dsRNAs 在这些特定的细胞中诱导特定的基因沉默。然而抗病 毒应答使得我们无法在多数其他哺乳动物细胞中用长 dsRNAs 诱导 RNAi。

siRNA 克服了抗病毒应答的障碍 有趣的是不超过 30 个碱基的双链 RNAs 并不会激活 PKR 激酶途径。这个发现,再加上已 知在线虫和果蝇中长 dsRNAs 会被切割成 siRNAs、而 siRNAs 会诱导 RNAi,促使研究人员研究 用 siRNAs 是否能诱导哺乳动物细胞的特定的基因沉默(43)。的确,通过瞬时转染导入的 siRNAs 能够以序列专一的方式有效诱发培养的哺乳动物细胞的 RNAi。siRNAs 的效率各有区 别——最有效的 siRNAs 能使靶 RNA 和蛋白水平降低 90%以上(44-46)。最有效的 siRNAs 是 21 个碱基大小、3'端有两个碱基突出的双链 RNA。siRNA 的序列专一性要求非常严谨,与靶 mRNA 之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果(44, 47)。不过,并非所有符合条件的 siRNA 都一样有效,其原因还不清楚,可能是位置效应 (positional effects46, 48, 49)的 结果,设计 siRNA 可以参考 “siRNA Design”。 尽管 RNAi 和 PTGS 的历史和机制都很吸引人,但是大多数研究人员最感兴趣的是 RNAi 可 以作为功能基因组研究领域中的有力工具。现在,在果蝇、线虫和一系列植物的研究中, RNAi 技术已经广泛应用于探讨许多基因功能的研究中。由于已知通过转染 siRNAs 可以在哺 乳动物细胞中诱发 RNAi,更多的研究人员开始用 RNAi 作为一种工具研究人类、小鼠和其他 哺乳动物的细胞。 在较早的哺乳动物 RNAi 实验中,siRNAs 是通过化学方法合成的,现在有多家公司提供通 过体外转录的方法合成 siRNA 的试剂盒,比如 Ambion 的 Silencer? siRNA Construction Kit,NEB 公司的 HiScribe? RNAi Transcription Kit 等等(后文介绍)。体外转录制备 siRNA 是比较经济的方法,特别是有多个 siRNAs 需要合成的时候,通过瞬时转染可以将这些 siRNAs 转入细胞内,由于不同的 siRNAs 效果不同,根据一个靶基因研究人员通常需要设计 3—4 个不同的 siRNAs 进行试点实验以确定最有效的一个(44-46, 48, 49)。 到目前为止,注射和转染 dsRNA 到细胞或者生物体内是运送 siRNAs 的主要方式。虽然基 因沉默效应可以持续好几天,也确实有例子可以传给子代细胞,但最后还是会消失的。最 近,有几个研究小组开发一种表达载体,能够在瞬时转染和稳定转染的哺乳动物细胞中持续 表达 siRNAs(50-56),一些载体经过设计可以表达 small hairpin RNAs (shRNAs),在体内加 工后形成类似 siRNAs 的分子,能够引发基因沉默。载体的 pol III 启动子( polymerase III) 和一个有 4—5 个 T 的转录终止位点之间插入 shRNA 序列,转录产物在转录终止位点的第二个
8

碱基处终止,(pol III 转录产物是没有 poly(A)尾巴的),然后折叠成茎环结构(3'末端有 两个 U 的突出端),最后 shRNAs 在体内被加工处理,成为大约 21 个碱基大小的类似 siRNA 的分子,随后起始 RNAi 过程(50)。这个发现和最近在线虫和果蝇、植物以及锥虫中先后进行 的将能形成茎环结构的 RNA 分子导入能够引发 RNAi 现象的结果是一致的 (reviewed in 3)。 另外还有一类由不同的研究小组开发的表达载体,在独立的 pol III 启动子后插入正义 和反义的 siRNA 序列,这个载体上的 siRNA 就像前面介绍的 shRNAs 一样都有 5 个 T 的转录终 止位点。这两类表达载体的产物引发 RNAi 的效果和瞬时转染 siRNA 的效果相当。 在哺乳动物细胞中用 siRNA 能高效阻断某个特定基因的表达,这项技术在疾病的基因治 疗上也有光明的应用前景。特别可以用于阻断某些突变基因的表达,或者由蛋白过量表达引 起的疾病。 最近在 RNAi 领域的研究成果已经在整个研究领域引起了巨大的反响。由于能够迅速而简 单的制备某个功能缺失表型,使得更多的研究人员迫不及待地投身于 RNAi 的研究之中,去尽 可能地了解 RNAi 和 有效的 siRNAs 的特 征。将来,RNAi 甚至 将会给基因治疗(genespecific therapeutics)的发展带来新的希望。尽管目前对这项功能强大的技术已经有深入 的了解,但是几乎每天都有新的结果不断涌现(生物通将及时为您追踪这个领域的最新进 展)。可以毫不夸张的说,RNAi 正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命,并将彻底改变 这个领域的研究步伐。

Glossary of Terms Cosuppression - Silencing of an endogenous gene caused by the introduction of a transgene or infection by a virus. This term, which can refer to silencing at the post-transcriptional (PTGS) or transcriptional (TGS) level, has been primarily adopted by researchers working with plants. Post(PTGS) Post-transcriptional Gene Silencing (PTGS) - Silencing of an endogenous gene caused by the introduction of a homologous dsRNA, transgene or virus. In PTGS, the transcript of the silenced gene is synthesized but does not accumulate because it is rapidly degraded. This is a more general term than RNAi, since it can be triggered by several different means. Quelling - PTGS in Neurospora crassa induced by the introduction of a transgene.

9

RISC - RNA-induced silencing complex. A nuclease complex, composed of proteins and siRNA (see below), that targets and destroys endogenous mRNAs complementary to the siRNA within the complex. RNA interference (RNAi) - Post-transcriptional gene silencing (PTGS) induced by the direct introduction of dsRNA. The term "RNA interference" was first used by researchers studying C. elegans. siRNAs - Small interfering RNAs. Current models of PTGS indicate that these 21-23 nucleotide dsRNAs mediate PTGS. Introduction of siRNAs can induce PTGS in mammalian cells. siRNAs are apparently produced in vivo by cleavage of dsRNA introduced directly or via a transgene or virus. Amplification by an RNAdependent RNA polymerase (RdRP) may occur in some organisms. siRNAs are

incorporated into the RNA-induced silencing complex (RISC), guiding the complex to the homologous endogenous mRNA where the complex cleaves the transcript. RNA interference (RNAi) is a phenomenon in which double-stranded RNA (dsRNA) specifically suppresses the expression of a gene bearing its complementary sequence. Small interfering RNA (siRNA) can be used to induce RNAi in mammalian cells.

siRNAs/dsRNA 的来源
在后基因组时代,光有序列已经远远不够了,在基因专利、药物开发等巨大利益的推动 下,基因功能的研究以前所未有的速度快速发展,各种研究基因功能的新技术不断涌现。 RNAi 作为一种新的、强有力的研究工具在功能基因组学领域的巨大应用潜力,使得 RNAi 成 为当今研究领域最引人注意的话题之一。 一种新技术,就是能使过去做不到或者很难做到的工作变得简单可行,从而为研究人员 开拓更广的空间,加速推动研究的进程。正如每一种新技术刚刚出现的时候,这种技术的每 一步进展,乃至每一个应用成果都格外引人瞩目。由于 RNAi 可以非常简单地代替基因敲除制 备基因缺失表型的个体,从而研究某个基因的功能,并且可以大规模的开展研究,在世界各

10

地,越来越多的研究人员开始迫不及待地开展研究 RNAi 或者在自己的研究领域使用这项崭新 的技术,而且确实涌现了一批相当出色的研究成果。 siRNA 技术不要求大型的仪器设备,操作也非常简单,经费不够宽裕的实验室也能掌 握,更重要的是潜力巨大,“钱”景诱人(——要知道,必需了解基因的基本功能才能注册 基因专利,一个基因专利,价高的可达数亿美金——而 RNAi 正是研究基因功能的有力工 具!),国内有不少实验室都开始关注这个技术。关键的问题就是:如何得到以及如何设计 siRNA 或者双链 RNA 呢?如何将这些双链 RNA 引入细胞呢?在这里,生物通进一步为有意开 展 RNAi 技术的用户介绍在研究中可能用到的一些产品技术细节和相关信息。

现成的 siRNAs
可以简单、有效而且是特异的下调哺乳动物细胞中的基因的表达,这种能力使得 siRNA 在科研、治疗乃至商业上有巨大的前景。由于 siRNA 技术越来越多地应用在研发中,研究人 员需要大量的、经济的 siRNA 以满足研究大量基因的需要。Qiagen 公司推出 Cancer siRNA Oligo Set Version 1.0,这是第一个针对疾病——139 个人类癌症相关基因的 siRNA Set, 试剂盒为这 139 个基因中的每个基因提供 2 对精心设计的 siRNAs 以及一个正对照,5 个负对 照和 4 个荧光对照,以便让用户有更好的选择。这些 siRNAs 经过研究人员精心设计以增强引 发基因沉默的能力,经专利的 TOM-amidite 化学法合成、HPLC 纯化,纯度 97%以上,可以同 时或者分别诱发多个癌症相关基因的沉默,是对这 139 个人类癌症相关基因进行功能基因组 学研究的有力工具,还可以用于研究这些癌症相关基因和其他更多基因的相互作用。 Cancer-related genes in the Cancer siRNA Oligo Set Version 1.0
ABCB1 ABCB4 ABCC1 ABL AKAP13 AKT1 AKT2 APC AR ATM BAD BAG1 BAK1 BARD1 BAX BCL2 BCL3 BCL6 BCR BRAF BRCA1 BRCA2 CBL CCND1 CCNE1 CDH1 CDH13 CDK4 CDKN1A CDKN1B CDKN1C CDKN2A CDKN3 CHEK1 CHEK2 CRK CSF1R DCC DEK EEF1A2 EGFR EIF3S3 EIF4E ELK1 EPHA1 ERBB2 ERBB3 ERBB4 ERG ESR1 ETS1 ETS2 FES FGF3 FGF4 FGF6 FGFR1 FGFR2 FGR FLI1 FOS FYN GADD45A GADD45B GADD45G GLI GNAI2 GRO1 HCC-4 HCK HRAS JUN JUND KAI1 KIT KRAS2 LCK MADH2 MADH4 MAF MAFF MAS1 MAX MCF2 MDM2 MEL MEN1 MET MLH1 MOS MPL MSH2 MYB MYB1 MYC MYCL1 MYCN NCOA1 NCOA3 NET1 NF1 NF2 NFKB2 NRAS NTRK1 PAX2 PDGFB PGR PIM1 PTCH PTEN RAF1 RARA RB1 REL RET ROS1 RPS6KB1 RUNX1 SAS SKI SRC TAL1 TGFBR1 TGFBR2 THRA TIAM1 TLX1 TNFRSF1B TNFRSF6 TP53 VAV1 VHL WNT1 WNT2 WNT5A WNT7B WT1 YES1

siRNA: 化学法合成 siRNA
11

在较早的哺乳动物 RNAi 实验中,siRNAs 是通过化学方法合成的,就像合成引物一样, 这种方法比较简单明确。号称 The Company of RNA 的 Ambion 公司就有提供此项服务。只要 你提供序列,Ambion 就可以帮你合成两条互补的 RNA 单链,末端补加 TT 或者 UU,或者其他 你需要的 3'突出端。同时还免费提供去保护和反向脱盐纯化、PAGE 胶纯化等服务。一对冻干 的 RNA 连同退火 Buffer、无 RNAse 水一起提供,方便实验的进行。 QIAGEN 公司,前不久刚吞并了全球最大的 DNA 合成供应商 Operon 公司和 RNA 合成供应 商 Xeragon 公司,凭借 Xeragon 在 RNA 合成领域的雄厚实力和声望,提供 siRNA 合成服务。 专利的 TOM-amidited 技术,使得每一步碱基耦联效率高达 99.5%以上,有更高的产率。一对 21 碱基的 RNA 退火形成 3'端带有 2 个碱基突出的双链 RNA,经过去保护和脱盐,纯度为 80%85%,如果选择阳离子交换 HPLC 纯化,纯度超过 97%。QIAGEN 提供 siRNA 是已经退火的,在 灭菌重悬缓冲液中,即可进行 RNA 转染,非常方便。

利用试剂盒, dsRNA 利用试剂盒,自己制备 siRNAs 或者 dsRNA
长片断的 dsRNA 可以在植物、原生动物、昆虫、线虫中引发基因沉默。要研究这些对 象,自己制备长片断的 dsRNA 是很容易做到的:通过合适的质粒亚克隆——线性化——体外 转录的方法,就可以自己合成 dsRNA。目前已经有商品化合成 dsRNA 的试剂盒(例如 NEB 的 HiScribe RNAi Transcription Kit,后文介绍)。但是在哺乳动物细胞中,超过 30nt 的 dsRNAs 则引起非特异基因沉默。实验表明,在哺乳动物细胞内引发特异的基因沉默最有效的 siRNAs 是有 19 个碱基互补,两边 3'端各有 2 个碱基突出(通常是 UU,但是目前不清楚 UU 对 siRNAs 的活性影响有多大) 的一对 21-mer 的 dsRNAs。由于体外转录利用 T7RNA 聚合酶 进行体外扩增的时候,通常要求序列的首 2 个碱基为 GG 或者 GA 以提高合成效率,但是这两 个额外的碱基会大大降低 siRNAs 的活性,而且通常体外转录很难高效合成这么小的 RNA(通 常需在 25nt 以上),因而早先哺乳动物细胞的 RNAi 实验中用到的 siRNAs 是用化学方法合成 的,方便,简洁,不受碱基的限制。 可是不管怎么说,化学合成 RNA 的费用是相当高的(一个碱基要将近 400 元),特别是 在哺乳动物细胞中 siRNAs 的效率不一,一般一个基因需要设计 3—5 对 siRNAs 以确定最有效 的,这样的费用就高了(就是 6—10 条 siRNAs(每条 21nt),一个基因通常花费不少于 20000)。如果需要重复设计,在国内还有时间上的困扰。 现在,多个厂家推出了不同的试剂盒,一个试剂盒可以自行设计合成多个 siRNAs,灵活 性和可控性都明显提高,不失为一种经济的选择。
12

体外转录制备 siRNA 1.
Silencer? siRNA Construction Kit——Lower

Cost & Higher Potency siRNAs

Ambion 公司的这个试剂盒是建立在体外转录的基础上的,其专利的设计有效克服了前面 提到的难题,原理非常简单: 首先合成两段 29-mer 的 DNA 作为模版(DNA 合成的价格就便宜多了,即使是全球最著名 的 DNA 合成供应商 Operon,也就是 7、8 块钱一个碱基),包括 8 个与 T7 启动子引物 3'端匹 配的碱基(称为引导序列,leader sequence)和 21 个设计的 siRNA 序列。 将这两个模版和对应的 T7 启动子引物分别混合,引物末端和 DNA 模版褪火结合,用 DNA 聚合酶 Klenow 大片断补平成为双链 DNA 模版,分别用 T7 RNA 聚合酶进行体外转录,将产物 混合形成 dsRNA,新的双链 RNA 包含 5'端单链的引导序列和中间互补的 19 个碱基序列以及 3'端两个重复的 U(UU)。 通过 DNA 酶降解模版,同时用单链专一的核酸酶消化 5'的引导序列,由于 RNase 不能切 开 U 碱基也不能切双链 RNA,所以得到的产物就是我们需要的 21-mer 的双链 siRNAs——有 19 个碱基互补,3'端各有 2 个 U 突出。 通过试剂盒提供的纯化小柱,去除引物、碱基盐和蛋白质等杂质,得到的就是可以立即转 化用的 siRNAs!

13

RNAi 的作用是非常强大的,而 siRNAs 在哺乳动物细胞中的应用,毫无疑问是最引人瞩 目的。找到好的 siRNA,的确非常有效,但是要找到好的 siRNA 就要费一番功夫,多次尝 试。采用 Ambion 的这个试剂盒,你可以节约更多的时间和精力尝试其他的 siRNA,以便找到 对你的目标基因最有效的一个。由于减少了非特异反应,越是有效的 siRNA,实验结果的信 噪比就越高。 整个实验需时不超过 2 天,但是却可以得到 15 个 siRNAs,而且每个 siRNAs 的产量很 高,足够做上百次转染实验。一个试剂盒提供足够的试剂生产 15 个纯化的双链 siRNAs,可 以直接用于转染。用这种方法的花费只是化学合成费用的一小部分—— 一个试剂盒价格人民 币 8349,还低于化学合成一条 21-mer 的 siRNA 的价格(按 400 元每个碱基计算,还未计算 HPLC 纯化的费用)。根据厂家提供的信息,这种方法合成的 siRNA 的效率要比用化学法合成 的同序列的 siRNA 至少高 20 倍!估计原因是由于化学合成每一步的合成效率和纯化效率都不 能到 100%,20 步反应后经过 HPLC 纯化后纯度才 97%,因而对结果有影响。 RNAi 技术专辑之四

在细胞内表达 siRNA 引发基因沉默

14

RNAi 在哺乳动物细胞中通常用于阻断特定基因的表达从而研究基因的功能,常见的做法 是将靶向特定基因的大约 21 碱基长短的双链 siRNAs(small interfering RNAs),或者是 45 —50-mer 的发夹结构 RNA(small hairpin RNA, shRNA)转染到细胞。shRNA 在细胞内会自 动被加工成为 siRNA,从而引发基因沉默或者表达抑制。现在有多个报道说通过质粒表达 siRNAs 同样可以抑制特定基因的表达。尽管细节各有不同,但载体大都是用 PolIII 启动子 启动编码 shRNA(small hairpin RNA)的序列。选用 PolIII 启动子的原因在于这个启动子总 是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成 RNA,遇到 4—5 个连续的 U 即终止,非常精 确。当这种带有 PolIII 启动子和 shRNA 编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时,这种能表达 siRNA 的质粒确实能够下调特定基因的表达,抑制范围包括外源基因和内源基因。采用这种 方法的优点在于,通过 siRNA 表达质粒的选择标记,siRNA 载体能够更长时间地抑制目的基 因表达。当然还有一点,那就是由于质粒可以复制扩增,相比起化学合成来说,这就能够显 著降低制备 siRNA 的成本。因为质粒的价钱大约是 3000 多人民币,还不到化学合成 1 条 21nt 的 RNA 价格的一半,但是就可以自行制备 siRNA 而不受数量的限制。生物通在这里为大 家介绍几种不同的 siRNA 合成质粒,但是大家要注意的是这里介绍的 siRNA 质粒是不同于体 外转录合成 RNA 的质粒(生物通在后文会继续为大家介绍),因为这里制备的是用于哺乳动 物细胞实验的 siRNA,而不是长链的 RNA(长链的 dsRNA 不适宜用在哺乳动物细胞,因为会引 发非特异抑制,参考RNAi——回顾) pSilencer siRNA 表达载体系列是用于在培养的哺乳动物细胞中表达 siRNA 的一系列载 体。在载体上包含有 RNA 聚和酶 III (Pol III)启动子,氨苄抗性基因和大肠杆菌复制 子,只要将编码一小段对应目的基因特异序列的、其 RNA 能形成发夹结构(就是回文结构) 的 DNA 序列插入载体中 Pol III 启动子的下游,转入哺乳动物细胞,载体就能表达出发夹结 构的 RNA,这种 RNA 很快在细胞中加工成为 siRNA。 这些表达载体已经成功的在 Hela 细胞中抑制了包括 Cyclophilin、GAPDH、p53、c-myc 在内的多个基因的表达。实验表明:能够被化学合成或者体外合成的 siRNAs 抑制的基因同样 可以被表达相同序列的载体生成的 siRNAs 抑制。

1.0pSilence 1.0-U6

15

载体 pSilence 1.0-U6 是采用小鼠 U6 Pol III 启动子。这个由哈佛大学开发的载体已 经成功的在 Hela、H1299, U-2 OS 和 C-33A 细胞中敲除了 cdk-2 和 laminA/C 的表达。这个载 体经过 Apa I 和 EcoR I 酶切线性化和纯化,你只需要合成一对 55-mer 的寡核苷酸,带有 4 个碱基的突出(当然是对应 Apa I 和 EcoR I 酶切位点咯),一起退火、快速连接就可以转化 了。在购买线性化的质粒同时,厂家还提供带有 GAPDH siRNA 的环形质粒对照(万一线性质 粒不够用还可以自己扩增再切嘛!) 2.03.0pSilencer 2.0-U6 and pSilencer 3.0-H1 这两个载体带有不同的 RNA Pol III 启动子,pSilencer 2.0-U6 带的是人的 U6 启动 子,pSilencer 3.0-H1 则是用 H1 RNA 启动子(RNase P 的一个组成部分)。这两个载体都是 用 BamH I 和 Hind III 线性化并且经过纯化的,方便定向克隆。这两个载体都是以线性化的 质粒供应,同时还提供 GAPDH 对照和一个空白对照质粒,以及 DNA 退火的 Buffer。

pSilencer? siRNA Expression Vectors; Maps and siRNA Design

?

For each target gene two complementary 55-60 mer oligonucleotides must be prepared. The oligonucleotides should encode the 19 mer hairpin sequences specific to the mRNA target, a loop sequence separating the two complementary domains, and a polythymidine tract to terminate transcription by RNA Pol III. The insert design shown above is specific for the pSilencer 2.0-U6 and 3.0-H1 Expression Vectors and contains the overhanging 5' ends to facilitate efficient and directional cloning into these plasmids. The insert for pSilencer 1.0-U6 would contain the appropriate end sequences for cloning into the Apa I and EcoR I sites. Early indications suggest that a great deal of latitude is available in the design of the loop; here we provide our default loop sequence that we find works well.

16

17

RNAi 技术专刊之五:

体外转录合成双链 RNA
在植物、昆虫、原生动物体内都发现了自然存在的 RNAi 现象,实验表明通过目的基因序 列的双链 RNA 可以诱导产生基因沉默现象。要制备较长的 dsRNA,最简单的方法就是体外转 录合成双向的 RNA。如果研究对象不是哺乳动物细胞,那要开展 RNAi 的实验就要简单很多。 因为可以采用较长的双链 RNA 诱导 RNAi 现象,而无需制备特定的 siRNA。在这里生物通将介 绍几个制备长链 dsRNA 的试剂盒。(值得注意的是在哺乳动物细胞内,大于 29nt 的双链 RNA 引发的是非特异基因沉默,21nt 大小的双链 RNA,也就是我们前面所说的 siRNA 能有效引发 特异的基因沉默。由于体外转录很难合成 25nt 以下的短链 RNA,生物通在前面为大家介绍了 一些利用试剂盒或者质粒合成 siRNA 的产品。参考相关文章) MEGAscript? MEGAscript? RNAi Kit 合成大量纯净的双链 RNA 是 RNAi 实验成功的关键。这个基于专利的转录高产技术的产品 正是为大量合成用于 RNAi 实验的 dsRNA 而优化的。试剂盒要求用两端带有 T7 启动子序列的 目的基因作为模板(200nt 以上,模板可以是质粒载体上的,也可以是用带有 T7 序列的引物 扩增的 PCR 产物,另外也可以选用一个叫 Lig'n Scribe Kit 可以将 T7 Prometor 序列直接连 接到 DNA 片断的两端),将模板和试剂盒提供的 dNTP、酶等混合,根据模板的长短进行体外 转录反应。每次反应可以合成 50ug—100ug 甚至更多的 dsRNA(800nt 以上的需要先加热变性 并褪火形成双链),产量是常规的 10—50 倍,整个试剂盒总产量可达 2mg(20 次反应,每次 100ug)。合成的产物经过 DNase I 消化去除 DNA 模板,再经过特殊的单链 RNase(试剂盒里 提供,后文介绍)除去单链的 RNA,最后经过柱纯化就得到纯的双链 RNA,即可用于 RNAi 实 验。由于这个试剂盒提供全套产品,使用相当方便。

18

HiScribe? HiScribe? RNAi Transcription Kit HiScribe? RNAi Transcription Kit 也是一个体外合成双链 RNA 进行 RNA 干涉实验的

试剂盒。不同于前者的是,这个试剂盒提供质粒作为载体,方便了以后的扩增和复制。 LITMUS? 载体多克隆位点两端带 T7 启动子。目的序列插入多克隆位点,利用 T7 RNA 聚合 酶同时转录 DNA 摸板的双链,合成双链 RNA。载体启动子为 T7 野生型序列,是已知最强的启 动子之一,以保证转录产率的最大化。带有插入 lacZ a 片段供蓝白筛选。 该试剂盒也可合成单链 RNA,在 RNA 结构研究,核酶化学,体外翻译,RNA 蛋白相互作 用,反义技术等方面有广泛应用。该试剂盒包含 LITMUS 双向转录克隆载体,适用体外如显 微注射、细胞转染和体内 RNA 干涉在内的所有转录实验。 该试剂盒包括足够的试剂可在 2ml 的反应体系中合成多至 2mg 的双链 RNA,包括:LITMUS 28i 克隆载体,LITMUS 38i 克隆载体(LITMUS 28i 和 38i 二者只是多克隆位点有所不 同),对照载体,T7 引物(19-mer), 5? -dTAATACGACTCACTATAGG-3? ,10X 含 NTP 的缓冲 液,T7 RNA 聚合酶,上样缓冲液和电泳 Marker 2-Log DNA Ladder (100–10,000 bp)等等。 价格也相当,3750 人民币。但是可惜的是试剂盒没有提供消化 DNA 模版和单链 RNA 的酶以及 纯化的工具,需要另外购置。单独购买的相关产品生物通将在后文继续介绍。更多关于 RNAi 产品介绍请继续关注生物通技术前沿专栏。

19

Figure 1: 用带插入子的 LITMUS 28i 合成双链 RNA

20

siRNA 实验成功要点

1. 对每个基因设计并检测两到四个 siRNA 序列 为了找到潜在靶位点,扫描靶基因中的 AA 序列。记录每个 AA 3’端 19 个核苷酸作为潜 在 siRNA 靶位点。潜在靶位点需通过 GENBANK 数据库的 BLAST 分析,去除那些与其它基因明 显同源的靶位点。如果可能,siRNA 应根据 mRNA 低二级结构的区域设计。 美国著名 RNA 产品公司 Ambion 提供网上在线设计工具,帮助您更快地完成这项工作。网 址为:www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html 2. 选择低 GC 含量的 siRNA Ambion 公司研究发现 GC 含量在 40-55%的 siRNA 比 55%以上的活性高。 3. 纯化体外转录 siRNA 在转染前要确认 siRNA 的大小和纯度。为得到高纯度的 siRNA,推荐用玻璃纤维结合, 洗脱(Ambion siRNA 体外合成试剂盒中已包括纯化柱保证 siRNA 纯度)或通过 15-20%丙烯酰 胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的 RNA 通常 需要跑胶电泳纯化(即 PAGE 胶纯化)。 4. 避免 RNA 酶污染 微量的 RNA 酶将导致 siRNA 实验失败。由于实验环境中 RNA 酶普遍存在,如皮肤,头 发,所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品…因此保证实验每个步骤不受 RNA 酶污染 非常重要。Ambion 公司在这方面有一整套的产品线,如除 RNA 酶的喷剂,拭纸及液剂,检测 和去除 RNA 酶。 5. 健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性 通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定 性。为了优化实验,推荐用 50 代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。 6. 避免适用抗生素 Ambion 公司推荐从细胞种植到转染后 72 小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的 细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在 siRNA 转染时需要无血清的条件。这种情况下,可
21

同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验,以得到最佳转染效果。QIAGEN 推出的专门针 对 RNA 转染的试剂 7. 选择好的转染试剂转染 siRNA 针对靶细胞类型,选择好的转染试剂和优化的操作对 siRNA 实验的成功至关重要。siRNA 实验要求选择适合转小的 RNA 的转染试剂(目前大多数转染试剂都针对转染比较大的质粒 DNA , 而 非 小 的 RNA 分 子 , 宿 主 范 围 大 小 也 不 同 ) 。 Ambion 公 司 的 Silencer siRNA Transfection Kit , QIAGEN 的 Transmessenger Transfection Reagent 都 是 专 门 针 对 转 siRNA 优化的转染试剂,是您的理想选择。 8. 通过合适的阳性对照优化转染和检测条件 对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的 siRNA 转入靶细 胞(同样适合实验靶 siRNA),转染 48 小时后统计对照蛋白或 mRNA 相对于未转染细胞的降 低水平。过多的 siRNA 将导致细胞毒性以至死亡。Ambion 公司提供多种靶基因的阳性 siRNA。 9. 通过阴性对照 siRNA 排除非特异性影响 合适的阴性对照可通过打乱活性 siRNA 的核苷酸顺序设计而得。必须注意它要进行同源 比较确保相对所要研究的生物的基因组没有同源性。 10. 通过标记 siRNA 来优化实验 荧光标记的 siRNA 能用来分析 siRNA 稳定性和转染效率。标记的 siRNA 还可用作 siRNA 胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了 siRNA 的细胞,将转染与 靶蛋白表达的下调结合起来。

22


赞助商链接
相关文章:
RNA干扰实验
RNA干扰实验_生物学_自然科学_专业资料。RNA 干扰实验一、磷酸钙转染法 【实验...4. 在 5%CO2 的加湿培养箱中培养细胞 2-6 hr。 5. 除去培养液,加入 ...
RNA干扰(RNAi)
喜欢此文档的还喜欢 RNA干扰的原理与应用 4页 免费 RNA干扰技术 61页 免费 04-4.RNA干扰 22页 免费 RNA干扰的研究进展 7页 免费 RNA干扰技术 3页 免费...
RNA干扰步骤
RNA干扰步骤_计算机硬件及网络_IT/计算机_专业资料。RNA干扰步骤一...4 让介电电泳场开约 1 分钟后关掉,立即应用融合脉冲,其 振幅数量级为 1kV/...
RNA干扰设计
RNA 干扰作用 2004:在恒河猴上的 SARS 病毒研究取得进展 2004:Acuity ...然而,更加令人吃惊和兴奋的是,4 年以 后的今天,Andrew Fire 和 Craig Mello ...
RNA干扰的重点
RNA干扰的重点_生物学_自然科学_专业资料。1. RNA 干扰的发现及其作用机制,...支架,4.指导 Epigenetic and transciptional 表型和转录 Allosteric change ...
RNA干扰综述
13页 1财富值 RNA干扰(RNAi) 4页 免费 RNAi技术及其应用 9页 免费如要投诉违规内容,请到百度文库投诉中心;如要提出功能问题或意见建议,请点击此处进行反馈。 ...
RNA干扰iRNA技术及其应用
文档贡献者 846213983 贡献于2014-04-09 专题推荐 汪华-2013年中国移动互联......4页 免费 RNA干扰技术的应用进展 15页 1下载券 RNA干扰技术及其应用研究... ...
RNA干扰的原理与应用
在整个 RNA 干扰的转录后 基因沉默(PTGS)机制中起调节作用 ② Dicer 酶家族在高等植物中有特异性, 4 个成员, 共 称之为 DCL1~DCL4 它们与 miRNA 的成熟...
RNA干扰
4页 免费 RNA干扰设计 15页 免费 RNA干扰的原理与应用 4页 免费如要投诉违规内容,请到百度文库投诉中心;如要提出功能问题或意见建议,请点击此处进行反馈。 ...
RNA干扰技术及其应用
4.RNA 干扰技术的研究进展 徐俊、毛颖、苗荻、郝佳 中国知识产权专利局专利审查协作北京中心。 5.GunterM, ThomasT.Mechanisms Of gene silencing by double-...
更多相关标签: