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发酵工程课件整理版


第一章 微生物工程菌种 第一节 发酵工业常用的微生物 一、发酵工业对微生物菌种的要求 尽管工业用微生物菌种多种多样,但 作为大规模生产,选择菌种应遵循以 下原则: 1、能在廉价原料制成的培养基上迅速 生长,并形成所需的代谢产物,产量 高。 2、可以在易于控制的培养条件下迅速 生长和发酵,且所需酶活力高。 3、根据代谢控制的要求,选择单产高 的营养缺陷型突变株或调节突变株或 野生菌株。 4、选育抗噬菌体能力强的菌株,使其 不易感染噬菌体。 5、菌种纯粹,不易变异退化,以保证 发酵生产和产品质量的稳定性。 6、菌种不是病原菌,不产生有害的生 物活性物质和毒素,以保证安全。 二、发酵工业中常用微生物菌种 (一) 细菌 1、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) ? 分布广,常存在于枯草、土壤等, 一般为腐生菌; ? 在酱油、酱类和白酒制曲时,如果 水分含量大,温度较高,就容易造成 枯草杆菌迅速繁殖;不仅消耗原料蛋 白质和淀粉,而且生成刺眼鼻的氨味, 造成曲子发粘发臭,使制曲失败。 ? 能产生大量淀粉酶和蛋白酶 AS1.393 蛋 白 酶 BF7658 ?-淀粉酶 2、大肠杆菌 (Escherichia coli) ? 可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、 苏 氨酸、缬氨酸等 ? 大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业上 被用来进行谷氨酸的定量分析 ? 基因工程的很好材料 3、乳酸杆菌 (Lactobacillus sp.) ? 革兰氏阳性,无芽孢,厌氧或兼性 厌氧 ? 可生产乳酸

? 干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、 泡菜制作 4 、 丙 酮 丁 醇 梭 菌 (Clostridium acetobutyleum) ? 芽孢卵形,中生或次端生,使芽孢 囊膨大成梭状或鼓槌形 ? 专性厌氧 ? 发酵生产丙酮丁醇 5 、 肠 膜 状 明 串 珠 菌 (Leuconostoc mesenteroides) ? G+、微需氧至兼性厌氧,生长需 要缬氨酸和谷氨酸 ? 在蔗糖液中形成特征性葡聚糖黏液 (20~25? 促使形成) C ? 可生产葡聚糖 ? 使糖汁变粘而无法加工,为糖厂有 害菌 6、醋酸菌 (Acetobacter) ? 不形成芽孢,G-,好气性 ? 分两群: 只将乙醇氧化成醋酸 2) 1) 将产生的醋酸继续氧化成 CO2 和水 ? 可生产醋酸 7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ? 以葡萄糖为原料发酵产生酸,是谷 氨酸和其他氨基酸的高产菌 ? 生产谷氨酸等 ? 如北京棒杆菌 AS1.299 钝齿棒杆 菌 AS1.542 8、短杆菌 (Brevibacterium) 氨基酸、核苷酸工业生产中常用 的菌种,也是酶法合成生产辅酶 A 的 菌种 9、黄单胞菌 (Xanthomonas) ? 细胞直杆状,G-,无芽孢,极生 鞭毛 ? 在含蔗糖的琼脂平板上形成圆形、 边缘整齐、粘稠光滑的黄色菌落;液 体培养形成黄色粘稠的胶状物——荚 膜多糖,其黄色为一种水溶性色素 ? 野油菜黄单胞菌(X. campestris) 可 以淀粉生产黄原胶(Xanthan gum) 10、假单胞菌 (Pseudomonas) 能发酵生产维生素 B12、丙氨酸、谷 氨酸、葡萄糖酸、色素、果胶酶;也 能进行类固醇(甾体)转化;有些菌

株可利用烃类生产单细胞蛋白。 (二) 放线菌 因其菌落呈放射状而得名 属原核微生物类群,在自然界中分布 很广,尤其在有机质丰富的微碱性土 壤中较多。大多腐生,少数寄生。 产生多种抗生素 (12 000 余种, 60%左 右来自放线菌) ,经济价值大 (三)酵母菌 单细胞真核,主分布于含糖质较多的 偏酸性环境中,如水果、蔬菜、花蜜 和植物叶子上,以及果园土壤中。 (四)霉菌 第二节 生产菌种的来源 微生物工程工业生产水平的三个决定 要素: 生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件 生产设备 获得优良的生产菌种是实现高水平微 生物工程工业生产的第一环节. 一、菌种分离与筛选工作程序 发酵工业上使用的微生物菌种, 最 初 都是从自然界中 分离筛选出来 的。 分离与筛选菌种的具体做法一般分 4 个步骤: 样品采集 增殖培养 纯种分离 生产性能测定 二、分离与筛选的设计要求 在筛选所需菌株时应考虑以下一些重 要指标: 1、菌的营养特征 2、菌的生长温度 3、菌的稳定性 4、菌的产物得率和产物在培养液中的 浓度 5、菌对所采用的设备和生产过程的适 应性 6、容易从培养液中回收产物 3-6 是用来衡量菌种的生产性能,如能 满足这几条,便有希望成为效益高的

生产菌株 三、含微生物样品的采集 土壤(丰富、 5-25cm、土质、酸碱度、 植被状况、地理条件、季节) 根据微生物的营养类型采样 肉类加工厂附近、饭店排污沟,易分 离到蛋白酶和脂肪酶产生菌。 面粉加工厂等场所易 分离到产淀粉 酶、糖化酶的菌 根据微生物的生理特性采样 筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山 爆发处、堆肥等采样; 四、含微生物样品的富集培养 富集(enrichment)培养 是在目的微生物含量较少时,根据 微生物的生理特点,设计一种选择性 培养基,创造有利的生长条件,使目 的微生物在最适的环境下迅速地生长 繁殖,数量增加,由原来自然条件下 的劣势种变成人工环境下的优势种, 以利分离到所需的菌株。 ? 其要领是提供一些有利于所需菌 株生长或不利于其他 菌型生长的条 件,例如,供给特殊的基质或加入某 些抑制剂。 控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物 分开; 高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热 微生物分开; 控制 pH 可分离嗜酸或嗜碱微生物; 高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压 微生物; 在分离培养中加入抗生素或某试剂可 增加选择性 如分离真菌可在土豆培养基中加入链 霉素; 分离细菌或放线菌可在培养基中加入 制霉菌素等 ? 需注意, 所需菌型生长的结果有时 会改变培养基的性质,从而改变选择 压力。 ? 重复移植几次后接种少量已富集 的培养物到固体培养基上。 ? 移植时间是关键, 应在所需菌种确

已占优势的情况下进行。 五、利用固体平板的生化反应进行分 离 (方法之一) ? 利用特殊的分离培养对大量混杂微 生物进行初步分离的方法。 ? 分离培养基是根据目的微生物特殊 的生理特性或利用某些代谢产物生化 反应来设计的。 ? 可显著提高分离效率 透明圈法 变色圈法 生长 圈法 抑菌圈法 六、随机分离方法 有些微生物的产物对产生菌的 筛选没有任何选择性好处,因此常随 机地分离所需菌种,为此发展了一些 快速筛选方法并归纳出高产培养基成 分的选择准则如下: 1)制备一系列的培养基,其中有各种 类型的养分成为生长限制因素。 2)使用一聚合或复合形式的生长限制 成分 3) 避免使用容易同化的碳 (如葡萄糖) 或氮(如 NH4+) ,它们可能引起分解 代谢阻遏。 4)确定含有所需的辅因子(如 Co2+、 Mg2+、Mn2+、Fe2+) 5)加入缓冲液以减少 pH 变化 七、一些生物活性物质产生菌的分离 抗生素 抗肿瘤药物 酶抑制剂 生长因子 第三节 菌种选育 菌种选育 应用微生物遗传和变异理论,用人工 方法(或自然)造成变异, 再经过筛选以 得到人们所需菌种的过程 。 ? 菌种选育的目的是为了不断提高 发酵工业产品的产量和质量,增加新 产品和适应工艺改革的要求。 ? 菌种选育的方向是选育“吃粗粮”、 耐 高温、生长快、代谢旺、产量高、质 量好、无毒性的优良菌株。 自然选育

诱变育种 杂交育种 (有性、准性) 原生质体融合育种 基因工程育种 一、自然选育 在生产过程中,不经过人工处理,利 用菌种的自发突变而进行菌种筛选的 过程叫自然选育。 自发突变(spontaneous mutation), 也称自然突变,指某些微生物在没有 人工参与下所发生的那些突变,但这 决不意味着这种突变是没有原因的。 一般认为引起自然突变有两个原 因:即多因素低剂量的诱变效应和互 变异构效应。 多因素低剂量的诱变效应是指 自然突变实际上是由一些原因不详的 低剂量诱变因素引起 的长期综合效 应,例如充满宇宙空间的各种短波辐 射、自然界中普遍存在的一些低浓度 诱变物质以及微生物自身代谢活动中 所产生的一些诱变物质(如过氧化氢 等) 自然突变两种情况: 生产上所不希望的:菌种的 衰退和生产质量下降 对生产有益的:生产性能提 高 二、 诱变育种 ? 诱变育种就是人为地利用物理或 化学等因素,使诱变 对象细胞内的遗传物质发生变化,引 起突变,并通过筛选 获得符合要求的变异菌株的一种育种 方法。 诱变育种的基本原理 ? 诱变育种的理论基础是基因突 变,所谓突变是指由于染色体 和基因本身的变化而产生的遗 传性状的变异。 ? 突变主要包括染色体畸变和基 因突变二大类。 (1)染色体畸变是指染色体或 DNA 片断的缺失、易位、逆位、重复等。

(2) 基因突变是指 DNA 分子结构中 的某一部位发生变化(又称点突变) 。 三、杂交育种 一) 细菌杂交育种 转导 转化 接合 二) 放线菌杂交育种 放线菌和细菌一样属于原核微 生物,但却像霉菌那样以菌丝形态生 长,且形成分生孢子,所以就本质来 说,放线菌的基因重组过程近似于细 菌,但就育种方法来说,却有许多与 霉菌相似的方面。 四、原生质体融合育种 原生质体融合(protoplast fusion)育种 是杂交育种(基因重组)育种的一种 特殊方式 一)原生质体融合的概念 —— 就是把两个亲本的细胞分别 去掉细胞壁,获得原生质体,将两亲 本的原生质体在高渗条件下混合,由 聚乙二醇(PEG)作为助融剂,使它们 互相凝集,发生细胞质融合,接着两 亲本基因组由接触到交换,从而实现 遗传重组。 二)原生质体融合育种的优点 1 、大幅度提高亲本之间重组频率。 2、扩大重组的亲本范围。 3、原生质体融合时亲本整套染色体参 与交换,遗传物质转移和重组性状较 多,集中双亲优良性状机会更大。 4、可以和其它育种方法相结合,把由 其他方法得到的优良形状通过原生质 体融合再组合到一个单株中。 五大步骤: 直接亲本及其遗传标记选择 双亲本原生质体制备与再生 亲本原生质体诱导融合 融合重组体(融合子)分离 遗传特性分析与测定 五、基因工程育种 基因重组育种: 是运用体外 DNA 各种 操作或修改手法获得目的基因,再借

助于病毒、细菌质粒或其他载体,将 目的基因转移至新的宿主细胞并使其 在新的宿主细胞系统内进行复制和表 达,或者通过细胞间的相互作用,使 一个细胞的优秀性状经其间遗传物质 的交换而转移给另—个细胞的方法。 一个完整的基因克隆过程包括以下步 骤 1、获得待克隆的 DNA 片段(基因) ; 2、目的基因与载体在体外连接; 3、重组 DNA 分子导入宿主细胞; 4、筛选、鉴定阳性重组子; 5、重组子的扩增与/或表达。 一、质粒的特点 第四节 菌种保藏 一、菌种保藏原理 主要是根据菌种的生理生化特 点,人工创造条件,使孢子或菌体的 生长代谢活动尽量降低,以减少其变 异。 一般可通过保持培养基营养成 分在最低水平、缺氧状态、干燥和低 温, 使菌种处于“休眠”状态, 抑制其繁 殖能力。 二、保藏方法 1 、 斜 面 冰 箱 保 藏 法 4 ?C ; 3-6 个月 2、沙土管保藏法 产孢 子或芽孢微生物,1 年 3、菌丝速冻法 甘油或 二甲基亚砜作为保护剂,-20 ?C 4、石蜡油封存法 1 年左右 5、真空冷冻干燥保藏法 任何微 生物;一般 5 年以上 6 、 液 氮 超 低 温 保 藏 法 -196 ?C ;保护剂;保存期长 第二章 菌种的退化、复壮与保藏 第一节 菌种的退化和复壮 一、菌种的退化 (一)原因 ? 菌种保藏不妥 ? 菌种生长的条件要求没有得到 满足 ? 自身突变和自发突变

(二)菌种退化的表现 生产性状劣化,遗传标记丢失,原 有的典型性状变得不典型。 ? 菌落及细胞形态的改变; ? 生长速度缓慢,产孢子越来越 小; ? 代谢产物生产能力下降; ? 抗不良环境条件(抗噬菌体, 抗低温)能力减弱 ? 总之,退化是发生在群体细胞 中的一个从量变到质变的逐步 演变过程,由于个别突变细胞 表现生长优势,导致在群体中 最后数量占优势。 (三)菌种退化的防治 ? 从菌种选育方面考虑 1)尽量使用孢子或单核菌株 2)诱变处理后的菌株应充分的分离纯 化,保证获得菌株的纯度。 ? 控制传代次数 尽量避免不必要的移种和传代, 以减少细胞分裂过程中所产生的自发 突变几率。 ? 创造良好的培养条件 1)结构类似物抗性菌株在保藏培养基 中应添加相应药物,及时淘汰回复突 变细胞。 2)基因工程菌添加抗生素于培养基中 防止质粒的丢失 ? 采用有效的菌种保藏方法 ? 从菌种管理的措施上考虑 菌种复壮 二、菌种的复壮 侠义的复壮:菌种已经发生衰退后, 再 通 过纯种分离和性 能的测定等方 法,从衰退的群体中找出尚未衰退的 少数个体,以达到恢复该菌种原有典 型性状的一种措施。 广义的复壮:一种积极的措施,即在 菌种的生产性能尚未衰退前经常有意 识地进行纯种分离和生产性能的测定 工作,使菌种地生产性能逐步提高。 复壮措施方法 对已衰退菌种配合一定培养条件

进行单细胞分离纯化 淘汰衰退的个体 通过寄主体内进行复壮 改变培养条件 诱变剂处理 第二节 菌种的保藏 一、理想的菌种保藏方法应具备的条 件 1 经长期保藏后菌种存活健在; 2 保证高产突变株不改变表型和基因 型,特别是不改变初级代谢产物和次 级代谢产物生产的高产能力。 3 菌种保藏的基本措施是低温、干燥、 真空。 二、微生物菌种保藏技术 原理:根据微生物的生理生化特性, 人为地创造条件,使孢子或菌体处于 代谢不活泼,生长繁殖受到抑制的休 眠状态,以减少菌种的变异。一般可 通过保持培养基营养 成分在 最低水 平,缺氧状态,干燥和低温等。 ? 斜面保藏法 ? 穿刺保藏法 ? 沙土管干燥保藏法 ? 真空冷冻保藏法 ? 液氮保藏法 ? 悬滴保藏法 ? 低温保藏法 三、菌种保藏的注意事项 ? 菌种在保藏前所处的状态:孢 子或芽孢 ? 菌种保藏所用的基质:碳源 ? 操作过程对细胞结构的损害 本章重点内容 ? 菌种退化的现象及防治原则。 ? 菌种保藏的原理是什么?其方 法有哪些?分别适合何种菌种 的保藏? ? 真空冷冻干燥保藏法的基本程 序。 ? 常用于真空冷冻干燥的保护剂 有哪些?常用于液氮保藏法的 保护剂有哪些? 第三章 发酵培养基

第一节 培养基的类型 1、按培养基成分 1)合成培养基 2)天然培养基 2、按物理状态分 1)固体 2)半固体 3)液体 3、按用途分 基础培养基 富集培养基 选择培养基 鉴别培养基 孢子培养基 种子培养基 发酵培养基 第二节 发酵培养基的成分及来源 一、碳源 主要功能: 1)为菌体的生长繁殖提供能源和合成 菌体所必需的成分; 2)为合成目的产物提供所需的碳素成 分 糖类 油脂 有机酸 低碳醇等 糖蜜使用的处理 除糖份外,含有较多的杂质,如胶体 物质、灰分、生物素、色素等,其中 有些是有用的,但是许多都会对发酵 产生不利的影响,需要进行预处理。 处理目的: a.除去胶体性物质,降低糖蜜的粘度, 提高发酵液的流动性, 有利于改善发 酵过程中氧的传递。 b.脱色,除去有色物质。 c.中和过量的酸碱性物质, 除去部分对 pH 值有影响的缓冲性物质。 处理方法:a.冷酸通风沉淀法,即加酸 后,通风:除胶体物质和挥发性物质 b. 加 絮 凝 剂 聚 丙 烯 酰 胺 (PAM) :8mg/L,静置 1 小时 c.活性炭吸附法:除色素 二、氮源 有机氮源 豆饼(粕)粉、花生饼粉、鱼粉、蚕

蛹粉、酵母粉、玉米浆、尿素等 无机氮源 铵盐、硝酸盐等(由于细胞内的含氮 物质都以氨基或亚氨基的形式存在, 故铵态氮可以直接用 于合成细胞物 质;而硝态氮需还原成氨后才能被利 用) 在常用的无机氮中,硫酸铵被菌体利 用后会使培养液的 pH 下降, 为生理酸 性物质; 硝酸钠被同化时则引起培养液 pH 上 升,为生理碱性物质 三、无机盐和微量元素 1 主要作用: a 构成菌体成分; b 作为酶活性基的组成部分或维持酶 的活性; c 调节渗透压、pH 值、氧化还原电位 等; d 作为自养菌的能源。 在制备培养基时,镁、磷、钾、硫、 钙和氯等常以盐的形式加入,而钴、 铜、铁、锰、钼等金属离子,因需要 量很少,除了合成培养基外,一般在 复合培养基中不另外加入。 当盐浓度太高时,对微生物生长有抑 制作用,而在较低浓度时却能刺激生 长。 4 使用注意点 A. 对于其它渠道有可能带入的过多 的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加 以考虑 B、使用时注意盐的形式(pH 的变化) 三、无机盐和微量元素 ◆ 磷酸盐 Mg 2+是许多重要酶(如己糖磷酸化 酶、异柠檬酸脱氢酶、羧化酶等)的 激活剂 ◆ 硫酸镁 镁离子能提高一些氨基糖苷类抗生素 产生菌对自身所产的抗生素的耐受能 力,如卡那霉素、链霉素、新生霉素 等产生菌。

◆ 钾盐 钾不参与细胞结构物质的组成,是许 多酶的激活剂,菌体生长所需钾量约 为 0.1g/L(以 K2SO4 计) ◆ 微量元素 需量微少,但又不可缺少 一般作为碳、氮源的农副产物天然原 料中,本身含有,不必另加 某些金属离子,特别是汞离子和铜离 子,具有明显的毒性 四、生长因子 概念:微生物生长不可缺少的微量有 机物质。 类别:维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及 其衍生物 五、水 生理功能: 1)是微生物机体的重要组成部分 2)进行代谢反应的介质 3)营养物、代谢物、氧气等必须溶解 于水后才能通过细胞表面进行正常的 活动; 4)水的比热高,能有效吸收代谢过程 中放出的热,使细胞内温度不致骤然 上升;同时水又是热的良导体,有利 于散热,可调节细胞温度。 六、前体 (precursor) 概念: ——指某些化合物加入到发酵培养基 中,能直接被微生物在生物合成过程 中结合到产物分子中去,而其自身的 结构并没有多大变化,但是产物的产 量却因加入前体而又较大的提高。 七、促进剂和抑制剂 1、促进剂: 促进剂是指那些非细胞生长所必需 的营养物,又非前体,但加入后却能 提高产量的添加剂。 ? 促进剂不是前体或营养物 ? 可影响正常代谢,或促进中间代谢 产物的积累,或提高次级代谢产物的 产量 2、抑制剂 抑制某些代谢途径的进行,同时刺激

另一代谢途径,以致可以改变微生物 的代谢途径。 第三节 淀粉水解糖的制备 将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉 的糖化,制得的水解糖叫淀粉糖。 一、淀粉水解糖的制备方法 1、酸解法:以酸(无机酸或有机酸) 为催化剂,在高温高压下将淀粉水解 转化为葡萄糖的方法。 2、酶解法(双酶水解法) 酶解法是用淀粉酶将淀粉水解为葡萄 糖。 3、酸酶结合法 酸酶法 酶酸法 第四节 营养物质的调节 一、不同碳源的利用速度 将能够被微生物快速利用的碳源 称为速效碳源,反之为迟效碳源。一 般葡萄糖的利用速度最快,乳酸次之, 乳糖利用速度比前两者都慢。 二、氮源利用及与碳源利用的关系 氮源利用速度与碳源利用速度是很有 关系的,各种糖的代谢速度不同,氨 及铵盐的利用速度也随之改变。 三、碳氮比例的调节 除了碳、氮源利用之间有密切关系外, 碳源和氮源之间的比例也能够直接影 响微生物的生长和发酵产物的积累。 四、前体的控制 有许多因素会影响前体的利用或渗入 产物分子。 五、补料 发酵中途补料起到了重要的作用 ? 丰富了培养基,避免了菌体过 早衰老,使产物合成的旺盛期 延长; ? 控制了 pH 值和代谢方向; ? 改善了通气效果,避免了菌体 生长可能受到的抑制; ? 发酵过程中因通气和蒸发,使 发酵液体积减小,因此补料还 能补足发酵液的体积。 第四节 发酵培养基的设计与优化 一、培养基成分选择的原则

1、菌体的同化能力 2、代谢的阻遏和诱导 3、合适的碳氮比 4、pH 的要求 二、培养基的优化 培养基设计与优化的大致步骤: 1)根据前人的经验和培养基配制的基 本理论,初步确定可能的成分; 2)通过单因子实验确定最为适宜的培 养基成分; 3)通过多因子实验确定各成分的最适 浓度 1 、 正 交 实 验 设 计 (Orthogonal experimental design) 步骤: 1)根据问题的要求和客观的条件确定 因子和水平,列出因子水平表; 2)根据因子和水平数选用合适的正交 表,设计正交表头,并安排实验; 3)根据正交表给出的实验方案,进行 实验; 4)对实验结果进行分析,选出较优的 “试验”条件以及对结果有显著影响的 因子。 第四章 种子扩大培养 第一节 种子扩大培养的目的与要求 种子扩大培养的概念:种子扩大培养是 指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处 休眠状态的生产菌种接入试管斜面活 化后,再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐 级扩大培养,最终获得一定数量和质量 的纯种过程。这些纯种培养物称为种 子。 种子扩培的目的 ? 接种量的需要 ? 菌种的驯化 ? 缩短发酵时间、保证生产水 平 种子的要求: ? 活力强,移种至发酵后能够迅 速生长,迟缓期短。 ? 生理状况稳定,个体与群体。 ? 菌体总量及浓度能满足大容量 发酵罐的要求。

? 无杂菌污染。 ? 保持稳定的生产能力。 第二节 种子制备过程举例 第三节 种子制备的技术概要 一、种子制备的过程 实验室阶段:不用种子罐,所用的设 备为培养箱、摇床等实验室常见设备, 在工厂这些培养过程一般都在菌种室 完成,因此现象地将这些培养过程称 为实验室阶段的种子培养。 生产车间阶段:种子培养在种子罐里 面进行,一般在工程归为发酵车间管 理,因此形象地称这些培养过程为生 产车间阶段。 二、实验室阶段 1、培养物选择的原则 目的:种子扩培到一定的量和质,根 据菌种的特点最终的培养物可分为两 类: 2、培养基选择的原则 培养基的选择应该是有利于菌体的生 长,对孢子培养基应该是有利于孢子 的生长。 3、起始接种物的传代问题 原则:使菌种的传代次数尽可能的少。 三、生产车间阶段 1、培养物的选择原则 在生产车间阶段,最终一般都是获得 一定数量的菌丝体。 2、培养基选择的原则 目的:获得一定数量和质量的菌体, 因此培养基的选择应首先考虑的是有 利于孢子的发育和菌体的生长,所以 营养要比发酵培养基丰富 在原料方面 不如实验室阶段那么精细,而是基本 接近于发酵,培养基,这有两个方面 的原因: 一是成本;二是驯化。 3、发酵级数的确定 一般由菌丝体培养开 始计算发酵级 数,但有时,工厂从第一级种子罐开 始计算发酵级数。 发酵级数确定的依据 ? 级数受发酵规模、菌体生长

特性、接种量的影响。 级数大,难控制、易染菌、 易变异,管理困难,一般 2~4 级。 ? 在发酵产品的放大中,反应级 数的确定是非常重要的一个方 面。 4、接种量的确定 移入种子的体积 接种量= ————————— 接种后培养液的体 积 5、种龄 种龄:是指种子罐中培养的菌体开始 移入下一级种子罐或发酵罐时的培养 时间。 种龄短:菌体太少;种龄长:易老化。 原则:对数生长期末,细胞活力强, 菌体浓度相对较大,但是最终由实验 结果定。 6、种子的质量要求 量:要求达到一定的浓度。 质: 菌丝形态、培养液外观 (生长处 于某个阶段、 均匀等等) 理化指标: C、 N、P 的含量,pH 值,酶活等。 四、影响种子质量的因素 $ 原材料质量 $ 培养条件 ? 温度 ? 湿度 ? 通气量 $ 斜面冷藏时间 第五章 生物反应器 第一节 生物反应基本知识 一、生物反应过程 (一)概述 1.生物反应 生物反应在狭义上是指活细胞中的各 种生物化学反应。广义的生物反应是 指生物体的新陈代谢过程。 2.影响生物反应的因素 环境温度、酸碱度、营养物质浓度、 氧气浓度、二氧化碳浓度、机械尺寸、 流体湍流程度、细胞的生长浓度、产 ?

物的生成速度等 3.代谢产物的产生 细胞在新陈代谢过程中不断地同化物 质和能量,并异化自身物质。细胞的 分解产物,部分能用于人类疾病的诊 断、预防和治疗。 (二)生物反应过程的氧气供给 1.氧气的传递过程 (1)氧的气液传递过程 空气被通入反应液后即分散成大量 气泡,氧分子从气泡内穿过气液界面 进入到反应液内成为溶解氧。 (2)氧的液固传递过程 溶解氧穿过液固界面进入细胞内的过 程。 2.提高氧气传递速度的途径 (1)增强搅拌 (2)提高通气速率 (3)控制反应液体积 (4)改善反应液的性质 二、生物反应器 (一)生物反应器的分类 1.生物反应器 ? 生物反应过程:由生物细胞或 生物体组成参与的生产过程, 统称为生物反应过程。 ? 生物反应器(bioreactor): 利用生 物催化剂为细胞培养或酶反应 提供良好的反应环境的设备。 包括发酵罐、酶反应器、处理 废水用反应器等。 ? 是生物反应过程中的关键设 备,在反应器中,通过产物的 合成,廉价的原料升了值。因 此,它的结构、操作方式和操 作条件对生物技术产品的质 量、转化率和能耗有着密切关 系。生物反应器的设计和操作, 就成为生物工程中一个极其重 要的问题。 优良发酵罐的设计: ? 严密的结构 ? 良好的气液固混合性能 ? 高的传质和传热速率

? 可靠的检测和控制仪表 ? 保证生物反应要求的前提下, 降低能耗 2.分类 (1)按反应器内有机体种类 微生物反应器 植物细胞反应器 动物 细胞反应器 酶反应器 (2)按结构特征 罐式反应器 管式反应器 塔式反应器 膜式反应器 (二)生物反应器的操作类型 1.简单分批培养 培养液一次性全部加 入,接种培养一段时间后,将培养液 一次性全部放出 2.补料分批培养 开始培养时,培养液 没有一次性加足,在培养一定时间后, 根据培养液营养成分的消耗情况将部 分营养成分连续加入反应器内(称之 为补料) ,培养结束后一次性全部放 出。 3.反复分批培养 在简单分批培养即将 结束时,放出大部分的培养液,余下 少量作为种子液,补充新鲜培养液后 再重新培养,如此反复直至培养不能 再延续时,再将发酵液全部放出。 4.反复补料分批培养 又称为半连续发 酵,指在补料分批培养中进行一段时 间、反应器内培养液体积达到最大无 法再继续补料时,将培养液放出一部 分,再继续补料,隔一段时间后再放 出同样体积,如此反复操作,直到最 后将培养液一次性全部放出。 第二节 发酵罐 发酵罐是微生物大量生长繁 殖的空间,是一类重要的生物反应器。 一、机械搅拌通风发酵罐 机械搅拌通风发酵罐的主要部件有罐 体、搅拌器、挡板、空气分布器、换 热器、消泡器、人孔、视镜等。 一)基本条件 适宜的径高比。 [高:直径约为 2.5~ 4] 能承受一定的压力。[水压试验(1.5 倍)]

搅拌通风装置要能使气泡分散细碎、 气液充分混合,保证发酵液必须的溶 解氧,提高 O2 的利用率 。 应具有足够的冷却面积。[代谢产热] 发酵罐内应抛光,尽量减少死角。[避 免积污、染菌] 轴封应严密,尽量减少泄漏。 二) 罐体的尺寸比例 H----柱体高 (m) HL---液位高度(m) D----罐内径 (m) d----搅拌器直径 s----两搅拌器的间距 B----最下一组搅拌器距罐底的距离 W----挡板宽度 H / D = 1.7 ~ 4 d / D = 1/2 ~ 1/3 W / D = 1/8 ~ 1/12 B / d = 0.8 ~1.0 (s/d)2 = 1.5 ~2.5 (s/d)3 = 1 ~2 二、气升式发酵罐 气升式发酵罐由罐体、导流筒、 循环管、空气喷嘴等部件组成。在气 升式发酵罐中没有机械搅拌器及相关 装置,采用高速气流和密度差带动发 酵液流动、混合。 三、自吸式发酵罐 不需要压缩空气,利用特殊 的机械搅拌吸气装置或液体喷射吸气 装置,将无菌空气吸入罐中,同时实 现发酵液的混合与溶氧传质。 四、鼓泡塔式发酵罐 鼓泡塔式发酵罐由塔体、筛板、 空气分布器、降液管组成 五、膜生物反应器(MBR) 膜生物反应器是一种可以控制微生物 的培养同时又可排出全部或部分培养 液,用指定成分的新鲜培养基来代替, 该过程通常是利用各种类型的聚合物 膜,建立一个液相不间断、固相为周 期性的培养微生物过程。从整体构造 上来看,MBR 是由膜组件和生物反应 器两部分组成。

第六章 灭菌与空气净化 染菌危害: 1.生物反应的基质因杂菌的消耗而损 失,造成生产能力的下降。 2.杂菌也会产生代谢产物, 这就使产物 的提取更加困难,造成得率降低,产 品质量下降。 3.有些杂菌会分解产物,使生产失败。 4.杂菌大量繁殖后,会改变反应液的 pH 值,使反应异常。 5.如果发生噬菌体污染, 生产菌细胞将 被裂解,使生产失败。 灭菌的措施:设备灭菌并确保无泄漏 所用培养基必须灭菌 通入的空气应经除菌处 理 种子无污染,确保纯种 培养过程中加入物料灭 菌处理 第一节 培养基灭菌 一、灭菌的原理和方法 消毒是指用物理或化学方法杀死 物料、容器、器具内外的病原微生物。 一般只能杀死营养细胞而不能杀死细 菌芽孢。例如,巴氏消毒法,是将物 料加热至 60℃维持 30min,以杀死不 耐高温的微生物营养细胞。 灭菌是用物理或化学方法杀死或 除去环境中所有微生物,包括营养细 胞、细菌芽孢和孢子。 消毒不一定能达到灭菌要求,而 灭菌则可达到消毒的目的。 除菌的方法 ? 培养基的加热灭菌 ? 空气的过滤除菌 ? 紫外线或电离辐射 ? 化学药物灭菌 1.化学试剂灭菌法 甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围:环境、皮肤及器械的表面 消毒 2.射线灭菌法 电磁波、紫外线或放射性物质 适用范围:无菌室、接种箱

3.干热灭菌法 常用烘箱,灭菌条件:160℃下保温 1h 适用范围:金属或玻璃器皿 4.湿热灭菌法 利用饱和蒸汽灭菌,条件:121℃, 30min 适用范围:生产设备及培养基灭菌 5.过滤除菌法 利用过滤方法阻留微生物 适用范围:制备无菌空气 6.烧灼灭菌法 火焰 适用范围:接种针、玻璃棒、三角瓶 口 二、培养基的湿热灭菌 湿热灭菌原理:蒸汽具有很强的穿透 能力,而且在冷凝时会放出大量的冷 凝热,很容易使蛋白质凝固而杀死各 种微生物。 灭菌条件:121℃,30min。 灭菌不利方面:同时会破坏培养基中 的营养成分,甚至产生不利于菌体生 长的物质。 (一)微生物热阻 致死温度:杀死微生物的极限温度。 致死时间:在致死温度下杀死全部微 生物所需要的时间。 热阻:微生物在某一特定条件下(主要 是温度)的致死时间,用于表示微生物 对热的抵抗力。 相对热阻:某一微生物在某一条件下 的致死时间与另一微生物在相同条件 下的致死时间之比。 (二)对数残留定律 ? 对数残留定律:湿热灭菌时, 微生物受热死亡的速率与残存 的微生物数量成正比。

N:培养基中残留活菌数,个 t:受热时间,min K:反应速率常数也称比死亡速率常数, min-1 注:1、k 越大,微生物越容易死亡

2、要达到彻底灭菌,即 N=0,所需时 间为无穷大,这在实际工作中是不可 能的,因此常采用 N=0.001,即灭菌的 失败概率为千分之一。 (三)培养基灭菌温度的选择 ? 实践证明:“高温瞬时灭菌法” 较好 (四) 培养基湿热灭菌方法 1、分批灭菌 ? 又叫实罐灭菌,也叫实消(空 消?) ,间歇灭菌,指将配置好 的培养基放在发酵罐中,通入 蒸气进行灭菌的过程。 ? 优点——无需专门灭菌设备, 投资少,设备简单,灭 菌效果可靠; 蒸气要求较低, 3*105~4*105。 ? 缺 点 —— 加 热 和 冷 却 时 间 较 长,营养成分有一定损失; 罐利用低;蒸气用量 变化大,造成锅炉负荷波动大。 适合中小型发酵罐及含有固体颗 粒或培养基有较多泡沫时适用 过程包括:升温、保温和冷却三阶段。 各阶段对灭菌的贡献: 20%、 75%、 5%。 2、连续灭菌 ? 连续灭菌:又叫连消,将配置 好的培养基在高温快速的情况 下,向发酵罐输送的同时经过 加温、保温、冷却的过程,进 行灭菌的。 ? 优点——可采用高温快速灭菌 工艺,营养成分破坏的少,有 利于提高发酵产率;蒸气用量 平稳,蒸汽压力高于 5*105Pa; 发酵罐利用率高;适于采用自 动控制,劳动强度小; 缺点——设备比较复杂,投资较 大;增加了连续灭菌设备及操作环节, 增加染菌几率 。 3. 固体培养基灭菌 ? 固体培养基:流动性差,不易 翻动,吸水加热易成团,冷却

困难 ? 常用转鼓式灭菌机 ? 转鼓以 0.5~1r/min 徐徐转动, 培养基得到翻动,蒸汽沿轴中 心通入加热培养基,达到一定 温度后,保温灭菌。 ? 适用于酒厂、酱油厂 (四) 影响培养基灭菌的因素 ? 污染杂菌的种类数量、灭菌温 度时间等 ? 培养基成分:油脂、糖、一定 浓度蛋白质 ? pH 值:pH6~8,微生物最耐热 ? 培养基的颗粒 ? 泡沫:泡沫中的空气形成隔热 层 第二节 空气净化(除菌) 一、发酵对空气无菌程度的要求 一般要求 1000 次使用周期中只允 许有一个菌通过,即经过滤后空气的 无菌程度为 N=10-3。 二、空气除菌的方法 (一) 辐射杀菌 (二) 热杀菌 (三) 静电除菌 (四) 过滤除菌 三、空气过滤除菌的原理与介质 1.过滤除菌的种类 绝对过滤:过滤介质的滤孔小于细胞 和孢子。 如聚乙烯醇缩甲醛树脂 (PVF)制成的 0.3 ?m 的微孔滤膜。 深层介质过滤:介质的孔隙一般大于 微生物细胞。如用棉花、玻璃纤维和 颗粒活性炭填充的过滤器。 2.深层介质过滤的原理 微粒随气流通过滤层时,由于滤 层纤维的层层阻碍,使气流出现无数 次改变运动速度和方向的绕流运动, 引起微粒与滤层纤维 间产生惯性冲 击、拦截、布朗扩散、重力沉降、静 电引力等作用把微粒滞留在纤维表面 上,实现过滤的目的。 空气的过滤除菌原理 ① 布朗扩散截留作用

② 拦截截留作用 ③ 惯性撞击截留作用 ④ 重力沉降作用 ⑤ 静电吸引作用 3. 空气过滤除菌介质 (1)纤维状或颗粒状过滤介质 (2)纸类过滤介质——超细玻璃纤 维纸 四、空气净化流程 提高空气的洁净度 经过空气压缩机 冷却后除去空气中油和水 总过滤器和分过滤器除菌 获得无菌空气 五、几种典型的空气净化流程 1. 两级冷却、加热除菌流程 这是一个比较完善的空气除菌流程, 可适应各种气候条件,能充分分离油 水,使空气达到较低的相对适度下进 入过滤器,以提高过滤效率。 2. 冷热空气直接混合式空气除菌流程 压缩空气从贮罐出来后分成两部分, 一部分进入冷却器,冷却到较低温度, 经分离器分离水、油雾后与另一部分 未处理的高温压缩空气混合,此时混 合空气已达到温度为 30~35℃,相对 湿度为 50~60%的要求,在进入过滤 器过滤。 3. 高效前置过滤空气除菌流程 采用高效率的前置过滤设备,利用压 缩机的抽吸作用,使空气先经中、高 效过滤后,再进入空气压缩机,降低 了主过滤器的负荷,所得的空气无菌 程度很高。 第七章 发酵工艺控制 第一节 温度变化及其控制 一、温度对生长的影响 不 同 微生物的生长对 温度的要求不 同,根据它们对温度的要求大致可分 为四类: 嗜冷菌适应于 0~26oC 生长, 嗜温菌适应于 15~43oC 生长, 嗜热菌 适应于 37~65oC 生长, 嗜高温菌适应 于 65oC 以上生长 每种微生物对温度的要求可用最适温

度、最高温度、最低温度来表征。在 最适温度下,微生物生长迅速;超过 最高温度微生物即受到抑制或死亡; 在最低温度范围内微生物尚能生长, 但生长速度非常缓慢,世代时间无限 延长。在最低和最高温度之间,微生 物的生长速率随温度升高而增加,超 过最适温度后,随温度升高,生长速 率下降,最后停止生长,引起死亡。 微生物受高温的伤害 比低温的伤害 大,即超过最高温度,微生物很快死 亡;低于最低温度,微生物代谢受到 很大抑制,并不马上死亡。这就是菌 种保藏的原理。 二、微生物与温度相关性的原理 1、微生物对温度的要求不同与它们的 膜结构物理化学性质有密切关系 根据细胞膜的液体镶嵌模型,细胞在 正常生理条件下,膜中的脂质成分应 保持液晶状态,只有当细胞膜处于液 晶状态,才能维持细胞的正常生理功 能,使细胞处于最佳生长状态 微生物的生长温度与细胞膜的液晶温 度范围相一致。 液晶状态是指某些有机物在发生固相 到液相转变时的过渡 状态称为液晶 态。 2、蛋白质结构 人们采用二种方案来研究酶在低温条 件下的结构完整性和催化功能:(1)通 过自然或诱导突变,将特定残基发生 改变的蛋白与其天然结构进行对比; (2) 对比同属嗜热、嗜温及嗜冷菌的蛋白 结构 3、蛋白质合成 嗜冷菌具有在 0oC 合成蛋白质的能 力。这是由于其核糖体、酶类以及细 胞中的可溶性因子等对低温的适应, 蛋白质翻译的错误率最低。许多中温 菌不能在 OoC 合成蛋白质,一方面是 由于其核糖体对低温的不适应,翻译 过程中不能形成有效的起始复合物, 另一方面是由于低温下细胞膜的破坏 导致氨基酸等内容物的泄露。

4、合成冷休克蛋白 低温微生物适应低温的另一机制 是 合 成冷休克蛋白。 将大肠杆菌从 37oC 突然转移到 10oC 条件时细胞中 会诱导合成一组冷休克蛋白,它们对 低温的生理适应过程中发挥着重要作 用,检测嗜冷酵母的冷休克反应,发 现冷刺激后冷休克蛋白在很短时间内 大量产生。 耐冷菌由于生活在温度波动的环 境中,它们必须忍受温度的快速降低, 这与它们产生的冷休克蛋白是密切相 关的。 二、温度的影响与控制 (一)温度对发酵的影响 1、温度对微生物细胞生长的影响 发酵过程的反应速率实际是酶反应速 率,酶反应有一个最适温度。 从阿累尼乌斯方程式可以看到 dlnKr/dt=E/RT2
r2 r1 积分得 E= 1 / T1 ? 1 / T 2 E——活化能 Kr——速率常数 2.温度对产物形成的影响 3.温度影响发酵液的物理性质 温度还可以通过改变发酵液的物 理性质,间接影响微生物的生物合成。 如:温度对氧在发酵液中的溶解度就有 很大的影响。 4、温度影响生物合成的方向 四环素产生菌金色链霉菌同 时产生金霉素和四环素,当温度低于 30oC 时, 这种菌合成金霉素能力较强; 温度提高,合成四环素的比例也提高, 温度达到 35oC 时, 金霉素的合成几乎 停止,只产生四环素。 温度还影响基质溶解度,氧在 发酵液中的溶解度也影响菌对某些基 质的分解吸收。因此对发酵过程中的 温度要严格控制。 三、发酵过程引起温度变化的因素 (一)发酵热 Q 发酵 发酵热是引起发酵过程温度变化的原 因。 所谓发酵热就是发酵过程中释放出来

4 . 6 log K

/K

的净热量。什么叫净热量呢?在发酵 过程中产生菌分解基质产生热量,机 械搅拌产生热量,而罐壁散热、水分 蒸发、空气排气带走热量。这各种产 生的热量和各种散失的热量的代数和 就叫做净热量。发酵热引起发酵液的 温度上升。发酵热大,温度上升快, 发酵热小,温度上升慢。 现在来分析发酵热产生和散失的各因 素。 1、生物热 Q 生物 在发酵过程中,菌体不断利用 培养基中的营养物质,将其分解氧化 而产生的能量,其中一部分用于合成 高能化合物(如 ATP)提供细胞合成 和代谢产物合成需要的能量,其余一 部分以热的形式散发出来,这散发出 来的热就叫生物热。 ? 培养过程中生物热的产生具有 强烈的时间性。 生物热的大小与呼吸作用强弱有关 在培养初期,菌体处于适应期, 菌数少,呼吸作用缓慢,产生热量较 少。 菌体在对数生长期时,菌体繁 殖迅速,呼吸作用激烈,菌体也较多, 所以产生的热量多,温度上升快,必 须注意控制温度。 培养后期,菌体已基本上停止 繁殖,主要靠菌体内的酶系进行代谢 作用,产生热量不多,温度变化不大, 且逐渐减弱。 如果培养前期温度上升缓慢, 说明菌体代谢缓慢,发酵不正常。如 果发酵前期温度上升剧烈,有可能染 菌,此外培养基营养越丰富,生物热 也越大。 2、搅拌热 Q 搅拌 在机械搅拌通气发酵罐中,由 于机械搅拌带动发酵液作机械运动, 造成液体之间,液体与搅拌器等设备 之间的摩擦,产生可观的热量。搅拌 热与搅拌轴功率有关,可用下式计算: Q 搅拌=P×860×4186.8(焦耳/

小时) P——搅拌轴功率 4186.8——机械能转变为热能的 热功当量 3、蒸发热 Q 蒸发 通气时,引起发酵液的水分蒸 发,水分蒸发所需的热量叫蒸发热。 此外, 排气也会带走部分热量叫显热 Q 显热,显热很小,一般可以忽略不计。 4、辐射热 Q 辐射 发酵罐内温度与环境温度不 同,发酵液中有部分热通过罐体向外 辐射。辐射热的大小取决于罐温与环 境的温差。冬天大一些,夏天小一些, 一般不超过发酵热的 5%。 Q 发酵=Q 生物+Q 搅拌-Q 蒸发-Q 辐射 (二)发酵热的测定 有二种发酵热测定的方法。一种 是 用 冷却水进出口温 度差计算发酵 热。在工厂里,可以通过测量冷却水 进出口的水温,再从水表上得知每小 时冷却水流量来计算发酵热。 Q 发酵=GCm(T 出-T 进) Cm——水的比热 G——冷却水流量 四、最适温度的选择 1、根据菌种及生长阶段选择 微生物种类不同,所具有的酶系及其 性质不同,所要求的温度范围也不同。 如黑曲霉生长温度为 37oC, 谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为 30~32oC, 青霉菌生长温度为 30oC。 ? 根据生长阶段选择 在发酵前期由于菌量少,发酵目 的是要尽快达到大量的菌体,取稍高 的温度,促使菌的呼吸与代谢,使菌 生长迅速; 在中期菌量已达到合成产物的 最适量,发酵需要延长中期,从而提 高产量,因此中期温度要稍低一些, 可以延緩衰老。因为在稍低温度下氨 基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关

闭得比较严密有利于产物合成。 发酵后期,产物合成能力降低, 延长发酵周期没有必要,就又提高温 度,刺激产物合成到放罐。如四环素 生长阶段 28oC,合成期 26oC 后期再 升温;黑曲霉生长 37oC,产糖化酶 32~34oC。但也有的菌种产物形成比 生长温度高。如谷氨 酸产生菌生长 30~32oC,产酸 34~37oC。最适温度 选择要根据菌种与发酵阶段做试验。 ? 根据生长阶段选择温度 2、根据培养条件选择 温度选择还 要根据培 养条件综合考 虑,灵活选择。 通气条件差时可适当降低温度,使菌 呼吸速率降低些,溶氧浓度也可髙些。 培养基稀薄时,温度也该低些。因为 温度高营养利用快,会使菌过早自溶。 3、根据菌生长情况 菌生长快,维持在较高温度时间要短 些;菌生长慢,维持较高温度时间可 长些。培养条件适宜,如营养丰富, 通气能满足,那么前期温度可髙些, 以利于菌的生长。 总的来说,温度的选择根据菌种生长 阶段及培养条件综合考虑。要通过反 复实践来定出最适温度。 五、利用温度控制提高产量 思考题 1。 发酵热的定义 2。 生物热的大小与哪些因素有关? 3。 温度对发酵有哪些影响? 4。 发酵过程温度的选择有什么依 据? 第二节 pH 对发酵的影响及控制 一、发酵过程 pH 变化的原因 1、基质代谢 (1)糖代谢 特别是快速利用的 糖, 分解成小分子酸、 使 pH 下降。 醇, 糖缺乏,pH 上升,是补料的标志之一 (2)氮代谢 当氨基酸中的-NH2 被利用后 pH 会下降;尿素被分解成 NH3, 上升, pH NH3 利用后 pH 下降,

当碳源不足时氮源当碳源利用 pH 上 升。 (3)生理酸碱性物质利用后 pH 会上 升或下降 ? 生理碱性物质 有机氮源和某些无机氮 源的 代谢、玉米浆中的乳酸被氧化后可使 pH 上升,这些物质被称为生理碱性物 质。 ? 生理酸性物质 碳源的代谢,如糖类不完全氧 化时产生的有机酸,脂肪不完全氧化 产生的脂肪酸,或者某些铵盐氧化后 产生的硫酸等,可使 pH 下降,这些物 质被称为生理酸性物质。 2、产物形成 某些产物本身呈酸性或碱性,使发酵 液 pH 变化。如有机酸类产生使 pH 下 降,红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗 生素呈碱性,使 pH 上升。 3、菌体自溶,pH 上升,发酵后期, pH 上升。 引起发酵液 pH 值变化的常见因素 (1)下降 ? ①培养基中 C/N 不当, 有机酸积累; ? ②消沫油加得过多; ? ③生理酸性物质过多; (2)上升 ? ①C/N 比例不当,N 过 多,氨基氮释放; ? ②生理碱性物质过多; ? ③中间补料时碱性物加 入量过大; 二、pH 对发酵的影响 (1)pH 影响酶的活性。当 pH 值抑制 菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢 受阻 (2)pH 值影响微生物细胞膜所带电 荷的改变,从而改变细胞膜的透性, 影响微生物对营养物质的吸收及代谢 物的排泄,因此影响新陈代谢的进行 (3)pH 值影响培养基某些成分和中 间代谢物的解离,从而影响微生物对

这些物质的利用 (4)pH 影响代谢方向 pH 不同, 往往引起菌体代谢过程不同, 使代谢产物的质量和比例发生改变。 例如黑曲霉在 pH2~3 时发酵产生柠檬 酸,在 pH 近中性时,则产生草酸。 谷氨酸发酵,在中性和微碱性条件下 积累谷氨酸,在酸性条件下则容易形 成谷氨酰胺和 N-乙酰谷氨酰胺 (5)pH 影响菌体的形态 如:产黄青霉细胞壁的厚度和菌丝的 长度均随 pH 的变化而变化。 (6)pH 影响产物的稳定性 三 发酵过程中 pH 值的调节及控制 1) 发酵 pH 值的确定(范围,时间) ? 一般是在 5~8 之间,如谷氨酸 发酵的最适 pH 值为 7.5~8.0。 ? 随菌种和产品不同而不同。同 一菌种, 生长最适 pH 值可能与 产物合成的最适 pH 值是不一 样的。 ? 按发酵过程的不同阶段分别控 制不同的 pH,使产量最大。 2)最佳 pH 的确定 配制不同初始 pH 的培养基, 摇瓶考察 发酵情况 3)发酵 pH 的控制 (1)调节好基础料的 pH。关键 是生理酸性物质与生理碱性物质的配 比,基础料中若含有玉米浆,pH 呈酸 性,必须调节 pH。若要控制消后 pH 在 6.0,消前 pH 往往要调到 6.5~6.8 (2) 在基础料中加入维持 pH 的物质, 如 CaCO3 ,或具有缓冲能力的试剂, 如磷酸缓冲液等 (3)通过补料调节 pH 在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行 补料。 在补料与调 pH 没有矛盾时采用 补料调 pH 如(1)调节补糖速率,调节空气流量 来调节 pH (2)当 NH2-N 低,pH 低时补氨水; 当 NH2-N 低,pH 高时补(NH4)2SO4 (4)当补料与调 pH 发生矛盾时,加

酸碱调 pH 应急措施: ? 改变搅拌转速或通气量,以改 变溶解氧浓度,控制有机酸的 积累量及其代谢速度; ? 改变温度,以控制微生物代谢 速度; ? 改变罐压及通气量,降低 CO2 的溶解量; ? 改变加油或加糖量等,调节有 机酸的积累量; (5)不同调 pH 方法的影响 pH 值调节和控制的方法 1、调节培养基的原始 pH 值,或加缓 冲溶液(如磷酸盐)制成缓冲能力强、 pH 值变化不大的培养基,或使盐类和 碳源的配比平衡。 2、可在发酵过程中加入弱酸或弱碱进 行 pH 值的调节, 进而合理地控制发酵 条件;也可通过调整通风量控制 pH 值。 3、采用生理酸性铵盐作为氮源时,由 于 NH+4 被微生物细胞利用后,剩下 的酸根会引起发酵液 pH 值的下降, 在 培养液中可加入碳酸钙来调节 pH 值。 但是需要注意的是,碳酸钙的加入量 一般都很大,在操作上很容易引起染 菌。因此,此方法在发酵过程中应用 不是太广 。 4、在发酵过程中根据 pH 值的变化可 用加氨水的方法来调节,同时又可把 氨水作为氮源供给。由于氨水作用快, 对发酵液的 pH 值波动影响大, 应采用 少量多次的流加方法进行流加,以免 造成 pH 值过高, 从而抑制微生物细胞 的生长,或 pH 值过低,NH+4 不足等 现象。具体的流加方法应根据微生物 的特性、发酵过程的菌体生长情况、 耗糖情况等来决定, 一般控制在 pH 值 7.0-8.0, 最好是采用自动控制连续流加 方法 。 5、如果仅用酸或碱调节 pH 值不能改 善发酵情况时,进行补料是一个较好 的办法,它既调节了培养液的 pH 值,

又可补充营养,增加培养液的浓度和 减少阻遏作用,进一步提高发酵产物 的产率。 通过补料调节 pH 值来提高发 酵产率的方法已在工业发酵过程中取 得了明显的效果。 6、以尿素作为氮源进行流加调节 pH 值,是目前国内味精厂普遍采用的方 法。 尿素流加引起的 PH 值变化有一定 的规律性,易于控制操作。由于通风、 搅拌和微生物细胞内脲酶的作用使尿 素分解放出氨,使 pH 值上升;同时氨 和培养基中的营养成分被微生物利用 后和补充氮源。当流加尿素后,尿素 被微生物的脲酶分解放出氨, pH 值 使 上升,氨被微生物利用和形成代谢产 物,使 pH 值降低,再次反复进行流加 就可维持一定的 pH 值。 流加时除主要 根据 pH 值的变化外, 还应考虑到微生 物细胞的生长、发酵过程耗糖、代谢 等不同的阶段采取少量多次流加,以 控制合适的发酵 pH 值 。 思考题 1. 发酵过程中 pH 会不会发生变化为 什么? 2. pH 对发酵的影响表现在哪些方 面? 3. 为了确定发酵的最佳 pH,我们该如 何实验? 4. 发酵过程的 pH 控制可以采取哪些 措施? 第三节 氧对发酵的影响 (一)氧的传递 ? 1、氧传递的各种阻力 氧气从气泡传递至细胞内,需要克服一 系列阻力 供氧方面的阻力 耗氧方面的阻力 2、氧的传递方程式: OTR=KLa(C*-CL) ? OTR—单位体积培养液中的氧 传递速率[mol/(m3· s) ? a-比表面积(m2/m3) ? KL-以氧浓度为推动力的总传 递系数(m/s) ? C*-与气体主体氧分压平衡的

液相氧浓度( mol/m3) ? CL-液相主体氧浓度 (mol/m3) ? 容积传递系数--KLa ? 可用于测定发酵罐的通气能 力,在实验条件下 KLa 越大则 说明系统的通气能力越强。 C cQO 稳定状态时
K La ?
2

Cc——菌体细胞的浓度(g/L) QO2—— 微 生 物 的 呼 吸 强 度 [mol/(kg· s)] C*-CL→推动力 (二)影响微生物对氧需求的因素 ? 微生物的耗氧速度常用单位质 量的细胞(干重)在单位时间 内消耗氧的量,即比耗氧速率 (或呼吸强度)来表示。
Q O 2 ? (Q O 2 ) m CL K0 ? CL

C ? CL

?

Q O2 (Q O 2 ) m

——比耗氧速率(或呼吸 强度) [mol/(kg· s)] —— 最 大 比 耗 氧 速 率 [mol/(kg· s)] k0——氧的米氏常数(mol/m3) CL——溶解氧浓度(mol/m3) ? 摄氧率:单位体积培养液,在 单位时间内消耗的氧量。 ? r=QO2?X ? r—摄氧率[mol/(kg· s)] ? X—细胞浓度(kg/m3) ? 各种微生物的呼吸强度是不同 的,并且呼吸强度是随着培养 液中溶解氧浓度的增加而加 强,直至达到一个临界值为止。 这个临界值称为“临界氧浓度” (CCr) ? 临界氧浓度(CCr):一般指不影 响菌体呼吸所允许的最低氧浓 度。

一般对于微生物: CCr: =1~25%饱 和浓度 影响摄氧率的因素 ? ①细胞浓度直接影响:在分批 发酵过程中,在对数生长期的 后期达到峰值。 ? ②培养基的成分和浓度显著影 响摄氧率。 ? ③另外,微生物呼吸强度的临 界值还与一些培养条件如 PH 值、温度有关。 (三)影响供氧的因素 OTR=KLa(C*-CL) ? 推动力 ? 容积传递系数 ? 发酵罐高度、发酵液体积及物 理性质 1、 影响 KLa 的因素 (1) 搅拌 ? 搅拌器:可将通入培养液的空 气打散成细小的气泡; ? 使液体形成涡流延长气泡在液 体中的停留时间; ? 增加液体的湍动程度减少气泡 外滞流液膜的厚度; ? 使培养液中的成分均匀分布。 (2) 空气流量 ? K La 值随着空气流量的增加而 增加,但并非没有限度。如果 超过这一限度,搅拌器就不能 有效地将空气泡分散到液体 中,而在大量空气泡中空转, 发生“过载”现象。 (3)培养液性质的影响 ? 培养液的密度、黏度、表面张 力、扩散系数等影响 KLa ? 例:液体的黏度增大时,由于 滞流液膜厚度增加,传质阻力 就增大,同时黏度也影响扩散 系数,致使通气效率降低。 (4)微生物生长的影响 ? 发酵液中细胞浓度的增加,K La 值逐渐变小。 ? 菌丝体的形态不同也明显影响

K La 值。 例如:球状菌悬液的 K La 值是相同 浓度丝状菌悬液的 2 倍。 (5) 消沫剂的影响 ? 消沫剂分布在气液界面,增大 传递阻力,使 K L 下降。 (6) 离子强度的影响 ? 电解质溶液中生成的气泡比在 水中的要小的多,a 较大。在同 样条件下,电解质溶液的 K La 值比水中的大。 ? 并且随着电解质浓度的增加, K La 值也有较大的增加。 2、 影响推动力的因素 OTR=KLa(C*-CL) 提高推动力实际上是增加氧的饱和 度 C* ? 在水中,氧的溶解度随温度的 升高而降低; ? 在溶液中,氧的溶解度随溶质 浓度的增加而下降; ? 提高发酵罐罐压; ? 提高空气中的氧分压。 富氧通气——用纯氧来增加氧分 压的方法,如深冷分离法,吸附分离 法,膜分离法。 小 结: 理解氧传递的各种阻力 掌握氧的传递方程式: OTR=KLa (C* -CL) 掌握比耗氧速率、摄氧率、临界氧浓 度(CCr)等概念 熟悉影响供氧的因素、影响发酵罐中 Kla 的因素、影响推动力的因素 第四节 CO2 对发酵的影响及控制 二氧化碳 ? 微生物的代谢产物 ? 合成产物的一种基质 ? 反映微生物生长和发酵状况, 可通过碳质量平衡来估算菌体 生长速率和细胞量。 ? 溶解在发酵液中的 CO2 对氨基 酸、抗生素等微生物发酵具有 抑制和刺激作用,对许多产物

的生产菌亦有影响。 一、CO2 对发酵的影响 1 CO2 对菌体生长的影响 ? CO2 对菌体生长的作用:直接 影响——排出 CO2 高于 4%时, 碳水化合物的代谢及微生物的 呼吸速率下降。 2 CO2 影响产物形成 ? CO2 影响产物形成:阻碍基质 分解和 ATP 生成,影响产物的 合成。 3 CO2 影响菌体形态 产黄青霉菌接种到溶解不同 CO2 浓度 的培养基中,发现: ? CO2 分压 0~8%时,菌丝主要 是丝状; ? CO2 分压 15%~22%, 则膨胀, 粗短的菌丝占优势; ? CO2 为 0.008 MPa 时,则出现 球状或酵母状细胞,致使青霉 素合成受阻,其比生成速率降 低 40%左右。 4 CO2 对细胞的作用机制 ? CO2 作用在细胞膜的脂肪核心 部位。 ? HCO3-影响磷脂,亲水头部带 电荷表面及细胞膜表面的蛋白 质。 当细胞膜的脂质相中 CO2 浓度达临界值时,使膜的流动性及表 面电荷密度发生变化,导致许多基质 的膜运输受阻,影响细胞膜的运输效 率, 使细胞处于“麻醉”状态, 细胞生长 受到抑制,形态发生改变。 5 CO2 对发酵环境的影响 ? 大发酵罐中 CO2 的分压是液体 深度的函数,10 m 深的发酵罐 在 0.101 MPa 气压下操作, 底部 CO2 分压是顶部 CO2 分压的 2 倍。如不提高搅拌转数,CO2 就不易排出,在罐底形成碳酸, 进而影响菌体的呼吸和产物的 合成。

? 为了排除 CO2 的影响,必须考 虑 CO2 在培养液中的溶解度、 温度及通气情况。CO2 溶解度 大,对菌生长不利。采用增加 罐压的方法来消泡会增加 CO2 的溶解度。 二、 CO2 浓度的控制 ? CO2 在发酵液中的浓度大小受 到许多因素的影响:菌体呼吸 强度、发酵液流变学特性、通 气搅拌程度、外界压力大小、 设备规模大小也有影响。 ? CO2 浓度控制应随它对发酵的 影响而定。 CO2 抑制产物合成:降低浓 度; CO2 促进产物合成:提高浓 度。 ? 通气搅拌调节 CO2 的溶解度: ? 调节罐压也可影响 CO2 的浓 度,对菌体代谢和其他参数也 产生影响。 ? CO2 形 成 的 碳 酸 , 可 用 除 CaCO3 以外的碱来中和。 思考题 ? 二氧化碳对发酵的影响有哪 些? ? 控制二氧化碳的方法有哪些? 第五节 泡沫对发酵的影响与控制 1 泡沫的产生、性质及变化 形成条件: ? 气-液两相共存; ? 表面张力大的物质存 在; 发酵过程中泡沫有两种类型: ? 一种是发酵液液面上的泡沫, 气相所占的比例特别大,与液 体有较明显的界限,如发酵前 期的泡沫; ? 另一种是发酵液中的泡沫,又 称流态泡沫(fluid foam), 分散在 发酵液中,比较稳定,与液体 之间无明显的界限。 △G=γ △A

△G——自由能的变化 △A——表面积的变化 γ ——比表面能 2 发酵过程泡沫产生的原因 (1)通气搅拌的强烈程度 发酵前期培养基成分丰富,易起泡。 ? 采用较小通气量及搅拌转速, 再逐步加大。 ? 也可在基础料中加入消泡剂。 (2)培养基配比与原料组成 前期培养基营养丰富粘度大,产泡沫 多而持久。 (3)菌种、种子质量和接种量 菌种质量好,生长速度快,可溶性氮 源较快被利用,泡沫产生几率也就少。 菌种生长慢的可以加大接种量 (4)灭菌质量 培养基灭菌质量不好,糖氮被破坏, 抑制微生物生长,使种子菌丝自溶, 产生大量泡沫,加消泡剂也无效。 泡沫的形成一般有以下几种规律: ? 整个发酵过程中,泡沫保持恒 定的水平; ? 发酵早期,起泡后稳定地下降, 以后保持恒定; ? 发酵前期,泡沫稍微降低后又 开始回升; ? 发酵开始起泡能力低,以后上 升; 泡沫体系的三阶段变化 (1) 气泡大小分布的变化 (2)气泡液膜变薄 (3)泡沫破灭 影响泡沫稳定性的因素 1)泡径大小 大泡易于破灭,寿命较长的的都是小 泡。 因为: ? 泡越小,合并成大气泡的历程 就越长; ? 小气泡的泡膜中所含液量相对 比较大,所以较能经受液体流 失所造成的稳定性的损失; ? 气泡越小,上升速度越慢,给

表面活性剂的吸附提供充足的 时间,增加了稳定性。 2)溶液所含助泡物的类型和浓度 (1)降低表面张力 降低表面 张力会降低相 邻气泡间的压差。压差小,小泡并入 大泡的速度就慢,泡沫的稳定性就好。 (2)增加泡沫弹性 助泡的表面活性剂,吸附 在气液界面上,使表面层的组分与液 相组分产生差别,因而使泡沫液具有 弹性。 (3)助泡剂浓度 溶液中助泡剂浓度增加,气液 界面上的吸附量就增加,液膜弹性随 之增加,泡沫稳定性增高。 到达临界胶束浓度后,气液界 面上的定向排列“饱和”, 弹性不会再增 加。 4)起泡液的粘度 某些溶液,如蛋白质溶液,虽然 表面张力不高,但因粘度很高,所产 生的泡沫非常稳定。因为粘稠的液膜, 有助于吸收外力的冲击,起到缓冲的 作用,使泡沫能持久一些。液体粘度 对泡沫稳定性的影响比表面张力的影 响还要大。 5)其它 *温度 表面张力最低值时的浓度随 温度变化。 *pH 影响助泡剂的溶解度和表层 的吸附状态 *表面电荷 离子型表面活性剂,由 于离子间静电的排斥,阻碍着离子彼 此接近,减少排液速度,延缓泡沫变 薄过程,使泡沫稳定。 3 泡沫对发酵的影响 1)降低生产能力 在发酵罐中,为了容纳泡沫,防止溢 出而降低装量,装料系数一般为 0.6~ 0.7。 2)引起原料浪费 如果设备容积不能留有容纳泡沫的余 地,气泡会引起原料流失,造成浪费。

3) 影响菌的呼吸 如果气泡稳定,不破碎, 那么随着微生物的呼吸,气泡中充满 二氧化碳,而且又不能与空气中氧进 行交换,这样就影响了菌的呼吸。 4) 引起染菌 由于泡沫增多而引起逃液,于 是在排气管中粘上培养基,就会长菌。 随着时间延长,杂菌会长入发酵罐而 造成染菌。大量泡沫由罐顶进一步渗 到轴封,轴封处的润滑油可起点消泡 作用,从轴封处落下的泡沫往往引起 杂菌污染。 泡沫的消长规律 (1)不同搅拌速度和通气量对泡沫产 生的影响。 (2)与培养基所用原材料性质有关。 4 泡沫的消除和防止 ? 主要包括机械消沫和消沫剂消 沫。 ? 调整培养基的成分或改变某些 物理化学参数或改变发酵工艺 来控制减少泡沫的形成。 ? 也可从菌种的选育方面考虑。 (1)机械方法消沫 ? 靠机械的强烈振动或压力的变 化促使泡沫破碎。 ? 方法一:在罐内将泡沫消除, 另一种:将泡沫引出罐外 ? 优点:不需引入外来物质,节 省原材料,减少杂菌污染,减 少培养液性质的变化,对提取 工艺无副作用。 ? 缺点:效率不高,对黏度较大 的流态型泡沫几乎没有作用, 也不能消除引起泡沫稳定的根 本原因。 (2) 消沫剂消沫 ? 消沫剂:表面活性物质。 ? 使用最多的消沫剂天然油脂、 聚醚类、高级醇、硅酮类等 思考题 1.发酵中泡沫形成的原因是什么? 2. 泡沫的危害?

3.消除泡沫的方法? 第六节 染菌的防治 一、染菌的影响 发酵过程污染杂菌,会严重的影响生 产,是发酵工业的致命伤。 ? 造成大量原材料的浪费,在经 济上造成巨大损失 ? 扰乱生产秩序,破坏生产计划。 ? 遇到连续染菌,特别在找不到 染菌原因往往会影响人们的情 绪和生产积极性。 ? 影响产品外观及内在质量 (一)染菌对发酵的影响 生产不同的品种,可污染不同种类和 性质的微生物。 不同污染时间,不同污染途径,污染 不同菌量,不同培养基和培养条件又 可产生不同后果 1、发酵染菌对不同品种的影响 2、污染不同种类和性质的微生物的影 响 (1)污染噬菌体 噬菌体的感染力很强,传播蔓延 迅速,也较防治,故危害极大。污染 噬菌体后,可使发酵产量大幅度下降, 严重的造成断种,被迫停产。 (2)污染其它杂菌 有些杂菌会使生产菌自溶产生 大量泡沫,即使添加消泡剂也无法控 制逃液,影响发酵过程的通气搅拌。 有的杂菌会使发酵液发臭、发酸,致 使 pH 下降,使不耐酸的产品破坏。特 别是染芽孢杆菌,由于芽孢耐热,不 易杀死,往往一次染菌后会反复染菌。 3、不同时间染菌对发酵的影响 污染时间是指用无菌检测方法确准的 污染时间,不是杂菌窜入培养液的时 间。 杂菌进入培养液后,需有足够的生长、 繁殖的时间才能显现出来,显现的时 间又与污染菌量有关。污染的菌量多, 显现染菌所需的时间就短,污染菌量 少,显现染菌的时间就长。 (1)种子培养期染菌

由于接种量较小,生产菌生长一开始 不占优势,而且培养液中几乎没有抗 生素(产物)或只有很少抗生素(产 物) 。因而它防御杂菌能力低,容易污 染杂菌。如在此阶段染菌,应将培养 液全部废弃。 发酵前期最易染菌,且危害最大。 原因 发酵前期菌量不很多,与杂 菌没有竞争优势; 且还未合成产物 (抗 生素)或产生很少,抵御杂菌能力弱。 在这个时期要特别警惕以制止染菌的 发生。 染菌措施 可以用降低培养温度, 调整补料量,用酸碱调 pH 值,缩短培 养周期等措施予以补救。如果前期染 菌,且培养基养料消耗不多,可以重 新灭菌,补加一些营养,重新接种再 用。 (3)发酵中期染菌 发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代 谢。杂菌大量产酸,培养液 pH 下降; 糖、氮消耗快,发酵液发粘,菌丝自 溶,产物分泌减少或停止,有时甚至 会使已产生的产物分解。有时也会使 发酵液发臭,产生大量泡沫。 措施 降温培养,减少补料,密切 注意代谢变化情况。如果发酵单位到 达一定水平可以提前放罐,或者抗生 素生产中可以将高单位的发酵液输送 一部分到染菌罐,抑制杂菌。 (4)发酵后期染菌 发酵后期发酵液内已 积累大量的产 物,特别是抗生素,对杂菌有一定的 抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多, 对生产影响不大。如果染菌严重,又 破坏性较大,可以提前放罐。 (二)发酵染菌对提炼和产品质量的 影响 1、发酵染菌对过滤的影响 染菌的发酵液一般发粘,菌体大多数 自溶,所以在发酵液过滤时不能或很 难形成滤饼,导致过滤困难。即使采 取加热、冷却、添加助滤剂等措施, 使部分蛋白质凝聚,但效果并不理想。

2、发酵染菌对提炼的影响 染菌发酵液中含有比正常发酵液更多 的水溶性蛋白和其它杂质。 采用有机溶剂萃取的提炼工艺,则极 易发生乳化,很难使水相和溶剂相分 离,影响进一步提纯。 采 用 直接用离子交换 树脂的提取工 艺,如链霉素、庆大霉素,染菌后大 量杂菌黏附在离子交换树脂表面,或 被离子交换树脂吸附,大大降低离子 交换树脂的交换容量,而且有的杂菌 很难用水冲洗干净,洗脱时与产物一 起进入洗脱液,影响进一步提纯。 二、染菌的原因 (一)发酵染菌率计算基准 总染菌率指一年发酵染菌的批(次) 数与总投料批(次)数之比的百分率。 染菌批次数应包括染菌后培养基经重 新灭菌,又再次染菌的批次数在内。 这是习惯的计算方法,也是我国的统 一计算方法。
发酵染菌批(次)数

总染菌率%= 总投料批(次)数

*100%

1、设备渗漏 设备渗漏包括夹套穿孔、 盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、 搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。 从日本工业技术院发酵研究所对染菌 原因分析发现,这类染菌占 33.85%, 上海三厂的分析这类染菌为 37.5%。 所以说加强设备本身及附属零部件的 严密度检查,对制服染菌是极其主要 的,也是重要的。 2、空气带菌 因为空气除菌系统较为 复杂,环节多,偶遇不慎便会导致空 气除菌失败。 3、种子带菌 种子带菌又分为种子本 身带菌和种子培养过程中染菌。加强 种子管理,严格无菌操作,种子本身 带菌是可以克服的。种子培养过程染 菌与发酵一样有许多因素造成。 4、灭菌不彻底 灭菌技术的好坏与灭 菌质量很有关系 5、技术管理不善 技术管理就是要对

发酵每个环节严格控制,发酵中稍有 不慎就可能染菌,所以不能有侥幸心 理而放松管理 三、无菌状况的检测 1、环境无菌的检查 尘埃粒子检测 无菌平板检测 2、种子及发酵液无菌状况检测 酚红肉汤培养基检测 平板划线 显微镜观察 四、染菌情况分析 染菌的原因有多种,对于实际情况如 何分析呢? 1、单罐染菌 不是系统问题,而是该罐本身的问题。 如种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐 有渗漏、分过滤器失效 2、多罐染菌 系统问题,如空气过滤系统有问题, 特别是总过滤器长期没有检查,可能 受潮失效;移种或补料的分配站有渗 漏或灭菌不彻底 3、前期染菌 种子带菌、培养基灭菌不彻底 4、中后期染菌 补料的料液灭菌不彻底或补料管道、 阀门渗漏,一般不会是种子问题 五、染菌的防止 1、防止种子带菌 ? 制备种子时对沙土管及摇瓶严 格加以控制。 ? 沙土制备时要多次间歇灭菌 ? 注意接种时的无菌操作 ? 子瓶、母瓶的移种和培养 ? 无菌室和摇床间都要保持清 洁。无菌室内要供给恒温恒湿 的无菌空气,还要装紫外灯用 以灭菌,或用化学药品灭菌。 2、防止设备渗漏 发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化 学腐蚀,物料与设备摩擦造成机械磨 损以及加工制作不良等原因会导致设 备及附件渗漏。

设备上一旦渗漏,就会造成染菌,例 如冷却盘管、夹套穿孔渗漏,有菌的 冷却水便会通过漏孔而进入发酵罐中 招致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空 气或水进入发酵罐而造成染菌。 设备上的漏隙如果肉眼能看见,容易 发现,也容易治理;但有的微小泄漏, 肉眼看不见,必须通过一定的试漏方 法才能发现 。 3、防止培养基灭菌不彻底 培养基灭菌方法——高压蒸汽灭菌 分批灭菌 1210C,30 分钟 连续灭菌 罐温 125-1300C,30 -45 分钟 4、防止空气引起的染菌 5、发酵染菌后的措施 ? 染菌后的培养基必须灭菌后才 可放下水道。灭菌方法:可通 蒸汽灭菌,也可加入过氧乙酸 等化学灭菌剂搅拌半小时,才 放下水道。否则由于各罐的管 道相通,会造成其它罐的染菌, 而且直接放下水道也会造成空 气的污染而导致其它罐批染 菌。 ? 凡染菌的罐要找染菌的原因, 对症下药,该罐也要彻底清洗, 进行空罐消毒,才可进罐。 ? 染菌厉害时,车间环境要用石 灰消毒,空气用甲醛熏蒸。特 别,若染噬菌体,空气必须用 甲醛蒸汽消毒。 四、染噬菌体的防治 (一)染噬菌体对发酵的影响 发酵过程中如果受噬菌体的侵染,一 般发生溶菌,随之出现发酵迟缓或停 止,而且受噬菌体感染后,往往会反 复连续感染,使生产无法进行,甚至 使种子全部丧失。 (二)产生噬菌体的原因 通常在工厂投产初期并不感到噬菌体 的危害,经过 1~2 年以后,主要是由 于生产和试验过程中不断不加注意地 把许多活菌体排放到环境中去,自然

界中的噬菌体就在活 菌体中大量生 长,造成了自然界中噬菌体增殖的好 机会。这些噬菌体随着风沙尘土和空 气流动传播,以及人们的走动、车辆 的往来也携带着噬菌体到处传播,使 噬菌体有可能潜入生产的各个环节, 尤其是通过空气系统进入种子室、种 子罐、发酵罐 (三)染噬菌体的检测 在培养皿上倒入培养生产菌的培养基 (加琼脂)作下层。同样的培养基中 加入 20%~30%培养好的种子液,再 加入怀疑染噬菌体的发酵液,摇均匀 后,铺上层。培养过夜观察培养皿上 是否出现噬菌斑。 也可以在上层培养基中不加怀疑染噬 菌体的发酵液,而将发酵液直接点种 在上层培养基表面,培养过夜,观察 有无透明圈出现。 (三)噬菌体的防治 1、必须建立工厂环境清洁卫生 制度,定期检查、定期清扫,车间四 周有严重污染噬菌体的地方应及时撒 石灰或漂白粉。 2、车间地面和通往车间的道路尽 量采取水泥地面 3、种子和发酵工段的操作人员要 严格执行无菌操作规程,认真地进行 种子保管,不使用本身带有噬菌体的 菌种。感染噬菌体的培养物不得带入 菌种室、摇瓶间 4、认真进行发酵罐、补料系统 的灭菌。严格控制逃液和取样分析和 洗罐所废弃的菌体。对倒罐所排放的 废液应灭菌后才可排放。 5、选育抗噬菌体的菌种,或轮换 使用菌种。 6、发现噬菌体停搅拌、小通风, 将发酵液加热到 70~800C 杀死噬菌 体,才可排放。发酵罐周围的管道也 必须彻底灭菌。 思考题 7.23 染菌对发酵有什么危害, 对提炼 有什么危害?

7.24 有哪些原因会引起染菌? 7.25 染菌以后应采取什么措施? 7.26 为什么会感染噬菌体?感染了 噬菌体后应采取哪些措施?


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