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RNA干扰iRNA技术及其应用


RNA 干 扰 iRNA 技 术 及 其 应 用 摘 要 : RNA 干 扰 (interference RNA , iRNA) 是 正 常 生 物 体 内 抑 制 特 定 基 因 表 达 的 一 种 现 象 , 它 是 指 当 细 胞 中 导 入 与 内 源 性 mRNA 编 码 区 同 源 的 双 链 RNA 时 , 该 mRNA 发 生 降 解 而 导 致 基 因 表 达 沉 默 的 现 象 , 这 种 现 象 发 生 在 转 录 后 水 平 , 又 称 为 转 录 后 基 因 沉 默 。 RNA 具 有 特 异 性 和 有 效 性 。 iRNA 技 术 作 为 功 能 基 因 组 学 强 有 力 的 研 究 工 具 , 可 以 特 异 地 使 特 定 基 因 沉 默 ,获 得 功 能 丧 失 或 降 低 突 变 。随 着 对 现 代 分 子 生 物 学 研 究 的 发 展 ,该 技 术 的 应 用 领 域 逐 步 扩 展 到 医 学 ,农 业 ,林 业 , 渔 业 ,畜 牧 等 多 个 领 域 ,具 有 巨 大 的 科 研 ,经 济 和 社 会 价 值 ,本 文 主 要 论 述 RNA 干 扰 技 术 在 医 学 领 域 方 面 的 应 用 。 关 键 字 : RNA 干 扰 转录后基因沉默 RNA 诱 导 的 沉 默 复 合 物 正 文 :今 年 来 ,对 RNA 干 扰 技 术 的 研 究 已 经 成 为 热 点 ,预 测 未 来 10 年 间 最 后 可 能 出 重 要 成 果 的 领 域 之 一 , 并被 《 Science 》 评 选 为 2002 年度最重要科技突破的首位。 RNA 干 扰 技 术 之 所 以 有 如 此 重 要 的 地 位 , 与 其 运 用 到 的 领 域 有 关 。 21 世 纪 初 , 人 类 完 成 了 基 因 组 计 划 , 破 译 人 类 全 部 的 遗 传 信 息 ,使 人 类 第 一 次 在 分 子 水 平 上 全 面 认 识 自 我 。因 此 ,很 多 疾 病 的 病 因 也 将 揭 开 神 秘 的 面 纱 ,这 位 这 些 疾 病 的 基 因 诊 断 和 基 因 治 疗 奠 定 了 基 础 。因 此 ,利 用 RNA 干 扰 技 术 抑 制 基 因 组 的 基 因 表 达 的 技 术 手 段 ,有 可 能 在 基 因 治 疗 方 面 开 辟 一 条 心 的 途 径 ,克 服 医 学 上 许 多 疑 难 杂 症 ,例 如 ,病 毒 性 疾 病 ,肿 瘤 心 血 管 疾 病 和 遗 传 性 疾 病。 1.RNA 干 扰 的 发 现 : 首 次 发 现 dsRNA 能 够 导 致 基 因 沉 默 的 线 索 来 源 于 线 虫 Caenorhabditis elegans 的 研 究 。 1995 年 , 康 乃 尔 大 学 的 Su Guo 博 士 在 试 图 阻 断 秀 丽 新 小 杆 线 虫 (C.elegans) 的 par-1 基 因 时 , 发现了一个意想不到的现象。 她 们 本 想 利 用 反 义 RNA 技 术 特 异 性 地 阻 断上述基因的表达, 而 同 时 在 对 照 实 验 中 给 线 虫 注 射 正 义 RNA 以 期 观 察到基因表达的增强, 但 得 到 的 结 果 是 二 者 都 同 样 地 切 断 了 par-1 基 因 的 表 达 途 径 。这 是 与 传 统 上 对 反 义 RNA 技 术 的 解 释 正 好 相 反 。该 研 究 小 组 一 直 未 能 给 这 个 意 外 以 合 理 解 释 。这 个 奇 怪 的 现 象 直 到 3 年 后 才 被 解 开 。 1998 年 2 月 , 华 盛 顿 卡 耐 基 研 究 院 的 Andrew Fire 和 马 萨 诸 塞 大 学 癌 症 中 心 的 Craig Mello 才 首 次 揭 开 这 个 悬 疑 之 谜 。通 过 大 量 艰 苦 的 工 作 , 他 们 证 实 , Su Guo 博 士 遇 到 的 正 义 RNA 抑 制 基 因 表 达 的 现 象 ,以 及 过 去 的 反 义 RNA 技 术 对 基 因 表 达 的 阻 断 ,都 是 由 于 体 外 转 录 所 得 RNA 中 污 染 了 微 量 双 链 RNA 而 引 起 。 当他们将体外转录 得 到 的 单 链 RNA 纯 化 后 注 射 线 虫 时 发 现 , 基 因 抑 制 效 应 变 得 十 分 微 弱 ,而 经 过 纯 化 的 双 链 RNA 却 正 好 相 反 ,能 够 高 效 特 异 性 阻 断 相 应 基 因的表达。 实 际 上 每 个 细 胞 只 要 很 少 几 个 分 子 的 双 链 RNA 已 经 足 够 完 全阻断同源基因的表达。 后 来 的 实 验 表 明 在 线 虫 中 注 入 双 链 RNA 不 单 可以阻断整个线虫的同源基因表达, 还会导致其第一代子代的同源基 因 沉 默 ,该 小 组 将 这 一 现 象 称 为 RNA 干 扰 。现 在 RNA 干 扰 现 象 广 泛 存 在 于 从 植 物 、真 菌 、线 虫 、昆 虫 、蛙 类 、鸟 类 、大 鼠 、小 鼠 、猴 一 直 到 人 类 的 几 乎 所 有 的 真 核 生 物 中 细 胞 , 这 种 情 况 揭 示 了 iRNA 现 象 很 可能出现于生命进化的早期阶段。 后来在果蝇细胞中的实验进一步揭

示 这 个 秘 密 。 在 一 系 列 著 名 的 实 验 中 , Zamore 和 同 事 发 现 注 入 果 蝇 细 胞 的 dsRNA 被 切 割 为 21 ~ 23 碱 基 长 短 的 RNA 片 段 , 他们同时发现: 与 dsRNA 同 源 的 内 源 基 因 的 mRNA , 只 在 和 dsRNA 对 应 的 部 位 被 切 割 成 为 21 — 23 核 苷 酸 长 的 片 断 。 很 快 , iRNA 的 机 制 越 来 越 清 楚 了 。 2.iRNA 干 扰 作 用 机 制 : iRNA 的 作 用 体 现 在 两 种 水 平 上 。 ① 转 录 水 平 。 RNA 可 以 介 导 DNA 的 甲 基 化 最 早 发 现 于 一 种 植 物 的 类 病 毒 系 统 。dsRNA 被 降 解 成 21 ~ 23 个 核 苷 酸 长 的 小 片 段 RNA 时 ,这 些 小 的 RNA 分 子 在 细 胞 核 可 以 诱 发 同 源 序 列 的 DNA 甲 基 化 。 这 种 序 列 特 异 性 的 甲 基 化 的 信 号 与 RNA-DNA 结 合 有 关 。 当 dsRNA 含 有 与 启 动 子 同 源 的 序 列 ,即 可 使 同 源 靶 启 动 子 序 列 甲 基 化 ,从 而 使 靶 启 动 子 失 去 功 能 , 导 致 下 游 基 因 沉 默 。 ② 转 录 后 水 平 。 (1) 特 异 切 割 dsRNA 的 RNA 酶 Ⅲ 家 族 核 酸 酶 Dicer 依 赖 ATP 切 割 dsRNA , 将 其 分 解 成 具 有 2 个 核 苷 酸 的 3’ 端 的 19 ~ 21b 小 片 段 的 双 链 siRNA 。 (2)RISC(RNA 诱 导 的 沉 默 复 合 物 ) 识 别 并 降 解 mRNA 。RISC 是 一 种 蛋 白 -RNA 效 应 器 核 酸 酶 复 合 物 。 双 链 siRNA 为 RISC 的 重 要 组 分 , 它 依 赖 ATP 解 旋 导 致 RISC 活 化 , 然 后 通 过 Waston-Crick 碱 基 配 对 识 别 底 物 mRNA 并 与 之 结 合 , 并 自 siRNA 的 3 ’ 端 将 mRNA 切 割 成 小 于 12nt 的 片 段 使 其 降 解 。对 一 些 人 组 织 因 子 的 试 验 表 明 ,几 个 不 同 的 siRNA 可 以 攻 击 同 一 个 mRNA 的 不 同 位 点 。 只 有 一 部 分 siRNA 会 导 致 显 著 的 基 因 沉 默 , 这 说 明 在 人 mRNA 上 的 siRNA 结 合 位 点 可 能 很 少 , 且 不 活 跃 的 siRNA 与 活 跃 的 siRNA 可 逆 性 竞 争 。 并 且 RNAi 干 扰现象具有以下几个重要的特征: ( 1 ) iRNA 是 转 录 后 水 平 的 基 因 沉 默 机 制 ; (2)iRNA 具 有 很 高 的 特 异 性 , 只 降 解 与 之 序 列 相 应 的 单 个 内 源 基 因 的 mRNA ;(3)iRNA 抑 制 基 因 表 达 具 有 很 高 的 效 率 ,表 型 可 以 达 到缺失突变体表型的程度, 而 且 相 对 很 少 量 的 dsRNA 分 子 就 能 完 全 抑 制 相 应 基 因 的 表 达 , 是 以 催 化 放 大 的 方 式 进 行 的 ; (4)iRNA 抑 制 基 因 表达的效应可以穿过细胞界限, 在不同细胞间长距离传递和维持信号 甚 至 传 播 至 整 个 有 机 体 以 及 可 遗 传 等 特 点 :(5)dsRNA 不 得 短 于 21 个 碱 基, 并 且 长 链 dsRNA 也 在 细 胞 内 被 Dicer 酶 切 割 为 21 bp 左 右 的 siRNA , 并 由 siRNA 来 介 导 mRNA 切 割 。 而 且 大 于 30 bp 的 dsRNA 不 能 在 哺 乳 动 物 中 诱 导 特 异 的 RNA 干 扰 , 而是细胞非特异性和全面的基因表达受 抑 和 凋 亡 ; (6)ATP 依 赖 性 : 在 去 除 ATP 的 样 品 中 RNA 干 扰 现 象 降 低 或 消 失 显 示 RNA 干 扰 是 一 个 ATP 依 赖 的 过 程 , 可 能 是 Diecer 和 RISC 的 酶 切 反 应 必 须 由 ATP 提 供 能 量 。 3.RNA 干 扰 的 应 用 : RNA 干 扰 现 象 的 发 现 及 其 在 生 物 中 存 在 的 普 遍 性 ,以 及 RNAi 作 用 机 制 和 生 物 学 功 能 的 初 步 阐 明 ,为 RNAi 的 应 用 提 供 了 理 论 基 础 。 RNAi 目 前 已 经 在 功 能 基 因 组 学 研 究 、 微 生 物 学

研究、基因治疗和信号转导等广泛的领域里取得了令人瞩目的进展, 使其在医学领域包括动物医学领域在内的应用有着广阔的前景。 (1)研 究 基 因 功 能 的 强 有 力 工 具 。 随着人类基因组序列的完全破 译 , 人 类 一 进 入 后 基 因 组 时 代 。 在 人 类 基 因 组 的 30 亿 个 碱 基 对 当 中 , 蛋 白 质 编 码 基 因 只 有 3-4 万 个 , 但 约 半 数 的 基 因 功 能 为 知 。 弄 清 这 些 基 因 的 功 能 及 其 相 关 作 用 关 系 已 迫 在 眉 睫 ,建 立 一 种 高 效 ,快 捷 ,简 单 的 确 定 基 因 功 能 的 新 技 术 是 各 国 学 着 梦 寐 以 求 的 愿 望 。 由 于 iRNA 具 有 高 度 的 序 列 专 一 性 ,可 以 特 异 地 使 特 定 基 因 沉 默 ,获 得 功 能 丧 失 或 降 低 突 变 , 目 前 , iRNA 技 术 作 为 功 能 基 因 组 学 强 有 力 的 研 究 工 具 。 已 有 研 究 表 明 iRNA 能 够 在 哺 乳 动 物 中 抑 制 特 定 基 因 的 表 达 , 制 作 多 种 表 型 ,而 且 抑 制 基 因 表 达 的 时 间 可 以 控 制 在 发 育 的 任 何 阶 段 ,产 生 类 似 基 因 敲 除 的 效 应 。与 传 统 的 基 因 敲 除 技 术 相 比 ,这 一 技 术 具 有 投 入 少 , 周 期 短 , 操 作 简 单 等 优 势 , 近 来 iRNA 成 功 用 于 构 建 转 基 因 动 物 模 型 的 报 道 日 益 增 多 , 标 志 着 iRNA 将 成 为 研 究 基 因 功 能 不 可 或 缺 的 工 具 。 与 此 同 时 , 哺 乳 动 物 中 非 特 异 性 iRNA 效 应 的 克 服 和 新 型 表 达 载 体 的 问 世 , 将 iRNA 技 术 用 于 哺 乳 动 物 的 基 因 功 能 的 研 究 推 上 了 应 用 前 前 沿 。 当 前 , 利 用 iRNA 技 术 来 研 究 哺 乳 动 物 基 因 功 能 正 如 火 如 荼 地 进 行 着 ,有 越 来 越 多 的 研 究 团 体 正 加 入 这 一 研 究 队 伍 中 来 。利 用 iRNA 技 术 ,人 们 已 在 多 种 哺 乳 动 物 细 胞 中 成 功 地 降 低 了 靶 基 因 的 表 达 ,这 些 被 降 低 了 的 基 因 范 围 广 泛 ,既 有 结 构 蛋 白 的 编 码 基 因 ,也 要 催 化 蛋 白 编 码 基 因 , 而 靶 基 因 降 低 的 幅 度 高 达 90% 左 右 。 随 着 iRNA 技术的发展及日趋完善, 该技术必将成为人类功能基因组学研究的革 命性工具。 (2)病毒性疾病的治疗。iRNA 在病毒基因治疗的研究方面也格外瞩目。目 前已有多个实验室用 iRNA 技术对 HIV,脊髓灰质炎病毒等的感染进行了研究, 取得了令人激动的成果。他们用针对病毒基因组编码基因 mRNA 的 siRNA 成功地 阻止了靶基因的表达, 为病毒的基因治疗提供了全新的重要策略。加州大学洛杉 矶分校和加州理工学院的研究人员开发出使用 iRNA 技术来阻止艾滋病病毒进入 人体细胞。这个研究小组设计合成的 lenti 病毒载体引入 siRNA,激发 iRNA 使 其抑制了 HIV-1的 coreceptor-CCR5进入人体外周T淋巴细胞,而不影响另一种 HIV-1主要的 coreceptor-CCR4,从而使以 lenti 病毒载体为媒介引导 siRNA 进 入细胞内产生了免疫应答,由此治疗 HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大

增加。 RNAi 还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等,siRNA 已证实介导人 类细胞的细胞间抗病毒免疫,用 siRNA 对 Magi 细胞进行预处理可使其对病毒的 抵抗能力增强。 在最近全世界约30个国家和地区散发或流行的严重急性呼吸综合 征的防治研究中,iRNA 也受到了重视。 siRNA 在感染的早期阶段能有效地抑制病 毒的复制, 病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的 siRNA 所阻断,这些结 果提示 iRNA 能胜任许多病毒的基因治疗,iRNA 将成为一种有效的抗病毒治疗手 段。这对于许多严重的动物传染病的防治具有十分重大的意义。 (3)遗传性疾病的治疗。美国西北大学的 Carthew R W 和日本基因研究所的 Ishizuka A 等人发现 iRNA 同脆性 X 染色体综合征之间的关系密切, 揭示了与 iRNA 相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。遗传性疾病的 iRNA 治疗成为当 今研究 iRNA 的又一大热点。 (4)肿瘤病的治疗。肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果,传统 技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长,而 iRNA 可以 利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性, 设计针 对这一区段序列的 dsRNA 分子, 只注射一种 dsRNA 即可以产生多个基因同时剔除 的表现, 也可以同时注射多种 dsRNA 而将多个序列不相关的基因同时剔除。Maen 等应用 RNAi 技术成功地阻断了 MCF7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分 化相关的核转录因子基因 Sp1的功能。 总结:总之,随着 iRNA 机制研究的深入和 RNA 干扰技术的日趋完善,它作 为一种便捷实用的基因组研究方法和基因治疗药物, 预示着一个崭新的 RNA 时代 即将来临。尽管仍有一些问题亟待研究,如外源转基因如何产生 dsRNA?到底有 哪些核酸酶参与了 dsRNA 和 mRNA 的切割,其详细机制如何?以及最近发现植物 的一种钙调素相关蛋白参与 PTGS 的弱化,提示钙信号可能调节 PTGS 或 iRNA 等 问题。 但细胞中这种古老、 多能的细胞水平的监督系统经过千万年的选择和进化 的考验,毫无疑问是一件无价之宝。该技术将被广泛地用于农、林、牧、渔等多

种领域,具有巨大的科研、经济和社会价值。尽管 iRNA 技术有着十分广阔的应 用前景,但要保证该技术取得成功,还必须对 iRNA 技术进行不断的完善。

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