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RNA干扰设计


什么是 siRNA 和 RNAi

双链 RNA 经酶切后会形成很多小片段,称为 siRNA,这些小片段一旦与信使 RNA(mRNA)中的同源序列互补 结合,会导致 mRNA 失去功能,即不能翻译产生蛋白质,也就是使基因“沉默”了。

RNA 干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链 RNA 引发的转录后基因静默机制,它通过生物体内 siRNA 介导识 别,特定 RNA 水解酶参与,并靶向切割同源性靶 mRNA。实现 RNA 干扰现象是真核生物中普遍存在的抵抗病毒 等外来入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。目前 RNA 干扰技术已成功用于基因功能和信号转导系 统上下游分子相互关系的研究。随着研究的不断深入,RNAi 的机制正在被逐步阐明,大量的论文被发表,成百上 千的专利被授权或递交申请,而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具以及新药开发的诱人前景,RNAi 也越 来越为人们所重视。

RNAi 技术发展历程

1998:植物基因中基因沉默现象的发现 2000:哺乳动物细胞中基因沉默的实现 2001:被《科学》评为当年十大科技突破之一 2003:动物体内观察到 RNA 干扰作用 2004:在恒河猴上的 SARS 病毒研究取得进展 2004:Acuity Pharmaceutical 第一个 RNA 干扰药物申请 IND 2004:siRNA Therapeutics 第一个 RNA 干扰药物申请 IND 2005:第一个 RNA 干扰药物进入一期临床,取得良好的效果 2005:化学修饰的 siRNA oligo 体内系统给药取得突破 2006:诺贝尔医学奖授予两美国 RNAi 技术专家 2007:美国卫生研究院(NIH)组建首个 RNAi 委员会,旨在为 NIH 的科学主管给出有关如何尽可能改善他们对 RNAi 技术的评估 截止 2008 年:已有七项核酸干扰药物项目在美国进入临床试验,其中,有一项药物已经推入到第 III 期临床试验 RNAi 2006 诺贝尔医学奖述评 —— 年轻的获奖者 —— 2006 年 10 月 2 日,现年 47 岁的 Andrew Z. Fire 和 45 岁的 Craig C. Mello 由于在 RNAi(RNA interference,RNAi)及 基因沉默现象研究领域的杰出贡献而今年诺贝尔医学奖获得者,且获奖日期距其研究发表仅 8 年时间,获奖速度之 快亦令人叹为观止。颁奖委员会评价:“他们发现了控制基因信息流通的基本机制, 解释了困惑这一研究者们许久 的难题。”“像在清晨突然打开窗帘,然后一切都一目了然了”。 —— RNAi 的殊荣 —— 2001 年, 随着人类基因组测序的完成, 针对其它多种生物的基因组测序计划也相继开展起来。 在未来的一段时间内, 科学界将不会出现比人类基因组测序更瞩目的技术。有人将人类基因组测序称为“21 世纪科学发展史上的里程碑”、 “生物学领域最重要的成就之一”。然而时隔不久,同一年在哺乳动物中发现的 RNAI 掀起了一场风暴,而且愈演愈 烈。《Science》杂志将 RNAi 称为“2002 年的重大突破”(Couzin,2002)。然而,更加令人吃惊和兴奋的是,4 年以 后的今天,Andrew Fire 和 Craig Mello 就因此获得 2006 年诺贝尔医学奖。一项全新的技术在提出后短短几年就得到 诺贝尔奖的青睐和肯定,此前是绝无仅有的,这也足见 RNAi 在医学领域的开创性意义和极大的应用前景。 —— RNAi 的机制 ——

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—— RNAi 的身世 ——

科学家们最早在植物(Napoli 等,1990)和脉孢菌(Neurospora crassa) (Cogoni 和 Macino,1997)中发现了 dsRNA 诱导 的 RNA 沉默现象。RNAi 在这些机体中作为抗病毒的防御体系而发挥作用。虽然在上述发现中,转基因病毒可以编 码具有沉默功能的基因片断,并在复制过程中产生 dsRNA,但针对 RNA 沉默现象的决定性发现还是由 Andrew Fire 和 Craig Mello 首先完成的。早在几年前,在线虫中进行反义 RNA 实验时,Guo 和 Kemphues 就观察到正义 RNA 也具有很高的基因沉默活性(Guo 和 Kemphues,1995)。后来 Andrew Fire 和 Craig Mello 通过实验阐明了这一反常现 象:将反义 RNA 和正义 RNA 同时注射到秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)比单独注射反义 RNA 诱导基因沉默 的效率高 10 倍。由此推断,dsRNA 触发了高效的基因沉默机制并极大降低了靶 mRNA 水平(Fire 等,1998)。人们 将这一现象命名为 RNAi (见综述:Arenz 和 Schepers,2003)。

基因所携带遗传信息(即单个基因的具体功能)的传递是通过名为信使 RNA 的分子进入细胞蛋白合成“工厂”而实 现的,而基因功能的研究方法一直是研究工作的拦路虎。Fire 和 Mello 通过线虫实验证实:某些分子触发了特定基 因上 RNA 的破坏,导致蛋白无法合成,出现“基因沉默”,而这一过程便被称为 RNAi。天然的 RNAi 现象存在于植 物动物和人类等真核生物的体内,在调解基因活力和预防病毒感染方面起到重要作用。同时他们还发现了有效关闭 基因表达的方法,这样当某一特定基因被“沉默”后,其功能便反向的体现出来了。 —— RNAi 的运用 —— RNAi 主要通过在转录后(post-transcriptional)水平阻断基因的表达,并借此研究基因的功能。同时它为我们提供了一 个治疗疾病的新途径。比如,我们可以按拟定的方式来关闭(shutting off)非必需或致病基因的功能。从理论上说,若 能关闭致病基因的表达则很多疾病将被治愈。动物实验已证明,可以通过 RNAi 的方法使导致血胆固醇升高的基因 “沉默”;病毒性疾病,眼疾,心血管代谢性疾病等方面的临床试验也正在进行中;这一方法为病毒性肝炎、艾滋病 和肿瘤等人类顽疾的治疗指了一条新路。 随着人们对多种生物体基因组序列了解的深入,RNAi 技术可以帮助我们更细致地了解复杂的生理学过程。RNAi 技术与基因组学、蛋白质组学和功能蛋白质组学密切相关,因此, RNAi 本身可作为一项实验技术为生物工程及制 药业等相关行业服务,从而在更深更广的领域发挥其作用。 ,

RNAi 技术应用前景

—— 研究基因功能的新工具 —— RNAi 能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达,制作多种表型,而且抑制基因表达的时间可以随意控制在 发育的任何阶段,产生类似基因敲除的效应。线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕,发现大量未知功能的新基 因,RNAi 将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲除技术相比,这一技术具有投入少,周期短,操 作简单等优势,近来 RNAi 成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多,标志着 RNAi 将成为研究基因功能不可 或缺的工具。 —— 研究信号传导通路的新途径 —— 研究信号传导通路的新途径

联合利用传统的缺失突变技术和 RNAi 技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系, Clemensy 等应用 RNAi 研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径,取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结 果,在此基础上分析 DSH3PX1 与 DACK 之间的关系,证实了 DACK 是位于 DSH3PX1 磷酸化的上游激酶。RNAi 技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好,克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点, 因

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此认为 RNAi 技术将可能成为研究细胞信号传导通路的新途径。

—— 开展基因治疗的新策略 —— 开展基因治疗的新策略 RNAi 具有抵抗病毒入侵,抑制转座子活动,防止自私基因序列过量增殖等作用,因此可以利用 RNAi 现象产生抗 病毒的植物和动物,并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的 dsRNA 抵抗多种病毒。 肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果,传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的 生长,而 RNAi 可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性,设计针对这一区段序 列的 dsRNA 分子,只注射一种 dsRNA 即可以产生多个基因同时剔除的表现,也可以同时注射多种 dsRNA 而将多 个序列不相关的基因同时剔除。 我们应该肯定 RNAi 技术在充满挑战的后基因时代必将有广阔的应用前景,它将会在生物医学研究中产生一种新的 技术革命。人工合成的 dsRNA 寡聚药物的开发将可能成为极具发展前途的新兴产业。

RNAi 基本原理

目前对 RNAi 的作用机理尚不清楚, RNAi 是由 dsRNA 诱导的多步骤、多因 素参与的过程,属于基因转录后调控,其中需要 ATP 的参与。通常认为 dsRNA 由核酸内切酶(RNase Ⅲ)切割成 21~23bp 的 siRNA(在果蝇 RNase Ⅲ被称为
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dicer),siRNA 再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、螺旋酶)结合形成 RNA 诱导的沉默复合物 RISC,然后 RISC 再特异性地与mRNA 的同源区结合,通过酶 的作用使mRNA 降解,而产生基因沉默。靶mRNA 被破坏后, RISC 还可以再作 用于其它靶分子。siRNA 还具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递 甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于 30bp 的 dsRNA 可引起机体非 特异性干扰素样反应和蛋白激酶(PKP)的激活而使其被降解,从而大大减少了 其对mRNA 的抑制作用。
RNAi 技术专用名词 MicroRNA(miRNA,微小 RNA)

一些小的双链 RNA 可以高效、特异地阻断体内特定基因表达, 促使 mRNA 降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型, 称为 RNA 干扰(RNA interference,RNAi,也译作 RNA 干预或者干涉)。它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机 制。

mRNA,为 messenger RNA 的简称,或称为信使 RNA

是由内源性发夹(hairpin)结构转录产物衍生而来的一种长为 19nt~25nt 的单链 RNA。在每种高等动物中,存在 200 种 以上的 miRNA,是最大的基因家族之一,约占基因组的 1%。

siRNA:(short/small interfering RNAs)

mRNA 是由 DNA 经由转录而来,带着相应的遗传讯息,为下一步转译成蛋白质提供所需的讯息。

小干扰 RNA 一种短片断双链 RNA 分子, 能够以同源互补序列的 mRNA 为靶目标降解特定的 mRNA, 这个过程就是 RNA 干扰途径(RNA interference pathway)。

shRNAs:(RNA-Short hairpin RNAs)

短发夹 RNA 是设计为能够形成发夹结构的非编码小 RNA 分子,短发夹 RNA 能够通过 RNA 干扰来抑制基因的表达。 Thomas Rosenquist's group 和 Greg Hannon's group 联合研究了在哺乳动物种系细胞中 shRNAs 的转移导致基因长时间稳定 沉默的机制。

cDNA:互补 DNA 以信使 RNA 为模板合成的 DNA,常常采用互补 DNA 的一条链作为绘制物理图谱时的探针。 Genomic Library 基因组文库 对某个染色体,制备随机产生的、相互之间有重叠部分的片段的克隆。

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RISC:(RNA-induced silencing complex)RNA 诱导沉默复合物 在 RNAi 效应阶段,siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓 RNA 诱导沉默复合物。激活 RISC 需要一个 ATP 依 赖的将 siRNA 解双链的过程。激活的 RISC 通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录本上,并在距离 siRNA3'端 12 个碱基 的位置切割 mRNA(3, 18, 27, 29)。尽管切割的精确机制现在还是未知,研究表明每个 RISC 都包含一个 siRNA 和一个不 同于 Dicer 的 RNA 酶。 Dicer(DCR):Dicer 酶 RNaseIII 家族中特异识别双链 RNA 的一员,能以一种 ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等 各种方式引入的双链 RNA,切割将 RNA 降解为 19-21bp 的双链 RNAs(siRNAs),每个片断的 3'端都有 2 个碱基突出(27, 28)。 PTGS:(Post-transcriptional Gene Silencing ,PTGS) 转录后基因沉默部分的植物中的基因沉默是在转录后发生的, 它是相对于部分植物中发生的转录阶段的基因沉默 (TGS) 而言的。 TGS:(transcriptional gene silencing)转录阶段基因沉默 gene silence:基因沉默 研究结果发现有大量的转基因植株不能正常表达, 通常这并不是由于转基因的缺失或突变引起的, 而是基因失活的结果, 这种失活的现象称为基因沉默。 nt:核苷酸数 RdPR:依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdPR) 由不同种 RNA 病毒进行编码, 进行基因组的复制、 mRNA 的合成、 RNA 的重组和其他一些功能。 目前的研究证明 RdPR 存在于除昆虫和哺乳动物的几乎所有真核细胞中,在 RNA 沉默途径中发挥重要作用。 19+2+2 nt siRNA: 在细胞中双链 RNA 一般都被切割成 21-23 小片段,这样的 RNA 片段能达到更好的 RNAi 作用。人工合成的 siRNA 也是 依据这个原理,所合成的 RNA 就是 19nt 的碱基序列再加上两端的识别序列如-GG,-TT 等。 SECs (siRNA expression cassettes):siRNA 表达框架 一种由 PCR 得到的 siRNA 表达模版,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。 Homologies:同源性 指同种类不同个体或者不同种类个体之间的,染色体或者蛋白质序列的相似性 Recombinant Clone:重组克隆 将不同来源的 DNA 片段合成在一个 DNA 分子中,这种技术称为重组,得到的分子为重组克隆。 Ribonucleic acid:核糖核酸 RNA 从细胞的细胞核和细胞质部分分离出来的化学物质。在蛋白质合成和其他生化反应中起着重要作用,RNA 的结构 和 DNA 的结构类似,都是有核苷酸按照一定顺序排列成的长链。RNA 可以分为信使 RNA、转运 RNA、核糖体 RNA 以 及其他类型的 RNA。 Ribosomal RNA:(核糖体 RNA,简写为 rRNA) 是一组存在于核糖体中的 RNA 分子。

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RNA blot hybridization:RNA 印迹杂交 RNA 印迹杂交是一种检测已固定在滤膜上的总 RNA 或 mRNA 特定靶序列的技术。 RNA 酶控制: 在实验中前期的质粒的构建和提取是要用到 RNAse A 这种酶的存在会降解后期要转录生产的 RNA 如果前期出现了这个 酶的污染就会导致后期实验的失败,而后期转录时又要用到其他的 RNA 酶,如 RNA 聚合酶 3 等,因此在实验中严格 控制好 RNA 酶是 RNA 实验的关键,具体的做法是做到 DNA,RNA 移液器的专用,DNA 实验室和 RNA 实验室的物品 和器械分开使用,将实验室中的任务污染源减少至最低。

siRNA 基本原理

RNA 干涉(RNAi)在实验室中是一种强大的实验工具,利用具有同源性的双链 RNA(dsRNA)诱导序列特异 的目标基因的沉寂,迅速阻断基因活性。siRNA 在 RNA 沉寂通道中起中心作用,是对特定信使 RNA(mRNA)进 行降解的指导要素。 siRNA 是 RNAi 途径中的中间产物, RNAi 发挥效应所必需的因子。 是 siRNA 的形成主要由 Dicer 和 Rde-1 调控完成。由于 RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了 dsRNA, Rde-1 RNAi 缺陷基因-1) ( 编码的蛋白质识别外源 dsRNA, dsRNA 达到一定量的时候, 当 Rde-1 引导 dsRNA 与 Rde-1 编码的 Dicer Dicer 是一种 RNaseIII 活性核酸内切酶, ( 具有四个结构域: Argonaute 家族的 PAZ 结构域, 型 RNA III 酶活性区域,dsRNA 结合区域以及 DEAH/DEXHRNA 解旋酶活性区)结合,形成酶-dsRNA 复合体。在 Dicer 酶的 作用下,细胞中的单链靶 mRNA(与 dsRNA 具有同源序列)与 dsRNA 的正义链互换,原来 dsRNA 中的正义链被 mRNA 代替而从酶-dsRNA 复合物中释放出来。然后,在 ATP 的参与下,细胞中存在的一种 RNA 诱导的沉默复合 体 RNA-induced silencing complex (RISC,由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成,作用是对靶 mRNA 进行 识别和切割)利用结合在其上的核酸内切酶的活性来切割 dsRNA 上处于原来正义链位置的靶 mRNA 分子中与 dsRNA 反义链互补的区域,形成 21-23nt 的 dsRNA 小片段,这些小片段即为 siRNA。 RNAi 干涉的关键步骤是组装 RISC 和合成介导特异性反应的 siRNA 蛋白。siRNA 并入 RISC 中,然后与靶标基 因编码区或 UTR 区完全配对,降解靶标基因,因此说 siRNA 只降解与其序列互补配对的 mRNA。其调控的机制是 通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达,所以是一种典型的负调控机制。siRNA 识别靶序列是有高度特异性的, 因为降解首先在相对于 siRNA 来说的中央位置发生, 所以这些中央的碱基位点就显得极为重要, 一旦发生错配就会 严重抑制 RNAi 的效应。 siRNA 基本特点 长度约在 22nt 左右。 结构上, siRNA 是双链 RNA。 是 RISC 组分。 生成需要 Argonaute 家族蛋白存在。 siRNA 合成是由双链的 RNA 或 RNA 前体形成的。 siRNA 是人工体外合成的,通过转染进入人体内,是 RNA 干涉的中间产物。 依赖 Dicer 酶的加工,是 Dicer 的产物,所以具有 Dicer 产物的特点。 在 Dicer 酶的加工过程中, siRNA 对称地来源于双链 RNA 的前体的两侧臂。 在作用位置上, siRNA 可作用于 mRNA 的任何部位。 在作用方式上, siRNA 只能导致靶标基因的降解,即为转录水平后调控。 siRNA 不参与生物生长,是 RNAi 的产物,原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。

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siRNA 寡聚核苷酸设计原则

siRNA 的设计是决定 RNAi 实验成败关键性的第一步。并非每个 siRNA 都能有效引发基因沉默。和引物设计一 样,设计有效的 siRNA 也有一些经过前人经验总结出的规则,而且这些规则随着对 siRNA 研究的深入也在不断完 善之中。有一些开放的免费在线工具可用。付费的软件成功率比较高,3 个保证中 2 个。 siRNA 的反义链 3'端最好以 UU 结尾,这被公认是最有效的的 siRNA 结构。现在以其他碱基结尾的 siRNA 也有 报道能成功引发 RNAi,你可以尝试。不过如果是体外转录合成 siRNA,要避免以 G 结尾,因为后继处理时 RNase 会切除末端的 G。 多个 siRNA 位点最好分散分布在 mRNA 全长上。没有数据表明 siRNA 在 mRNA 上的前后位置和 RNAi 效果有 什么特别的关系。如果 siRNA 位点因为 mRNA 二级结构或者蛋白结合的屏蔽而影响 siRNA 效果,分散分布可以减 少风险。不过,也有报道说,如果可能,最好能避开起始的 50-200 个碱基,以避开潜在的调控蛋白结合位点。 避开和其他基因同源序列,以免“误伤群众”。潜在的目标序列都到这里 BLAST 一下, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST,和其他基因有 16 个以上碱基同源的序列一定枪毙掉。 GC 比例 30%-50%比高 GC 含量的 siRNA 的成功率要高些。有较多选择时留意,不要有连续 9 个以上的 GC,也尽 量避免出现连串的某个碱基。根据 Schwards 的文章,由于 siRNA 双链上只有一条链会结合 RISC 上,究竟哪条链 取决于 RNA 解旋酶,而正义链 5'端以 GC 开头,且 5'端 1-4 个碱基 GC 含量高,且 16-19 位碱基 GC 含量低的序 列,得到的 siRNA 反义链 5'端 GC 含量低,3'GC 含量高(也有研究表明反义链 5'端前 7 个碱基至少有 5 个 AU),使 得反义链比较容易正确结合 RISC,因而基因沉默效果比较好。 如果是 shRNA 表达载体,用的是 RNA 聚合酶 III 类的启动子如 U6,最适合的结构是 5’GN,后面连续 4 个 U 结 尾即可令转录终止,要避免序列中 G,减出现连续的 U/A。 如果是自行设计 siRNA 的话,一个目标基因至少设计 3-5 个以上的 siRNAs,平行实验以期提高成功率。据评估, 随机设计的 siRNA 有 25%的机会有效沉默基因表达(减少 75%-95%以上的 mRNA),一半以上的几率能达到 50% 的沉默效果。 siRNA 设计工具

研究人员自建的设计工具,以及一些公开的 siRNA 信息数据库,仅供参考。 Whitehead Institute 开发的工具(可以自定义你认为有用的计算法则,删除你认为不需要的法则,而且会不断检索 最新的法则并添加进去):http://jura.wi.mit.edu/siRNAext siSearch (可以给设计结果评分):http://sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch/siSearch_1.7.html : sFold:http://sfold.wadsworth.org/sirna.pl : RNAi Codex:http://codex.cshl.edu/scripts/newmain.pl : siRNA User Guide (by Tom Tuschl):http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html : shRNA Designer:http://shRNAdesigner.med.unc.edu : 厂家免费工具: Ambion 公司:http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html Dharmacon 公司 siRNA 设计:http://www.dharmacon.com/DesignCenter/DesignCenterPage.aspx Dharmacon 公司 Seed Locator:http://www.dharmacon.com/seedlocator/default.aspx : Promega 公司:http://www.promega.com/siRNADesigner/ Invitrogen 公司:https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/

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Genelink 公司:http://www.genelink.com/sirna/RNAicustomorder.asp

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化学合成 siRNA

目前化学合成的 siRNA 主要有:普通 siRNA、化学修饰 siRNA 和荧光标记 siRNA。 化学修饰 siRNA:可以增强 siRNA 在血清、体内及细胞培养中的稳定性,同时与普通的 siRNA 相比,延长了作用 : 时间。 荧光标记 siRNA:在化学合成 siRNA 时,可以对 siRNA 末端用多种荧光标记物进行标记。标记后的 siRNA 可用流 : 式细胞仪、 荧光显微镜、 激光共聚焦显微镜等观察到, 确定转染效率, 优化转染条件; 标记的 siRNA 还可用作 siRNA 胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了 siRNA 的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合 起来。

相关的一些技术数据: 与 siRNA 相关的一些技术数据: 1. siRNA 的平均分子量 13,300。 2. siRNA oligo 的 OD、nmol 和质量间有相应的公式可以计算;一般情况下,对于一个 21 bp 的 siRNA oligo,有 如下简单关系:1 OD duplex=3.0 nmols=40 ug 3. 1 OD 的 siRNA 欲溶解为 20 uM 的样品,可用 150 uL DEPC H2O 去重悬 1 OD 的 siRNA,溶解后为 20 uM 的样 品。 4. 荧光标记的 RNA,如 FAM、HEX、TAMRA 等标记的 Oligo 因为对光敏感,必须避光保存。

siRNA 寡聚核苷酸设计原则

siRNA 的设计是决定 RNAi 实验成败关键性的第一步。并非每个 siRNA 都能有效引发基因沉默。和引物设计一 样,设计有效的 siRNA 也有一些经过前人经验总结出的规则,而且这些规则随着对 siRNA 研究的深入也在不断完 善之中。有一些开放的免费在线工具可用。付费的软件成功率比较高,3 个保证中 2 个。 siRNA 的反义链 3'端最好以 UU 结尾,这被公认是最有效的的 siRNA 结构。现在以其他碱基结尾的 siRNA 也有 报道能成功引发 RNAi,你可以尝试。不过如果是体外转录合成 siRNA,要避免以 G 结尾,因为后继处理时 RNase 会切除末端的 G。 多个 siRNA 位点最好分散分布在 mRNA 全长上。没有数据表明 siRNA 在 mRNA 上的前后位置和 RNAi 效果有 什么特别的关系。如果 siRNA 位点因为 mRNA 二级结构或者蛋白结合的屏蔽而影响 siRNA 效果,分散分布可以减 少风险。不过,也有报道说,如果可能,最好能避开起始的 50-200 个碱基,以避开潜在的调控蛋白结合位点。 避开和其他基因同源序列,以免“误伤群众”。潜在的目标序列都到这里 BLAST 一下, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST,和其他基因有 16 个以上碱基同源的序列一定枪毙掉。 GC 比例 30%-50%比高 GC 含量的 siRNA 的成功率要高些。有较多选择时留意,不要有连续 9 个以上的 GC,也尽 量避免出现连串的某个碱基。根据 Schwards 的文章,由于 siRNA 双链上只有一条链会结合 RISC 上,究竟哪条链 取决于 RNA 解旋酶,而正义链 5'端以 GC 开头,且 5'端 1-4 个碱基 GC 含量高,且 16-19 位碱基 GC 含量低的序 列,得到的 siRNA 反义链 5'端 GC 含量低,3'GC 含量高(也有研究表明反义链 5'端前 7 个碱基至少有 5 个 AU),使 得反义链比较容易正确结合 RISC,因而基因沉默效果比较好。 如果是 shRNA 表达载体,用的是 RNA 聚合酶 III 类的启动子如 U6,最适合的结构是 5’GN,后面连续 4 个 U 结 尾即可令转录终止,要避免序列中 G,减出现连续的 U/A。 如果是自行设计 siRNA 的话,一个目标基因至少设计 3-5 个以上的 siRNAs,平行实验以期提高成功率。据评估, 随机设计的 siRNA 有 25%的机会有效沉默基因表达(减少 75%-95%以上的 mRNA),一半以上的几率能达到 50%

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的沉默效果。

siRNA 设计工具

研究人员自建的设计工具,以及一些公开的 siRNA 信息数据库,仅供参考。 Whitehead Institute 开发的工具(可以自定义你认为有用的计算法则,删除你认为不需要的法则,而且会不断检索 最新的法则并添加进去):http://jura.wi.mit.edu/siRNAext siSearch (可以给设计结果评分):http://sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch/siSearch_1.7.html : sFold:http://sfold.wadsworth.org/sirna.pl : RNAi Codex:http://codex.cshl.edu/scripts/newmain.pl : siRNA User Guide (by Tom Tuschl):http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html : shRNA Designer:http://shRNAdesigner.med.unc.edu : 厂家免费工具: Ambion 公司:http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html Dharmacon 公司 siRNA 设计:http://www.dharmacon.com/DesignCenter/DesignCenterPage.aspx Dharmacon 公司 Seed Locator:http://www.dharmacon.com/seedlocator/default.aspx : Promega 公司:http://www.promega.com/siRNADesigner/ Invitrogen 公司:https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/ Genelink 公司:http://www.genelink.com/sirna/RNAicustomorder.asp

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siRNA 转染方法

将制备好的 siRNA,siRNA 表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种: —— 磷酸钙共沉淀 —— 将氯化钙,RNA(或 DNA)和磷酸缓冲液混合,沉淀形成包含 DNA 且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA 复合 物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验 中使用的每种试剂都必须小心校准,保证质量,因为甚至偏离最优条件十分之一个 pH 都会导致磷酸钙转染的失败。 —— 电穿孔法 —— 电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中 会诱导沿细胞膜的电压差异,据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非 常重要,因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般,成功的电穿孔过程都伴随 高水平(50%或更高)的毒性。 —— DEAE-葡聚糖和 polybrene —— 葡聚糖和

带正电的 DEAE-葡聚糖或 polybrene 多聚体复合物和带负电的 DNA 分子使得 DNA 可以结合在细胞表面。 通过使用 DMSO 或甘油获得的渗透休克将 DNA 复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。 —— 机械法 ——

转染技术也包括使用机械的方法,比如显微注射和基因枪(biolistic particle)。显微注射

使用一根细针头将 DNA,RNA 或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压 microprojectile 将大分子导入细 胞。 —— 阳离子脂质体试剂 —— 在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时,其可以形成微小的(平均大小约 100-400nm)单层脂质体。这些脂 质体带正电,可以靠静电作用结合到 DNA 的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的 原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂,DNA 并没有预先包埋在脂质体中,而是带 负电的 DNA 自动结合到带正电的脂质体上,形成 DNA-阳离子脂质体复合物。据称,一个约 5kb 的质粒会结合 2-4 个脂质体。被俘获的 DNA 就会被导入培养的细胞。现存对 DNA 转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。 siRNA 转染优化

—— 纯化 siRNA ——

为了达到高的转染效率,在转染实验过程中,需要注意以下几点:

—— 避免 RNA 酶污染 ——

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在转染前要确认 siRNA 的大小和纯度。为得到高纯度的 siRNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过 15-20%丙烯酰 胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的 RNA 通常需要跑胶电泳纯化(即 PAGE 胶纯化)。

—— 健康的细胞和严格的操作 ——

微量的 RNA 酶将导致 siRNA 实验失败。由于实验环境中 RNA 酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过的物 品或暴露在空气中的物品等,此保证实验每个步骤不受 RNA 酶污染非常重要。

通常,健康的细胞转染效率较高;此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用 50 代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。同时严格的操作能够确保转染的重复性, —— 避免使用抗生素 —— —— 选择合适的转染试剂 ——

推荐从细胞种植到转染后 72 小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂 在 siRNA 转染时需要无血清的条件。这种情况下,可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验,以得到最佳转 染效果。推荐使用生博公司优质的 siRNA 转染试剂,减少抗生素对转染结果的影响。

针对 siRNA 制备方法以及靶细胞类型的不同,选择好的转染试剂和优化的操作对 siRNA 实验的成功至关重要。推 荐使用生博的 siRNA 转染试剂。

—— 设置合适的阳性对照优化转染和检测条件 ——

对大多数细胞, 看家基因是较好的阳性对照。 将不同浓度的阳性对照的 siRNA 转入靶细胞 (同样适合实验靶 siRNA) , 转染 48 小时后统计对照蛋白或 mRNA 相对于未转染细胞的降低水平。过多的 siRNA 将导致细胞毒性以至死亡。

—— 通过标记 siRNA 来优化实验 ——

荧光标记的 siRNA 能用来分析 siRNA 稳定性和转染效率。标记的 siRNA 还可用作 siRNA

胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了 siRNA 的细胞,将转染 与靶蛋白表达的下调结合起来。

siRNA 体内给药问题

进一步推进 RNAi 治疗的发展必须建立一个持续的给药系统以将 siRNA 运输到靶组织。若没有一种有效的且有 选择性的方法将 siRNA 分子运到靶组织并允许细胞内部的运输,这项新型的治疗技术就算再有潜力、再振奋人心, 也无法实现它的治疗效果。

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在过去几年内,研究者们发现如果用目前成熟的给药方法进行全身给药,大部分 siRNA 分子都无法到达其目的 地——特定靶组织细胞的细胞质内。许许多多的生物障碍的存在限制了 siRNA 分子往细胞质的运输,从而限制了 siRNA 的治疗效果。其中一些障碍包括以下几个方面: · 由于 siRNA 分子较小,很快便经由尿道排泄出体外 · 酶作用导致 siRNA 分子降解/在血清中不稳定 · 运输无组织特异性 · 很难结合到靶组织上 · 需要将 siRNA 摄入细胞内并招募到 RNA 诱导的沉默复合体(RISC)中,这个方面也存在不少挑战。 为了解决这些难题,RNAi 领域中的研究者们积极奋斗,开发许多新的给药技术。这些平台包括从局部给药系统、 到对 siRNA 进行化学修饰、到应用合成(纳米颗粒聚合体和脂质体)和非合成(病毒/DNA)载体来进行运输等各 项技术。尽管每一项研究都为问题的解决提供了一种有意思的手段,但是没有证据表明某一项技术可以完全解决目 前限制 siRNA 运输的诸多难题。 要想慎重考虑找出最佳的给药系统,首先需要对 siRNA 运输过程中待解决的诸多障碍的各个特征有一个明确的认 识。它们包括: · 全身摄入方式 · 在运到靶组织之前要保护好 siRNA 分子并保证其活性 · 让 siRNA 分子直接结合到靶组织上 · 有效地将 siRNA 分子释放到靶组织细胞的细胞质中

siRNA 体内给药系统

虽然目前采用局部施药技术较多, 但此类给药方式的局限在于只适用于那些目前已有局部治疗方法的病症 (比如 对呼吸系统用吸入治疗,对眼疾进行眼部注射等等)。 相反, 如果采用全身给药法, 又能够做到精确地将药物运到某特定组织的话, 那么它就有望被应用于更多的病症。 此外,全身给药法更引人注目的因素还在于它更容易推广,而且也更容易为病人所接受。目前开发的大部分 siRNA 运输方案都是基于全身给药进行设计的。其中包括化学修饰法和合成载体及病毒载体法。 为了避免 siRNA 被降解或者被肾脏排泄出去,必须保证从施药到运输这段时间内,siRNA 的有效成分留在体内 并受到保护,这是十分关键的。已经证明对 siRNA 进行一些化学修饰能够增加分子在血清中的稳定性。但是,这类 修饰也可能改变 siRNA 分子的基本特性,从而带来有害的副作用。另外,让 siRNA 分子药物化意味着 siRNA 分子 的开发将变得像小分子药物或抗体类药物开发那般既耗时又耗资源,从而大大降低了 RNAi 治疗技术的一大内在优 势:针对目标基因快速找出无需经过修饰的 siRNA 分子。相反合成载体,不管是脂质体还是纳米颗粒多聚体,都能 直接利用未经修饰的 siRNA,并通过将其封装在载体内部而起到保护作用。 siRNA 运输的另一个关键条件是能够识别并直接结合到靶组织上。 如果没有这种定位, siRNA 分子将无差别的分 布于体内,这不仅导致所需 siRNA 的剂量大幅度增多,而且还会带来副作用。目前正在开发的一些合成载体技术能 够在脂质体及纳米颗粒多聚体上连入引导配基。这类配基可以引导分子和靶组织特异表达的配基受体结合。配基的 这种结合能力意味着 siRNA 的有效成分可以经由受体介导,被特定的靶细胞进行摄入,从而保证了 siRNA 分子功 效的发挥。 那些结合配基的选择以及它们成功整合到任何一个载有 siRNA 的纳米颗粒系统中, 将把靶向治疗领域解 释为不同的合成携带载体。 siRNA 能否保持完整并成功地结合到靶组织的细胞上是给药技术成功的另一大难题——将活性 siRNA 释放到细 胞质中,并且成功地整合到 RISC 复合体中。载有 siRNA 的微颗粒系统必须具备这两种能力。

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siRNA 体内给药途径 体内给药途径

流体导入法 流体导入法是最早成功在动物体内将 siRNA 导入细胞的方法。它是将大量 siRNA 通过快速静脉注射导入体内。 对于小鼠,一般在 10-15 s 注射 2-3 ml。通过这一方法,一些与肝相关的靶点已特异性下调,包括 Fas 和 caspase8。 在这两例研究中,靶基因下调均到 60-90%。在 Fas 研究中,效果持续了 10 天。

局部导入法 局部导入法是将 siRNA 直接导入一个特定的组织或器官中。到目前为止已有很多成功导入的介绍,其中包括眼 部、 肺部和脑中。 在眼部研究中, 已有大量工作研究 siRNA 靶向 VEGF。 在小鼠和非人类灵长类动物模型中, siRNA 在脉络微血管中证实靶向 VEGF 有活性。在两个动物模型中,siRNA 是通过玻璃体内注射的导入方法,从而在实 验中抑制了血管的生长(小鼠持续 2 周,非人类灵长类持续了 6 周)。局部注射被证实是非常有希望的方法,是 RNAi 在呼吸系统中的应用。通过滴鼻方式将未经修饰的 siRNA 靶向 HO-1(细胞保护性酶),已被证实可增强由 局部缺血引发的肺部凋亡。预防性的将 siRNA 靶向 HO-1,抑制了 HO-1 蛋白在肺部的表达,并且滴鼻方法只对肺 部 HO-1 抑制,而对同样表达 HO-1 基因的其他器官如肝和肾却无影响。局部导入法之所以能快速成功原因有多方 面:首先,如在眼部和肺部中,动物体自身的防御和清除机制促使 siRNA 更好发挥作用;另外更实际的原因是局部 注射相比需要 siRNA 的量要少一些。一些报道详细介绍了 siRNA 如何通过复合物进行导入,但很多研究显示这并 没必要。

系统性导入 由于大部分组织/器官并不能通过局部导入的方法将 siRNA 导入, 那系统性导入方法便是发展 siRNA 药物的最终 目标。在对血管内(IV)、腹腔内(IP)、皮下(SC)和肿瘤内给药中,均对靶基因起到抑制效果。在这些研究中, 无论是修饰还是未经修饰的 siRNA,只需要 120?g/kg 的 siRNA,便能在肿瘤细胞和肺上皮细胞起到特异性干扰作 用。针对其他组织的 siRNA 的有效性仍在继续研究。未来的研究将会集中在 siRNA 的药物动力学分布,并且会研 究在不同靶组织中 siRNA 的修饰。

总结的体内动物实验的参考资料 体内实验 siRNA 系统给药用量参考: 建议每次给药量:0.15-0.2nmol/g 体重 小鼠每次给药量(小鼠体重为 15-20g):3-4nmol(40~53ug) 大鼠每次给药量(大鼠体重为 150-200g):30-40nmol(400~530ug)

有效到达靶部位的给药途径: 静脉给药:适合心、肝、肾、肺、肿瘤组织等血流丰富的组织器官 呼吸道给药:适合呼吸系统 腹腔给药:适合腹腔和盆腔内脏器,胰、脾、肾、卵巢等

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颅内给药:适合中枢神研究 局部给药:系统给药难以到达的部位,如表皮、皮下、子宫腔等

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