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RNA干扰步骤


一,磷酸钙转染法 【实 验 原 理】 磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA 复合物的一种将 DNA 导 入真核细胞的转染方法.磷酸钙有利于促进外源 DNA 与靶 细胞表面的结合.磷酸钙-DNA 复合物粘附到细胞膜并通过 胞饮作用进入靶细胞,被转染的 DNA 可以在细胞内进行瞬 时表达,也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型 和表型的稳定克隆.该方法可广泛用于转染许多不同类型的 细胞. 【仪器,材料和试剂】 (一)仪器,用具 CO2 培养箱,10cm 细胞培养平板,巴斯德吸管,微量移液 器,15ml 锥形管,烧杯,量筒等. (二)材料 呈指数生长的真核细胞 BALB/c 3T3 CsCl 纯化的表达质粒 DNA (三)试剂 1.完全培养液 DMEM 90ml FCS 10ml 2.2M CaCl2,过滤除菌,-20℃保存备用 3.2×HEBS (g/500ml)

NaCl 8.0 KCl 0.38 Na2HPO4.7H2O 0.19 HEPES 5.0 葡萄糖 1.0 用 NaOH 调 pH 至 6.95,过滤除菌后,-20℃保存备用. 【方法与步骤】 1.在 10cm 的培养板上接种 1×106 个 BALB/c 3T3 细胞 第二天进行转染 2.准备 CaPO4 沉淀 2.1 准备两组试管 在 A 管中加入: 15g 质粒 DNA 69l 2M CaCl2 460l 重蒸水 在 B 管中加入: 550l 2×HEBS 2.2 用巴斯德吸管将 A 管中的溶液缓慢地逐滴加入在 B 管 中,同时用另一吸管吹打 B 管溶液,整个过程需缓慢进行, 至少需持续 1~2min. 2.3 室温静置 30min,出现细小颗粒沉淀. 3. 小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的 10cm 平板中, 轻轻晃动(此过程需尽快完成). 4. 在 5%CO2 的加湿培养箱中培养细胞 2-6 hr.

5. 除去培养液,加入 10ml 完全培养液培养细胞 1-6 天(依 具体情况而定). 6. 收集细胞进行基因活性的检测, 或分散接种到其他培养皿 中进行选择培养. 【注 意 事 项】 1.在整个转染过程中要保持无菌操作. 2.在实验中使用的各种试剂都必须小心校准,保证质量. 3.质粒 DNA 需 CsCl 纯化,乙醇沉淀后的 DNA 应保持无 菌,在无菌水或 Tris- EDTA 中溶解. 4.沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要. 在磷酸盐溶液中加入 DNA-CaCl2 溶液时需用空气吹打,以 确保形成尽可能细小的沉淀物,因为成团的 DNA 不能有效 地黏附和进入细胞. 二,电穿孔和电融合技术 [实验原理] 当细胞置于非常高的电场中,细胞膜就变得具有通透性,能 让外界的分子扩散进细胞内,这一现象称为电穿孔.运用这 一技术,许多物质,包括 DNA,RNA,蛋白质,药物,抗 体和荧光探针都能载入细胞.作为一种基因转导方法,电穿 孔已被广泛用于各种细胞类型,包括细菌,酵母,植物和动 物细胞;而且,它还能作为注射方法(称为电注射),把各 种外源物质引入活细胞.与其他常用的导入外源物质的方法

相比,电穿孔具有很多优点.首先,不必象显微镜那样使用 玻璃针,不需要技术培训和昂贵的设备,可以一次对成百万 的细胞进行注射.第二,与用化学物质相比,电穿孔几乎没 有生物或化学副作用.第三,因为电穿孔是一种物理方法, 较少依赖细胞类型,因而应用广泛.实际上,对大多数细胞 类型,用电穿孔法基因的转移效率比化学方法高得多. 除了能使细胞膜具有通透性,让外界的分子扩散入胞液中以 外,高强度的电场脉冲也能引起细胞融合,这一现象叫做电 融合.然而,在用电脉冲融合前必须使细胞相互紧密接触, 这一电融合方法在原生质融合制取杂交植物,胚胎细胞相互 融合制备动物克隆方面非常有用,尤其在制取杂交瘤细胞制 备单克隆抗体方面用处很大.几个实验室已证明使用电场电 融合效率比常规的化学融合方法高 10 到 100 倍,最近,贴 壁细胞的电融合还被用来研究细胞融合时细胞的骨架成分 和细胞器的动力学重排. [仪器,材料和试剂] (一)仪器: 脉冲发生器,样品池:一个盛细胞的容器和两个平行的金属 电极,CO2 培养箱,离心机,显微镜,微量移液器,镊子, 剪刀,三角瓶,吸管,毛细管,离心管等. (二)材料: (三)试剂:

穿 孔 介 质 ( PM ) : 15mmol/L 磷 酸 钾

1mmol/L MgCl2 调节 pH

250mmol/L 蔗糖(或甘露醇) 10mmol/L HEPES 至 7.3

融 合 介 质 ( FM ) : 1mmol/L MgCl2 280mmol/L 甘 露 醇 2mmol/L HEPES [方法与步骤 方法与步骤] 方法与步骤 一.悬浮细胞的电穿孔法: 悬浮细胞的电穿孔法: 1 电穿孔进行基因转移 电穿孔可用于将多种不同类型的分子载入活细胞中,操作步 骤非常相似.以下我们用基因转移作为例子.载入其他的分 子可按以下相同步骤进行,只需把外源 DNA 换页所需分子 即可. 1.1 使细胞在适宜的培养基中生长,用胰酶处理,收获对数 调节 pH 至 7.3

生长中期的细胞,并用腺酶处理. 1.2 在穿孔介质(PM)中至少洗一次.洗细胞时,在台式

离心机上 1000rpm 离心 3 分钟,使得悬浮细胞沉降.然后, 去掉上清液,在新的介质中重新悬浮细胞. 1.3 1.4 计数细胞,在 PM 中,浓缩细胞为大约 1 千万细胞/ml. 将 DNA 加到细胞悬液中,充分混合,使 DNA 均匀分

散,用吸管吸一定体积的细胞-DNA 混合液到装有电极的灭 菌小样品池中. 1.5 在电穿孔装置上设置输出电压和脉冲宽度 (脉冲宽度是

指数衰减函数的时间常数,即 τ=RC,C 是电容,R 是样品的 电阻).假如设备是 CD 脉冲型发生器,设定电容和并联电 阻,以达到合适的 τ 值. 1.6 将小池放进盛样品的池中,启动电穿孔装置,供给所需

的电脉冲. 1.7 电处理后,向小池加 1ml 普通培养基,将细胞混合液从

小池转移到组织培养容器(培养皿或培养孔)中,再加入一 些培养基使最终的培养基体积适量.然后,将样品细胞放回 孵育箱中使之在正常条件下生长. 1.8 在测定转移基因的表达量前电穿孔细胞各自培养的时

间不同. 2 检测电穿孔效率和细胞存活率 2.1 除用罗丹明偶联葡聚糖 (1mg/ml) (分子探针) 代替 DNA 外,将罗丹明偶联葡聚糖引入目标细胞的方法如前所述. 2.2 电穿孔后,用培养基洗涤细胞两次,去掉胞外的荧光葡 聚糖. 2.3 电穿孔后 30min,向细胞悬液中加 30l 台盼蓝,孵育 2min,然后用培养基洗涤. 2.4 在 1000rpm 下离心 3min,收集细胞,将细胞重悬于 PM 中,终体积 100l. 2.5 将一滴细胞液(30l)置于干净载玻片上,用盖玻片盖 好,在显微镜下检测细胞,测定摄取荧光标记葡聚糖的百分

数. 2.6 在亮视野镜片下,死细胞可因染成蓝色检测出(摄取了 台盼蓝),测定细胞存活的百分数. 2.7 在各种电场设定值下重复实验,画出摄取葡聚糖率和细 胞存活率对电穿孔参数的曲线.这一曲线就将显示对特定细 胞类型电穿孔的最优条件. 二.悬浮生长细胞的电融合 融合悬浮细胞的步骤与电穿孔的很类似,只是在进行高强度 的电场脉冲前后, 必须用低幅, 高频电场使细胞排成一条链. 1 用融合介质(FM)洗悬浮细胞两次,然后悬于 FM 中.洗 涤细胞时,在台式离心机上 1000rpm 下离心 3 分钟,得到细 胞沉淀,弃去上清液将细胞悬于新鲜 FM 介质中. 2 将悬浮细胞转移到相应的融合室内.假如要使两种不同的 细胞彼此融合,转移前要充分混合. 3 启动介电电泳场, 其振幅通常小于 200V/cm, 频率在 2MHz 以内,用显微镜检测细胞是否排成一条链,调节振幅和频率 以达到最佳效果. 4 让介电电泳场开约 1 分钟后关掉,立即应用融合脉冲,其 振幅数量级为 1kV/cm. 脉冲宽度小于 1ms. 在进行融合脉冲 后立即再次启动介电电泳场,常规让其开启约 2 分钟. 5 关掉介电电泳场,让细胞在样品池中静置 10 分钟. 6 去掉 FM,用普通培养基再次洗涤细胞.

7 将细胞转移到培养皿,加入普通培养基,在培养箱一般条 件下培养. [注意事项 注意事项] 注意事项 1 最优组分依使用的特定细胞种类而有明显的变化.如果努 力优化电压和脉冲宽度电穿孔结果仍不令人满意,就应尝试 改变穿孔介质. 2 影响电穿孔/电融合的另一重要因素与细胞状态有关, 为达 到最高效率,必须收集对数生长中期的细胞. 1.纯化 siRNA 在转染前要确认 siRNA 的大小和纯度.为得到高纯度的 siRNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过 15-20%丙烯酰胺 胶除去反应中多余的核苷酸, 小的寡核苷酸, 蛋白和盐离子. 注意:化学合成的 RNA 通常需要跑胶电泳纯化(即 PAGE 胶纯化) . 2.避免 RNA 酶污染 微量的 RNA 酶将导致 siRNA 实验失败.由于实验环境中 RNA 酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过的物品或 暴露在空气中的物品等,此保证实验每个步骤不受 RNA 酶 污染非常重要. 3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性 通常,健康的细胞转染效率较高.此外,较低的传代数能确

保每次实验所用细胞的稳定性.为了优化实验,推荐用 50 代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降. 4.避免使用抗生素 抗生素会在穿透的细胞中积累毒素.有些细胞和转染试剂在 siRNA 转染时需要无血清的条件.这种情况下,可同时用正 常培养基和无血清培养基做对比实验,以得到最佳转染效 果. 5.选择合适的转染试剂 针对 siRNA 制备方法以及靶细胞类型的不同, 选择好的转染 试剂和优化的操作对 siRNA 实验的成功至关重要.

6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件 对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对照.将不同浓度的 阳性对照的 siRNA 转入靶细胞(同样适合实验靶 siRNA) , 转染 48 小时后统计对照蛋白或 mRNA 相对于未转染细胞的 降低水平.过多的 siRNA 将导致细胞毒性以至死亡. 7.通过标记 siRNA 来优化实验 荧光标记的 siRNA 能用来分析 siRNA 稳定性和转染效率. 标记的 siRNA 还可用作 siRNA 胞内定位及双标记实验(配 合标记抗体)来追踪转染过程中导入了 siRNA 的细胞,将转 染与靶蛋白表达的下调结合起来.

RNAi 研究的一般技术路线是: 研究的一般技术路线是 的一般技术路线是:

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