当前位置:首页 >> 基础医学 >>

内毒素、地塞米松对体外培养大鼠肺泡巨噬细胞中NF-κB活化的影响


I!型l!!!:盟!!塑堕皇垃王鱼壅堂盘查I蔓墅!』£型!丛型!坐里些竺!)!壁堕,l!iU

13

文章编号:1007.8738(2002)01.013.03

内毒素、地塞米松对体外培养大鼠肺泡巨噬细胞中NF—KB活化的影响
李文军1,宗城2,吉天鹏l,杨晓东1,张宏。,张
(1解放军第159医院全军烧伤中心,河南驻马店463000

斌。,李二红1,赵广贺1
。第三军医大学西南医院烧伤研究所,重庆40m38)

关键词:肺泡巨噬细胞;地塞米轮;内毒索;NF.KB;细胞 问粘附分子l;TNF—n;IKB一Ⅱ 中腰分类号:R.392.1I 文献标识码:A 摘要:目的探讨内毒索(LPS)和地塞米松(Dex)对体外培

sion

LPS
to

carl

promote

NF-KB

activation

in

AMs,which
can

may

contribute

the pathogenesis 0f
in

acule

lung叫。1ry Dex


inhibit

XF-IcB activation

AMs.Vdaich may be

mechanlsm of anti—in-

flammation by Dex.

养的大鼠肺泡巨噬细胞(AM)中盯?KB话化的影响.以及AM
中NF-KB活化在急性肺损伤中的可能作用。方法 通过建立 大鼠AM体外培养技术,应用免疫组化染色法,观察LPS和Dex 对,aM中NF—KB P”,IKB—d、TNF-“和IC帅,I-I蛋白表达的动

NF—KB(nuclear factor—Kappa B,NF—Kb)是近年发现 的一种很重要转录因子,可参与许多分子(细胞因子、粘 附分子和生长因子)基因的转录调控,与炎症、免疫反应

态变化。结果LPS能使培养的A^.中盯-KB P。,TⅫ一a和 IC.aM—I的表达增加,IKB一Ⅱ的表达降低;Dex的作用与LPS恰
相反。结论LPS促进AM中的NT-KB活化、可能是急性肺损 伤肺内炎症损害发生的启动及促进因素;Dex抑制NF-xB的活 化.可能是其抗炎作用的重要机制之一: Effects

等有着密切的关系““。正常睛况下,NF—IcB在胞浆中
与IKB.n结合成无活}生的形式。当孙『F等诱导剂激活 NF—KB后,lr,B—d可迅速磷酸化降解,NF-r.B便由胞质 移位到细胞核,并在那里与基因上的KB位点特异性结 合,促进细胞因子(TNZ.Ct和IL.1)、粘附分子(ICAM.1 和VCM、,I.1)等多种炎症基因的过度表达,同时伴有多种 炎症介质产生和组织广泛损害。因此,NF-KB的活化与 炎症№兵病的发生发展具有密切的关系…。 肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AM)是肺内最 重要的炎症凋控细胞,可通过活化NF?出而启动大量炎 症介质、细胞因子、粘附分子合成介导急性肺损伤。本研 究通过建立大鼠AM体外培养技术,观察了内毒素 (LPS)和地塞米松(dexamethasone,Dex)对AM中NF. KB P”,IK B.d、TNF.“和ICAM-1蛋白表达的变化,探 讨了AIM活化NF.KB在急性日*损伤发生中的可能作用, 为防止急性9猫目伤提供实验依据。

of嗍and

dexamethasone

on

NF—KB

activation in cultured rat alveolar macropha—   ges?

U戳R.洳.EANG
ZIⅥ40 uang—he.
Burn center.159th

Zong—cheng,Jl Tian—peng.YANG

Xiao.dong,ZH.4NG Hong,ZIL4A'G Bin,LI Er一幻,曙,

Hospital

of PLA,Zu Ma

Dian

city,463000; T'rfird

Henan province;lnstitale of Burn

Research,Xinan Hospital

Military Medical Urfiversib",Chongqing 400038,Chi rta

K町wor凼:al~colar macrophages;lipopolysaccharide;dexaraetha—
sone;nuclear factor
tumor Kappa

l材料和方法
J1材料RPMl 1640培养基为美国Gibeo公司产品。 小牛血清由第三军医大学分子遗传学教研室提供。斟 孔塑料培养板为美国Costar公司产品。大肠杆菌内毒素 (LPS,O¨.:B 4)购于美国Si/gam公司。兔抗鼠NF.KB P 。多克隆抗体,兔抗鼠Ix B—a多克隆抗体、,J、鼠抗TNF. Ot mAb及小鼠抗ICAM一1 mAb,均为Santa Cruz公司产

B;intercell¨1ar adhesion molecule-1;

necrosis factor—d:IKB-a

Al峙traet:Aim

To

explore the effects of LPS and Dex
to

on

NF-KB

adivation of cultured alveolar macrophages(AMs、and role of AMs in the pmhogenesis of
acute

study t}le

lung

injury.Methods
expression of NF-

AMs Wel3P harvested bv br,unchoalveo/ar lavage lechrfique.and cut- lured in订tms.The iniluer.ces 0f U)s andⅡex KB”.IKB.d、T、F-d and ICAM—I proteins ated
at in
OIl

品。sP试剂盒为zymd公司产品。Dex(5#L)为上海
信谊药厂生产。健康成年m姐r大鼠,雌雄不拘,体重 (220±20)g,由第三军医大学实验动物中心提供。 1.2方法 1.2 1大鼠AM获取及体外培养将Wistar大鼠腹腔 注射1%戊巴比妥钠40。Tl磬/kg。麻醉后浸于750 nd/L乙 醇中消毒5血n,在无菌环境下放血活杀,用预热至37℃ 的PBS灌洗支气管肺泡(bronchoalveolar lavage,BAL),5 ~10 mL/次,共10次,收集支气管肺泡灌洗液,4qc离心 (1 000 r/商n)×10min,并以PBS洗涤细胞1次。用含

the

AMs雠re

eYdu?

the difierent time

points(2,6,12 and 24 hours after cI.1一
stairfing

ture)bv inmmnohistochemlcal Cre,il.e.∽the
expression

Rcmdls

I腭could
ICA^.-l
OH

in—

of
ln

NF.KB矿.11盯一d、and

proteins

and decreilse IKB—d

the A^.s.11-e jnfi_uenees of Ibex

the

eX-

those of LPS.Colldlll- pression of these proteins we忡conlrar'r-to

收稿日期:2001—04—29;修回日期:200t一06—29 作者简介:孛文军(1967.).男,坷南驻马店市^,主浩医师,博士. 驻马店市风光路1号.Tel(0396)2966063—5751


万方数据  

J4

l墨型!螋!二!!型塑堕量盐王星堡芏盈盎f£!地』坚趔丛型!型!!塑l 21Q丝:】!fU F℃s的P,PMll040培养液(青霉素1×10sUL

I(30 rrlL/L

及庆大霉素5×104U/L)凋整细胞密度为l×109/L。将 细胞接种于预先置有盖玻片的培养板中,分gll JJn人含

LPs(20吲L)和隐(2吲L)的上述RPM]1640培养
基培养2扫、12和24 h后,取出细胞爬片,依次用PBs 冲洗,40“d/L多聚甲醛固定15 111in,置一∞℃冰箱备用。
1.2.2 NF—KB P。、IK B—d、iCAM一1和耵盯一“蛋白

表达的捡测采用免疫组化染色法,步骤如下:将细胞爬 片置于载玻片上,细胞面向上,用PBs漂洗5而n x3次。 加n 3%H,02.甲醇封闭内源性过氧化物酶,室温中∞ min。以PBS同上漂洗。加lO∥L BSA-3nd/L TritonX- 1(30,室温中通透10 ruin加—抗(抗NF—KB P多克隆抗 体、抗IK B—d多克隆抗体以l:∞稀释、抗TNF.d IrL-lb 及ICMM.1 nlla.b I:100稀释),37℃孵育1 h,PBS漂洗5 x3次。加生物素标记的二抗工作液37℃孵育30 min。以PBS漂洗5 min x3次。加辣根酶标记的链霉卵
min

白素(三抗),37t孵育30 rnin后,用DAB显色5 rain。再 以苏木素浅染,脱水、透明。将爬片的细胞面朝下置于载 玻片上,用中性树胶封片后,镜检观察。实验中以PBS

图l体外培养的大鼠AM中4争暖白表达的免疫组化;妊色(×和)
Fig


斟t—抗作为空白对照,以正常血清替代一抗作为替代
对照。结果判定:表达NF-KB P”、IK B?d、711NF一Ⅱ和 ICAr)q.1的AM胞浆染呈棕黄色(阳性),表达NF—KB P ”者可见AM核呈阳性,表达ICAM.I者可见胞膜呈阳   性。并按染色强度计分:浅棕黄色计i分,深棕黄色计2 分,棕褐色计3分;按阳性细胞的百分数分为:O%(计0

Expressions。f 4 proleins in

AMs(immunoehermical Stai-

ning.×400)
A:NF.KB

P“;B:kB-n;C:TNF.a;D:ICAM.1

分).1%~25%(计1分);26%一鲫o(计2分);51%~
75%(计3分);76%~100%(计4分)。巨噬细胞标记指 数(1abelling index,L1),按下列公式计算IL=染色强度 积分x阳性细胞数积分。所有数据均采用i 4-S表示,组 问比较采用£检验及方差分析。 2结果
2.1

LPS和Dex对AM表达TNF—a蛋白的影响 TNFct表达阳性的细胞胞浆为棕黄色。正常对照组 各时间点的LI无显著变化。LPS处理组TNF—Ot的 u较正常对照组及Dex处理组明显升高(P< 0.O”,Dex处理组的u降低(表l、图lc)。 2.4 LPS和Dex对AM表达ICAM—l蛋白的影响
2.3

正常1CAM—l的阳性染色AM为棕黄色,表现为胞 浆或胞膜着色。LPS处理组AM的u明显高于正 常对照组及Dex处理组(P<0.01),阳性细胞的着 色加浓(表1、图1D)。

LPS和Dex对NF—KBP。蛋白表达的黝自大鼠
3讨论
1986年,Sen和Baltimore首先从B细胞核抽提 物中,检测到一种能与免疫球蛋白轻链基因增强子 KB序列(GGGAclTrcc)特异结台的核蛋白因子, 称之为NF-KB”1。此后,NF.KB在许多领域受到关 注。近年发现,功能性NF—KB结合序列,存在于多 种细胞基因的启动子和增强子中”o。活化的NF— KB能与DNA链特定的xB序列结合,启动和调节众 多与免疫和炎症反应有关的基因转录,在机体的免 疫应答、炎症反应及细胞的生长调控等方面发挥着 重要的作用。我们同时测定了ICAM-1和TNF—d 在AM中的表达,观察了NF—KB活化后的转录效 应。[CAM-l又称CD54,是一种相对分子质量(Mr) 为76000~114 000的细胞表面粘附分子,属于免疫 球蛋白超家族中的一员…。ICAM一1的配体是淋巴

支气管肺泡灌洗液(BAⅡ)离心后的沉淀细胞,经瑞姬氏 染色分类,AM占90%以上,故从每只大鼠的B.ALF中可 获得1~2×l驴个.AM,正常NF.I出P表达阳性的AM 胞浆呈棕黄色,个别可见核着色或胞浆和胞核均着色。 LPS处理组AM的u明显高于正常AM组及Dex处理 组(P<n01).且核染色阳性的_AM增加,着色加浓呈褐 色。Dex处理组AM的u明显降低,核染呈阳性的细胞 较少。各组的u在AM培养2,6 h表达最高,培养12斟 h有降低趋势(表l、图1A)。 IK B-“ 2.2Ⅱ蛋和Dex对AM表达kB—d的影响

表达阳性的AM胞浆呈棕黄色。正常对照组各时帆电的
u无显著变化。Dex处理组的u较正常对照组及LPS 处理组明显升高(P<n01)。LPS处理组IK B?q的u 在.AM培养2、6 h降低,培养12、24 h有所升高(表1、图
1B)。

万方数据  

-墅型l鱼盟:!!塑塑坦里佥±鱼蕉芏盈盔(些?!』壁ll丛!lI婴坐!!!1)!塑!,l!(1 1

15

丧1
Tab l

LPS和Dex埘4M中4种蛋白表达的影响(n=8,LI)
The effects of LPS and Dex
Oiq



protein expressions

in AMs

P<0 01

tj

normal

AMOGroup

and Dex.tⅢated group;l_P<0

01%normal AM

group and LPS.treated group

细胞功能相关抗原1(1ymphocyte function-associated antigen.1,LFA.1,又称CD…./CD.。)和巨噬细胞抗原

体结合并使之激活,活化的糖皮质激素受体在细胞核 与NF—KB的RelA亚基直接偶联,抑制NF.KB的功 能;②活化的糖皮质激素受体,通过增强Ix B.“基因 的转录,上凋IK B.q的水平,阻断NF.KB的核易位 及与DNA结合的过程”J。关于LPS对AM中NF. xB活化的促进作用,可能是AM介导急性肺损伤和 发生肺内炎症损害的启动及促进因素。由于Dex可 抑制NF.KB活化,因此其具有一定的抗炎作用。 参考文献:
1]Siehenlisl

复台体I(Mac—I,又称CD。、/CD。)。该配体表达于
淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞表面。大肠杆菌产 生的LPS.是感染性疾病发生全身炎症反应综合症   (SIRS)和多器官功能障碍综合征(MODS)的重要启 动因素。Dex是常用的抗炎剂,在急性呼吸窘迫综合 症(ARDS)、严重应激状态、脓毒血症及慢性炎症性 疾病(如风湿性关节炎和支气管哮喘)中,具有重要 的应用价值。为此,我们观察了LPS和Dex对培养 的AM中NF.KB活化的影响。我们发现,LPS能使 AM中NF,KB P”、‘11NF.d和ICAM-1蛋白的表达增 加,NF.KB P”核染色阳性的巨噬细胞增多,而IK
Ix

U.F…o

G.BT¨ⅢK.Stmclum.mgulalion midfⅫetion of

NF.

KB[J].^mⅣm Cell“,1994.10:405-455.
:2】Bfaekwell rs.Chtlstt∞n
JW The role of

nuof哪r

factor—KB 3-9

in

eytoki鹏g帅£

B—
。3

regulatioa[J]dm J

Jm神CellMOf
IgB

O/_的表达则减少,表明LPS能使AM中NF-KB活化, B.a降解。前者再由胞浆进人胞核,从而启动炎 症因子的转录合成.使ICAM.1和TNF.a的表达升 高。而在加LPS培养12~24h,AM中IK B—d的表达 又升高,表明其合成的IK B.0l增多。Iv:B—a升高的 机制可能是:LPS诱导AM中的NF-KB活化,在启动 炎症因子基因转录的同时,也启动了1x B—a基因的 转录.从而使IK B.Ⅱ蛋白合成增多,有利于抑制NK— KB活化,限制炎症反应,为NF-KB活化的负反馈调 节机制”1。本研究发现.Dex可使AM中NF—KB


Baldwin“The^F.∞and

pmteins:叶w

diuretics

and

ill8LgMs[J】.

^Mumtmmtmd,1996,14:649-683
4]Hahr眦n I,Nee
wM RⅡk of

[J:‰Ⅲ,1998,53:601—602.


i一.rip60n

bd町s

in infl锄lmaloty

tung

d…w



B哩“.Finco
“1993

rs,Nautemmt

allonⅫdfassⅡrIKB-…n,eehmlismfar
3:3301-3310 Multiple nuclear

PV,“一州n日mdII,Ilead“phmphe+l— NF-KB ac'fivatim[J]mf&“Bp
f州㈣interact
with the

6]s卅R.Baltim啪D
er,h∞tH

7]Stauatan-DE.M∞】…SD
supergenP

s。qu…[J]Cell.1986.46(5):705-716
s山t忡*C.“d families[J】.ceg,t988,52(8):925-933
1.CsilmmJia V,“dd

immu“Ⅱ由bofin
of ICAM.t amd ial89rin

d…sLltt…“黼d帅hr—n
by targeting.'IF—KB

Pfim哟.鱼nMmm

memhen of ll"immunoglobu[ia

”、TNF—d和[CAM—l蛋白的表达降低,表明Dex可 抑制NF—KB活化,从而可减少炎症介质基因的转录 合成,发挥抗炎作用。Dex抑制NF-KB活化的作用, 可能与增加I s:B.n蛋白的合成有关,这为从转录水 平解释Dex的抗炎机制提供了实验基础。Dex抑制 NF.xB活化的机制可能是:①激素作为配体与其受

8]B肼q帅c,,4nmther
expreⅢioa

cJ…n"讪faldhit

E-seleetiⅡ

and删AFF/C—Jun[J

』扣州z∞£,1997.

158:3836-3844

9]Ray—A,Sie利-MD,Profunlainp

…a¨闻and

KE,“al

m r"L1lm antogonign

between㈣r】口6un

AnI}inllammtioa dlr削phv+ieal
factor NF-KB and lhe

¥1uc啪rtieaid—ptur【J

Chest.1995.107(3纠pp¨:139S

万方数据  

内毒素、地塞米松对体外培养大鼠肺泡巨噬细胞中NF-κB活 化的影响
作者: 作者单位: 李文军, 宗城, 吉天鹏, 杨晓东, 张宏, 张斌, 李二红, 赵广贺 李文军(解放军第159 医院全军烧伤中心 河南 驻马店 463000), 宗城(第三军医大学西南 医院烧伤研究所 重庆 400038), 吉天鹏,杨晓东,张宏,张斌,李二红,赵广贺(解放军第 159医院全军烧伤中心 河南 驻马店 463000) 细胞与分子免疫学杂志 CHINESE JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY 2002,18(1) 7次

刊名: 英文刊名: 年,卷(期): 被引用次数:

参考文献(9条) 1.Sieben list U;Franzoso G;Brown K Structure, regulation and function of NF-κB 1994 2.Blackwell TS;Christman JW The role of nuclear factor κB in cytokine gene regulation 1997 3.Baldwin AS The NF-κB and IκB proteins:new discoveries and insights 1996 4.Rahman I;Nee WM Role of transcription factors in inflammatory lung disease 1998 5.Beg AA;Finco TS;Nantermet PV TNF-a and IL-1 lead to phosphorylation and loss of IκB-α: a mechanism for NF-κB activation 1993 6.Sen-R;Baltimore D Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences 1986(05) 7.Staunton-DE;Marlin-SD;Stratowa-C Primary Structure of ICAM-1 demonstrates interaction between members of the immunoglobulin and integrin supergene families 1988(06) 8.Brostjan C;Anrather J;CsiImadia V Glucocorticoids inhibit E-selectin expression by targeting NFκB and not AFF/C-un 1997 9.Ray-A;Siegel-MD;Prefontaine-KE Anti inflammation direct physical association and function

antagonism between transcription factor NF κB and the glucocorticoid receptor 1995(107)

本文读者也读过(10条) 1. 高小燕 MCP-1、NF-κB在大鼠CNV中表达及triamcinolone抑制CNV的实验研究[学位论文]2006 2. 张方.施毅.辛晓峰.刘玉秀.钱桂生.罗向东.宋勇.李子玲.ZHANG Fang.SHI Yi.XIN Xiao-feng.LIU Yu-xiu. QIAN Gui-sheng.LUO Xiang-dong.SONG Yong.LI Zi-ling 大鼠肺泡巨噬细胞Bcl-2相关抗凋亡蛋白-1表达变化及其 调节糖皮质激素受体功能的研究[期刊论文]-医学研究生学报2007,20(11) 3. 过氧化物酶增殖体激活受体β在急性肺损伤大鼠肺组织的表达及其意义[期刊论文]-第三军医大学学报 2005,27(20) 4. 宋伟民.陆亚松.蒋蓉芳 室内PM<,10>与气传真菌对大鼠肺巨噬细胞吞噬功能的影响[会议论文]-2002 5. 孔翎 氨茶碱干预A549细胞吞噬凋亡嗜酸粒细胞的研究[学位论文]2007 6. 王勇.张明昌.胡义珍.喻长泰.WANG Yong.ZHANG Ming-chang.HU Yi-zhen.YU Chang-tai 核转录因子抑制剂对大 鼠角膜新生血管的抑制作用[期刊论文]-中华眼科杂志2005,41(12) 7. 吕凤林.郑萍.黄云辉.胡承香.朱锡华 免疫组化及原位杂交检测人肺组织中的C5a受体[期刊论文]-第三军医大学 学报2001,23(10) 8. 汪诚 膜连蛋白Ⅰ参与地塞米松上调A549细胞吞噬凋亡的嗜酸性粒细胞[学位论文]2007 9. 杜悦.蔡栩栩.周卓.高红.韩玉昆 内毒素致新生大鼠肺组织PECAM-1表达的研究[期刊论文]-中国优生与遗传杂志 2004,12(1)

10. 张方.施毅.辛晓峰.刘玉秀.钱桂生.罗向东.宋勇.李子玲.Zhang F.Shi Y.Xin XF.Liu YX.Qian GS.Luo XD. Song Y.Li ZL 糖皮质激素受体基因转染对肺泡巨噬细胞表达炎性因子的影响[期刊论文]-中国组织工程研究与临床 康复2007,11(4)

引证文献(7条) 1.彭慧琴,叶招明,钱景,陶君 呼吸道合胞病毒感染对细胞凋亡及FasL、Fas、Bcl-2、Bax基因表达的研究[期刊论文 ]-中国病理生理杂志 2005(09) 2.杨剑虹,尹文,袁静,李月彩 多黏菌素B对内毒素诱导的肺泡巨噬细胞中NF-κB活化的影响[期刊论文]-细胞与分子 免疫学杂志 2003(03) 3.王立生,李迎雪,朱惠明,朱忠生,马晓冬 双歧杆菌DNA对小鼠巨噬细胞中PKC和NF-κB的影响[期刊论文]-细胞与分 子免疫学杂志 2007(01) 4.彭慧琴 病毒唑对呼吸道合胞病毒感染诱导宿主细胞凋亡及有关基因表达的影响[学位论文]博士 2005 5.王育丽 HDACI上调急性白血病细胞共刺激分子和粘附分子表达及分子机制研究[学位论文]硕士 2004 6.王平 NF-κB信号通路在RSV感染中的作用及黄芩苷的干预[学位论文]硕士 2010 7.张丽亚 黄芩苷抗RSV作用及对NF-κB信号通路和IL-8、FKN表达的影响[学位论文]硕士 2009

引用本文格式:李文军.宗城.吉天鹏.杨晓东.张宏.张斌.李二红.赵广贺 内毒素、地塞米松对体外培养大鼠肺泡巨 噬细胞中NF-κB活化的影响[期刊论文]-细胞与分子免疫学杂志 2002(1)


相关文章:
更多相关标签: