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烟草CN基因的RNA沉默载体构建与功能分析


张 改 云等  烟 草 C 基 因 的 R A沉 默 载 体 构 建 与功 能分 析  N N

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生 物 技 术 

烟 草 C 基 因 的 R A沉 默 载 体 构 建 与 功 能 分 析  N N
张 改云  ,熊腾 飞  ,马 有 志 ,郭 家 明2 ,陈 学平 
1 国科 学 院 南 海 海 洋 研 究 所 , 洋 生 物 资源 可持 续 利 用 蕈 点 实 验 室 , 中 海 , 市 新 港 西 路 14号 ,1 3 1  州 6 500 ;   2中 国 科 学 技 术 大 学 , 化学 系 , 肥 市 金寨 路 9 合 6号 ,3 0 6  20 2 ; 3中 国农 业 科 学 院 , 物 科 学研 究 所 , 京 市 中关 村 南 大 街 l 作 北 2号 ,00 1 10 8  摘 要 :黄 花 烟 H N Z H是 我 国特 有 的 地 方 种 质 资 源 , 种 烟 草 花 叶 病 毒 ( M 后 表 现 出 超 敏 反 应 和 系 统 获 得 性 抗 性 。 目前 , 接 T V) 已从 

H N 中克隆到 1 同 T ZH 个 MV抗 病 基 因 N基 因 同 源 的 基 因 , 名 为 C 基 因 。 为 方 便 利 用 R A干 扰 ( N   t eec , N i技 术 研 究  命 N N R Ai e r e R A ) nr n f
烟 草 C 基 因的 功 能 , 建  用 于 R A 的 植 物 转 化 载 体 p Z I N N 构 Ni P Y C 。通 过农 杆 菌 介 导 的 叶 盘 法 转 化 含 N基 因 的 烟 草 X n i e 获 得  at. , hn

了 3 株 转 基 因植 株 , MV接 种 后 , 基 因 X n i c 有 丧 失 对 T V 的抗 性 , 明 C 基 因 的 R A干 扰 载 体 不 能 沉 默 N基 阕 的 表  2 T 转 at— 没 hn M 说 N N 达 , C 基 因 可 能 是 H N 中 特有 的抗 性 基  , 而 为 获 得新 的 烟 草 抗 病 基 因 及抗 病 品种 奠 定 基 础 。 故 N ZH 从  
关 键 词 :C 基 因 ; 草 花 叶 病 毒 ; NA沉 默  N 烟 R
d i 0 3 6 / .sn.04 5 0 .0 0 0 .1   o :1 .9 9 j i 10 -7 8 2 1 .4 0 6 s

中 图 分 类 号 : 4 3,   TS 1 Q7

文献标识码 : A 

文 章 编 号 :0 4 5 0 ( 0 0 0 .0 70   10 -7 8 2 1 )40 7 .6

Th   on tu t n o  o a c  CN  e e RNAi e t ra d i  u c i n a alss e c s r c i   ft b c o o g n    c o   n  t f n t   n y i  v s o

Z HANG  iy n Ga. u  ,XI ONG Te g fi   n —e ,M A  u z i GUO Ja n n 2 CHEN Xu — i g   Yo . h ,   i— f g i   e pn 2


1 Ke   a o aoy o   ai e Bi—e o r e  u ti a l  i z t n,S uh Chn   e  n ttt  fOc a oo y,   y L b rtr  fM rn   o rs u c s S san be Ut iai l o o t  ia S a I siue o   e n lg  
Ch n s   a e   f S i n e, 1 4 W e t Xi g n   a i e e Ac d my o   c e c 6  s  n a g Ro d,Gu n z o   0 01,Ch n   a g h u 51 3 i a;

2 De a t n  fCh mit , Un v ri   fS in e a d Te h oo   fChn   p rme to  e sr y iest o  ce c   n   c n l g o  ia,9   iz a  o d,Hee  3 0 6, C i a; y y 6 Jn h ir a fi2 0 2 hn  

3Isi t fCo  ce c ,C ieeA a e  fA r utrlS i cs 2Z og un u  o t  t e ,B in  0 0 1 hn    tueo  rp Sin e hn s  cd myo  gi l a c e e ,1  h ng a cn SuhSr t e ig10 8 ,C ia n t c u   n e j
Abta t sr c :Ni t n  ut a L.H NH,aC iase ictb c ogr pam ,ds ly  y esniv ep ne ( R)a d ss c i a rsc  oa i Z   hn  p cf  o a c em ls i i a sh p re s i rso s H p te n  y —   tmi c urd rss n efl wigifcinw t o a c  si vrs( MV)  ei a c    e eh mooo s ei ae   e caq i  eit c ol n  ne t   i tb comoac i e a o o h   u T .A rss n e N g n  o lg u ,d s n td t g
C gn N  e e,h d b e   ln d fo HZNH  ln sb   o lg   ln n  e h i u a   e n co e  r m  p a t  yh moo co ig tc n q e.I  r e o ie iy C g nef n t n va RNA  y n o d rt d nt   N  e  u ci   i  f o

itr rn e( A )   ln— a somain vco ,p Z C ne ee c RN i ,a pa t rnfr t   e tr P YI N,si befrgn rt n o  ari- A c nt csw spe  f t o ut l o  e eai   fh i nRN   o s u t a  r— a   o p r  
p r d.3  r n g n cXa tin  ie   r  b an d b   g o a tru me itd la   icta s r t n.Re itn e t  ae 2 ta s e i  nh . cln swe e o tie   ya rb ce i m— d ae  e fds  r n f mai o o ssa c  oTMV  s wa   rtie  n ta s e i  n h — c pa t , whc   u g se  h tRNA  i n e v co   t  ean d i rn g n c Xa t in   ln s ih s g e td ta  sl c   e trwi CN  e e fa me th d n  mpa to   e h g n  rg n  a   o i c  n N  g n   x r sin.He c  C ma   e a s e ilg n  n HZ e e e p e so n e N  y b    p ca  e e i  NH  ln s h rfr te ioa in a d f n t n a ay i  ft  C p a t .T e eoe, h  sl t   n  u ci   n lsso he N  o o g n   y p o i e c n iae g n s fri r vn  o a c  oe a c  o TMV . e e ma   r vd   a dd t  e e o  mpo i g tb c o tlrn e t   
Ke   r s: C rg n y wo d A   e e;t b c o mo a c v r s RNA  ie c   o a c   s i  iu ; sl n e

烟草 花 叶病毒 ( bcom si v u ;T t ac  oa  i s MV) 烟 草  o c r 是 广泛 传播 的一 种病 毒 , 界各 烟 区普遍 发 生 , 征症 状  世 特 包括 : 片呈 现深 绿和浅 绿 相 间的不 规则形 状 , 叶 植株 生 
作 者 简 介 :张 改 云 , , 士 , 要 从 事 植 物 或 微 生 物 的 基 困 克 隆 与 功 能  女 博 主
研 究 ,E mal hy n0 8@ yh o c l 11 - i:zg u 2 0 a o .on.1 2 

长受 到抑 制 , 片 畸 形 。T V严 重 影 响 了烟 叶 产 量 , 叶 M   品质 和市 场价 格 , 因此 已被 看 作是 一 种 经 济 重 要 型病 
害。   目前 对 T MV具 有 抗 性 的 基 因 只 有 2个 : 基 因 和  Ⅳ

Ⅳ 基 因 。来 自烟 草 N.gu ns 的 Ⅳ 基 因 是 第 1个  H l io t a 植 物 抗病 基 因 , 玉米转 座 激活子 A 从 T V U (M   用 c M — 1T V

陈学半( 讯作者) 通 ,男 , 士 , 博 副教 授 , 主要 从 事 烟 草 抗 病 基  因 的 克隆 与功 能 研 究 , . i utcx @s a c r E ma :s hp i   o   l c n n

的普 通菌 株 ) 性 烟 草 的突 变 体 中 分离 出来 … 。除 了  抗 T — B菌株 外 , 基 因对 其 他 所 有 已知 的烟 草 花 叶  MvO Ⅳ 病毒 都具 有抗 性 _ 。包 含 Ⅳ 基 因 的 烟草 对 T V 的抗  2   J M

基 金 项 目:国家 烟 草 专 卖 局 资 助 项 日( 120 006  100 110 )
收 稿 日期 : 0 90 — 3 2 0 —82  

7  8

中 国 烟 草学 报

21 00年 8月 第 l 卷 第 4期  6

性 表现为 超敏反应 , 敏 反应 发 生 在病 原 菌 侵染 后 的  超 几 个小时 , 能引起 侵染 位 点及 其 附 近 区域 的 细胞 快 速  死亡 J ,随后 , 植株 对次 级侵染 表现 出较 强 的抗性 , 这 
种植物 组 织 中抗 性 的 传 播 称 为 系 统 获 得 性 抗 性 ¨ 。 4    J

基 副教授 惠赠 , 用 其他 质 粒 、 杆菌 菌 株 ( B 4 1   所 农 L A4 M)

和大肠 杆 菌菌株 ( H a 均 由本 实 验 室保 存 。T V u   D 5) M .1
菌株 由南京农 业大 学许 志刚教 授惠赠 。  
13 P .  CR 引 物 

N H基 因从 烟 草 N.tbcm c .X nh n aau  v ati n中被克 隆 出     来 , Ⅳ 基 因的 1 同 源基 因 , 在 于 除 N. et m — 是 个 存 bnh i a  
an a

C N基 因片 段 C F克 隆 自载 体 p E N, N G MC 引物 序 
歹 Ⅱ如 下 :正 向 弓 物 I C1 N :5’ G G A G A C . . A A C T G A  G G C A G - , 向 弓 物 C 2 5’G A C G T A  A T T G3’ 反 I N : .C A A G G .

外所 有 被 检 测 的 T V U M — 1抗 病 烟 草 和 感 病 烟 草 

中l ,含 N 基 因的 T V U 5   J H M . 1感 病 烟 草 在 T V C M .g侵  染 时表现 出类 超敏反 应 , 管会发 生定点 防卫 反应 , 尽 但  是病毒 继续 系统性传播 _ 。 N基 因 和 N 5   J H基 因编 码 蛋  白都具 有核苷 酸结合位 点 ( B ) 富亮 氨酸重 复 ( R ) N S, L R 
及 果 蝇 To 蛋 白 及 N端 的 哺 乳 动 物 白 细 胞 介 素 . 受  ol 1 体 (I ) 构 域 。 TR 结   黄花 烟 H N Z H是 我 国 特 有 的 地 方 种 质 资 源 , 学  陈

G T C G T 一 ’ U F基 因 片段 克 隆 自载体 p A . A C A A G3 。G S C M 
BA 3 1 正 向 引 物 G S : ’G T'G G C G A C G  I 18 , U 1 5 .C I C T G C T C . C

3’ 反 ,

向 引 物  G S : 5 ’C C G A T C T  U2 .A C A G Y A .

G C G C A . 。 卡 那 抗 性 基 因 扩 增 正 向 引 物  C A T C G3’ N T : .C G T T A T G C C A A . ’ 反 向 引  P 1 5’ G C A G C G G A A C G 3 , T
物 N T 5’C A T A C C G C GG A . 。 T   P 2: 一 G GA C T G C T G C T 3’ MV

衣壳 蛋 白 ( P 基 因 扩增 正 向 引 物 C 1 5’ A A A   C) P: 一 A C— C C A A G T G A T T . ,反 向 引 物 C 2 A C A C C A C G C3’ P :5’ .  
GCAGGACCAGAGGT CCAAACC. 。 3’  

平 等在进行 烟草种 质 资源 筛 选 时发 现 , 种 烟草 花 叶  接
病毒后 H N Z H表 现 出 超 敏 反 应 和 系 统 获 得 性 抗 性 _ 。 6    J

目前 , 我们 已从 H N Z H中克隆 到 1 同抗病 Ⅳ 基 因 和  个
N 基 因 同 源 的 基 因 , 名 为 C 基 因 。 C 基 因 编  H 命 N  J N

14 C 基 因 的植 物 R A干 扰 载体 p Z I N 的构  .  N N P YC
建 

码蛋 白也 属 于 TR N S L R类 。 接种 烟草 花 叶病 毒  I/ B / R
后 , N 基 因 在 H N 中 的 表 达 增 强 并 具 有 温 度 敏 感  C ZH

1 .用 高 保 真 酶 以 C 1和 C 2 为 引 物 从 质 粒  N N p E N 中 扩 出 C 基 因 的 1 1  p长 的 D A 片 段  G MC N 0 4b N C F 并从胶 中回收该 片段 ; N ,  

性 。组织特 异 性表 达 分 析 表 明 : N 基 因在 叶 中表 达  C 量较 高 , 在茎 中表达量 较低 , 在根 中表达 量最低 。通 过 
农 杆 菌介 导 的方 法 将 C 基 因 转 入 感 烟 草 花 叶 病 毒 烟  N

2 用 平端 限制性 内切酶 Eo   . cR V酶切 质粒 p S 并  B,
从胶 中回收载 体片段 ;   3 将 C F与 p S连 接 后 转 化 E.cl; . N B o   i

草 K2 , 36 转基 因烟 草在烟 草花 叶病 毒接 种后 表 现 出超 
敏反应 和系统性 超敏反 应【    。 为 进 一 步 研 究 C 基 因 的 功 能 ,我 们 构 建 了 用 于  N

4 转化 菌在含 有 5  g m . 0t / L氨苄青霉 素 以及 IT   t PG
和 xgl L —a 的 B平 板 上 筛 选 ;  

R A 的 植 物 转 化 载体 p Z IN。该 载 体 以 pZ 10 N i P YC P Y 1 

5 .白色 菌落再 用 P R筛选 获 得正 向插 入 C F的  C N pS 粒( B 质 命名 为 p S N ) B C F 和反 向插入 C F的 p S质  N B 粒( 名为 p B N ) 命 A CF;   6 用 P R的方 法 从 载体 p A BA 3 1载体 中扩  . C C M I 18
出 长 1k   b的 G S U F片 段 , 克 隆 到 p S中 , 得 p S  并 B 获 B.
GUS   F;

双元载体 为骨架 , 含有 G S基 因片 段 和 目的 基 因片段  U 的正 向和反 向克 隆 . 通过 农 杆菌 介 导 的 叶盘 法转 化 烟 
草 Xn ic 获得了 3 at . , hn 2株 转 基 因 植 株 ,T MV接 种 后 ,   转 基 因 X n ii 有 丧 失 对 T at .C没 ht Mv的 抗 性 , 明 C 基  说 N

因 的 R A干扰载 体不能 沉默 Ⅳ基 因的表达 , C N 故 N基  因可 能是 H N 中特 有 的抗 性 基 因 , 而 为获 得新 的  ZH 从 烟 草抗病 基 因及抗 病 品种奠定 基础 。  

7 .用 X a b I和  n  I双 酶 切 植 物 表 达 载 体 

p Z I0 并 回收载体 片段 P Y ; P Y 1, z F 
8 用 X a I S lI 酶 切 p B N , 回 收 含  . b  和 a 双   ACF并 C F的 片 段 A C F  N BN ; 9 用 S l 和 E o   双 酶 切 p S U F 并 回 收 含  . aI   cR I BG S , G S U F的 片 段 B G S  SU ;

1 材料 与 方 法 
1 1 植 物 材 料  .

T V U 抗 性 品 种 N.t au  V X nh I , 国  M .1 a cm C . ati1 中 b —C 烟 草 地 方 种 质 N.r ta L H N 和 T — 1 病 品  u i  . Z H sc MV U 感 种 N.tbcm C . 36被 用 于 本 次 研 究 中 。X nh n  aau  V K 2 ati c .

1 . Eo   和  nI 0 用 c I R   双酶 切 p S N , 回收含  BC F并
C F的 片 段 B C F  N SN ;

和 K2 36由中 国农 业科学 院 烟草 研究 所 惠 赠 , Z H 由 HN   中国烟草南 方育种 中心惠 赠 。  
12 质 粒 和 菌 株  . 质 粒 p E N 和 p A BA 3 1由 北 京 大 学 秦 跟  G MC C M I 18

1 . D A片 段 P Y 、 B N 、 S U 1将 N Z F A C F B G S和 B C F SN   在 同一 体 系中进行 连接 反应 , 各片段 首尾相 连 ; 使  

1 . 化 E.cl 后 , 2 转 o i 在含 氯 霉 素 的 L B培 养基 上 
筛 选获得 R A干扰植 物表达 载体 p Z IN   N PYC 。

张 改 云 等  烟 草 C 基 因 的 R A沉 默 载 体 构 建  功 能 分 析  N N j

7  9

1 5 C 基 因 的 植 物 R A 干 扰 载 体 p Z I N 的 烟  .  N N P YC
草 转 化 

4 6b 3  p和 3 1b ,C 基 因 的 内 含 子 2和 内 含 子 4分 别  9  p N
为 2 7b 6   p和 1 0 b , Ⅳ 基 因相 应 内 含 子 2和 4分 别  2  p 比
短 5 5b 7   p和 2 3 b 。 1  p  

通 过 电击 转 化 法 将 p Z N载 体 转 入 农 杆 菌 菌 株  P WC L A 4 4 按 照 H r h 等  的 方 法 通 过 叶 盘 转 化 法 将  B 40 , oc s

序 列 分 析 表 明 C 基 因 的 开 放 阅 读 框 为 3 2  D N 4 3b ,  

植物表 达 载 体 转 入 感 病 烟 草 K 2 。转 基 因 烟 草 通 过  36 卡那 筛选 和卡 那 引物扩 增来 进行 阳性 鉴定 。  
16 T .  MV 接 种 

编码 1个 含 14 个 氨 基酸 的多 肽 , N蛋 白的 预测 分   1 1 C
子 量 是 10 6K a 预 测 编 码 蛋 白 含 TR N SL R结 构  3 .  D , I— B —R

域 。TR和 N S 构域 位 于 蛋 白 的 N末端 , R I B 结 L R结 构  域位 于蛋 白的 c末 端 , 推定 C N蛋 白 的 L R结 构 域包  R 含 1 4个 不完全 的 L R重 复 , 一 点 同 N蛋 白是 相 同  R 这 的 ( 1 ) 系统 发 育树进 一 步确 定 了 C 图 B, N基 因和 Ⅳ基  因属 于相 同 的亚家 族 ( 1 )  图 C。
2.  R i表 达 载 体 的 构 建  2 NA

T —1 MV U 菌株 首 先 在 感 病 品 种 K 2 3 6活 体 植 株 上  扩 繁及活化 , 照 Pr 等 9的方 法进 行 T V接种 ,将  按 ak _ M 感病 K2 3 6叶 片 于 磷 酸 缓 冲 液 ( 3  M N C ,27 m   17 m   a 1 . M   K 1 0m   aH O 和 2m   H P 4 p   .) C ,1  M N 2 P 4   M K 2O , H7 4 中研 磨 ,  
然 后 将 含 T v 的 叶 片 汁 液 用 毛 笔 涂 抹 于 已 洒 有 二 氧  M

化硅 的充分 伸 展 的叶片 上 , 拟 接种 时 , 磷 酸缓 冲液  模 用
和 二 氧 化 硅 涂 抹 叶 片 , 种 完 成 后 , 自来 水 冲 洗 叶  接 用 片 。 接 种 后 3~2  , 过 抗 病 或 感 病 反 应 来 评 价 植 株  0d 通 对 T — 1的抗 感 情 况 。 MV U  

R A沉 默 载 体 构 建 有 多种 方 法 , 此 , 们 构 建  N 在 我
了 能 形 成 发 夹 结 构 R A 的 载 体 , 录 表 达 后 利 用 植 物  N 转 体 内 D C R切 割 形 成 沉 默 所 需 的 s N IE i A。 采 用 这 种 方  R

法需要 1 与 目标 基 因 m N 同源 的片 段 , 们选 取  个 RA 我 了 C 基 因 中一 个 1 1 p的 片段 , 将 此片段 从载 体  N 04b 并 p E C 中克 隆 出来 ( 2 。 同样 , P R 的方 法 从  GM N 图 ) 用 C
载 体 p A I l8 C MBA 3 1中 扩 出 长 1k 的 G S 片 段 (  b UF 图  2 。 P R结 果 如 图 2所 示 , 物 大 小 与 设 计 相 符 。 将  ) C 产

E o   Ex 2 x nl on  

Ex n3 AE 一一 ~   o ^  

Ex n   o4

Ex n   o5

Nn口{二 …缸詈 …  e 二]  ……  g e
4 9b  19 b  7  p 0 6 p 2   p 7  p 7lb   0b  

1 71b   5  p

…  I
4rie  1 su】   ds e
4 s us 4 ei ej r d  

扩增产 物 分 别 与 p S载 体 连接 并 转 化 大 肠 杆 菌 ,C   B PR

…  

 

鉴定后 选 取 阳性 克 隆 测 序 , 序 得 到 的序 列 结 果 与原  测 序列 相符 。将植 物 表达 载体 p Z 10 含 G S PY 1, U F基 因片  段 的载体 p S U F 含 C F正 向插 入 片段 的载 体 p — BG S, N B 
SN C F和 反 向 插 入 片 段 的 载 体 p B N A C F用 相 应 的 酶 分  别进 行酶 切 ( 材料 和方 法 ) 回收 PY , S U ,S  见 , Z F B G SB C


C  01  

C j垂  

) — 6 一ds …  1 ie 5 u1 2  

N F和 A C F基 因 片 段 , 将 其 在 同一 体 系 中进 行 连  BN 并
接 , 接 产 物 转 化 大 肠 杆 菌 D 5 , 过 抗 性 筛 选 及  连 H a通
A, N 和 ~ 基 网 基 因 组 结 构 示 意 图 ; C  

P R检 测 获 得 用 于 C 基 因 功 能 分 析 的 R A 植 物 表  C N N i

B N 和 , 基 网推 定 蛋 白结 构 域 的示 意 图 ; ,C v   C N 蛋 白M 其 他  I — B ,C FR N S蛋 n 的系 统 发 育 关 系 

达载 体 p Z IN P Y C 。整个 载体 构建 过程 见 图 3  。

图 1 C 基 因和 Ⅳ 基 因 的 结 构 分 析 及 其 系统 发 育 树    N

2 结 果 与分 析 
2.  C 基 因 与 Ⅳ 基 因 的 序 列 比较  1 N

通 过 同 源 克 隆 技 术 ,1 新 的 Ⅳ 基 因 同 源 基 因 个  

cv基 因 , , 已从 H N Z H烟 草 中被分 离 出来  , N基 因全  C
长 6 8  p 由 5 外 显 子 和 4个 内 含 子 组 成 ( l , 6 8b , 个 图 A)  

其 外 显 子 序 列 同 相 应 的 Ⅳ 基 因 的 外 显 子 序 列 具 有 
9 % 以上 的核 苷 酸 序 列 一 致 性 , 长 度 上 几 乎 相 同 , 0 在  

C N基 因 同 ~ 基 因可 能 在 相 同 的 位 点 被 剪 切 。但 是  C N基 因的 内含子 同 Ⅳ基 因 的 内含 子 在序 列 和 长 度上 
图 2 C F基 因片 段 和 GU F基 因 片 段 的 克 隆    N S
注 : D 20   akr 2 H: 应 的水 对 照  M: L 0 0 m re ;H O 相

都有 较大 差别 。 C 基 因 的 内含 子 1和 内含 子 3分 别  N
为 6 6b 6  p和 2 0  p 比相 应 Ⅳ 基 凶 的 内 含 予分 别 长  2 9b ,

中国烟草学报

21 00年 8 第 l 卷 第 4 月 6 期 




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图 3 C 基 因 的植 物 R A干 扰 载 体 p Z I N的 构 建    N N P YC

23 转基 因植株 的获得  .
将含 C N基 因的 R A干 扰 植 物 表 达 载 体用 电击  N

伤组织 , 愈 伤 组 织 上 可 以 直 接 分 化 出 抗 性 芽 ( 在 图 

4 )抗性 芽生 长至 2~3c A,  r , 到 生 根 培养 基生 根  n时 转
( 4 ) 约 3 4周抗 性芽 长 出根 系 , 移 至花 盆 中进  图 B, ~ 转

法转 化农 杆 菌 L A 4 4 并 通过 农 杆 菌介 导 的 叶 盘转  B 40 ,

化法将植 物 表达 载 体 转入 含 Ⅳ基 因 的烟 草 Xnh.c ati   n
中, 转化 后在 12MS 养基 中暗培养 2d 然后转 至分  /  培  ,

行培 养 ( 4 。经 筛 选 标 记 Kr 抗 性 筛 选 及 抗 性  图 c) a  l N TⅡ基 因 的 P R检 测 后 , 获 得 3 转 化 体 ( P C 共 2株 图 
4 )  D。

化 培养基进 行分化 培养 , 2 3 以后就 可 以形 成 愈  约   周

张改云等

烟草 C N基因 的 R A沉 默载体 构建与功能分析  N

8  1

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l  
5   6   7   8   9   1  0 1  1 1  2 CK 

A形 成抗 性 芽 ; 成 根 系 ; B生 C形 成 植 株 ; D转 基 因烟 草 的 卡那 检 测 

图 4 转 基 因烟 草 的 获得 及 阳 性 检 测 
注: M:D20 m re; K: 转 基 因 对 照 ;-2 不 同 的 转 基 因 烟草 株 系 编 号  I 1 akrC 非 0  11 :

A: 生型 Xnh—e的 T 野 atii F MV接 种; : B 转基 因 X nh.e室温条件下的 T v接种 ; : ati n M C 转基 因 X nh—c ati 植株 T n MV接种后于 3 ℃保 持 4h 然后 再置于  2 8,
室 温 正 常 培 养 。 D: 生 型 l 2 野 ( 6的 Mv接 种  3 I

图 5 野 生 型 及 转 基 因植 株 的 T MV 接 种 

8  2

中 国 烟 草学 报

2 1 年 8月 第 l 00 6卷 第 4期 

2 4 转 基 因烟 草 的 T . MV 接 种 

为检测 C N基 因沉默 载体是 否在 X n i1转 基 因 at —C hI   植株 中起到预 期 的作用 , 我们 对转 基 因 X n i c 行  at — 进 hn
了 T V接 种 试 验 , 比 较 了转 基 因 和 野 生 型 xnh n  M 并 at —c i

3 结论 
用 同源克 隆 法 ,我 们 已从 中 国 特有 的 高 抗 T V M 
的烟草 种 质 H N 中克 隆到 1个与 Ⅳ基 因等抗 病 基  ZH 因具有 高度 相似 性 的抗 病候 选 基 因 C N基 因 , 基 因  该 全长 32 p 编码 一 个 含 有 14 4 6b , 11个 氨 基 酸残 基 的蛋 

以及 野生 型 K 2 36在 接种 T Mv前后 的变化 ( 5 。野  图 )
生 型 xn i a接 种 T V 后 出 现 明 显 的 坏 死 斑 ( at — hH M 图 

5 ) 而对 T A , MV敏感 的野生 型 K 2 36叶片没有 明显 的变  化 ( 5 花 叶症状 在 1  图 D, 0d之后 出现 ) 坏 死斑 同样 出 ;  
现在 转 基 因 X nh l at —e的 烟 草 叶 片 上 ( 5 ) 且 接 种  ii 图 B , T Mv后 于 3 ℃ 以 上 培 养 2 d 再 置 于 室 温 的 转 基 因 0  ,   X n ii烟 草 有 更 明 显 的 超 敏 反 应 ( 5 ) 图 5 中 at —o hr 图 C。 A  

白, 之前 , 我们 已通过农 杆 菌介 导 的方法 将 C N基 因转 
入感 烟草 花叶病 毒烟 草 K 2 , 36 转基 因烟 草在 烟 草花 叶  病毒 接种后 表现 出超敏 反应 和系统性 超敏反应 l 。在  7   J
本研 究 中 , 们通 过 R A干 扰技 术 进 一步 验 证 了 C   我 N N

基 因的功能 , 构建 了用于 R A 的 C N i N基 因 的植 物转化  载体 p Z IN, 过 农 杆 菌 介 导 的 叶 盘 法 转 化 烟 草  PYC 通 X n tn ,获得 了 3 af .c l i 2株 转 基 因植 株 ,T Mv接 种 后 , 转 
基 因 X nh n 有 丧 失 对 T at —c没 i MV 的抗 性 , 明 C 基 因  说 N

坏 死斑 明显 小而且 数量少 , 这是 由于 接种 的 T V浓度  M 不 同造成 的 。在 其 他 的重 复 试验 中也 证 明 了浓 度 越 
大 , 死斑越 多 。 坏  

T V衣壳 蛋 白是 T V在 植 物 中进 行 系 统传 播 所  M M 必须 的蛋 白。为验证 在转基 因植株未 出现坏 死斑 的叶 
片内 是 否 含 有 T MV 病 毒 , 们 检 测 了 T v 壳 蛋 白 我 M   ( P) 因 的表 达 情 况 ( 6 。 和 预 期 结 果 相 同 , 接  C 基 图 ) 在 种 叶 片 上 检 测 到 了 T V病 毒 的 存 在 , 接 种 植 株 的 未  M 而 出现 坏 死 的 叶 片 上 则 没 有 检 测 到 T V病 毒 的 存 在 , M 这  进 一 步 证 明 了转 基 因 xnh—c 有 丧 失 抗 病 特 性 。此  ati 没 n 外 , 们 还 发 现 在 烟 草 的 下 部 叶 片 接 种 较 大 浓 度 的  我

的 R A干扰 载体不 能沉默 Ⅳ基 因的表达 , C N 故 N基 因 
可 能 是 H N 中 特 有 的 抗 性 基 因 , 而 为 获 得 新 的 烟  ZH 从

草抗病 基 因及 抗病 品种 奠定基础 。  
参 考 文 献 
【  Whta S,D ns— u rSP,C o  1  J i m  h ieh K ma   hi D,e 1 h  rd c o  ta.T epo ut f  
te tb c o no ac vr srssa c  e e N :smiaiyt ola d h  o a c   ls i  iu  e itn e g n   i lrt o tl n    

t   t l kn1r e t [ ] C l 9 4 7 ( ) 10 .l5  h i e e i  e p rJ . e ,19 , 8 6 :1 11 1 . en ru . c o l
【 j T ba  ,R s B,Ma t   2  o isI at   a D z.T b m vrsso p p e , gpa t   o a o i e f e p r eg ln  u
a d tb c o:c mp rtv   o tra t n  n   eoo ia eain  n  o a c o a aieh s e ci sa d srlgc lrlt — o o

T V时 , 引起 同 侧上 部 叶片 发 生超 敏 反 应 , 可 能  M 能 这
是 由 于 发 生 超 敏 反 应 的 坏 死 组 织 不 能 限 制 过 多 的 

sis J u  ln  ah l 9 2,8 :5 —6 . hp l .E r PatP to,18 J J 8 2 72 8 

T MV病毒 , 而一定 量 的 T 从 MV沿着 韧皮 等组 织 向上传  播 的结 果 。  

[  Moe JB,D n lJL h  y esniv ep nea dtei? 3  J rl     ag   .T eh p reste rso s n  h n  i

dc o f e   et i p n [] e  e t Df f 9 7 4  ut no  ld a     l t J .C l D a   ie ,19 , : i cl hn a s l h i
67 . 3. 1 68  

[ ] R a   ,U nsS 4 yl J k e ,Wa   .Ss m c aq i drs t c [ ] s   r E yt i cu e eia e J . d e   r sn  
M  H, O  1   2  

Pl n  y i l 9 4, 1 4: 1 — 1   a tPh s o ,1 9 0 l 09 11 2.

【  Sa g  5J tn eC,Mau     tsJT,E oz  lraA,e 1 dnic tn a dca— t .Ie t a o  n h r a i f i  
a t rz t n o     o e o a c   s i   iu   e it n e N g n   o   c e ia i   fa n v lt b c o mo a c v r sr ssa c     e e h — o

m lgu n ioin a au oo osi Nct a tbcm pa t【 .F n tPa tBo, a lns J J u c  ln  il  
20 0 4,3 ( ) 19 1 8  1 2 :4 .5 .

[ ] 陈 学 平 , 凯 , 繁 明 , .烟 草 品种 对 T 6  夏 孔 等 MV抗 性 差 异 的 

比较 研 究 [ ] 中 同 烟 草科 学 , 0 1 1 :一 . J. 2 0 ( ) l3   [ ] Z a gG i n h n M n ,G oJ m n ,e a.I l i  n   7  h n  a u ,C e   i y g u i i a g t 1 s a o ad   o tn
Ch r c e it s o  h   a a t s i   ft e CN  n r c Ge e.a To a c   s i   r s Re i —   b c o Mo ac Vi   s s  u

tne N Gee moo a c    n Ho l g,f m  o ac J .Bo h m G nt r T b co[   o j ic e   e e,  
2 9,4 3 — 4. 00 7: 01 31  

[ ] H r hR B, r J o m n   8 os     Fy ,H f an N,e a . ef i   as r a c   t 1 L a ds t n om —     cr f  
t n n evn S B,Shleo r R A ( d )Patmoeua  i .I :G li    o e i rot   p   e s ln   lcl r

booyma ul M] lw rA ae c P bi es odeh , i g  n a【 .Ku e  cd mi u l hr,D rrc t l   s  
t e Ne h r n s 1 8 1 9. h   t e l d , 9 8: —   a

[ ] P r JM,Pr CJ e   , t 1 O e xr s no t   — 9 a  k  a   ,LeSB e a. vr pe i  fh t  k   e so eo
图 6 T   MV  CP基 因 的检 测 
注: M:D2 0   ak r H O: 对 照 ; : 种 植 株 接 种 叶 片 ( 坏 死  I 0 0 m re ; 2 水 1接 有 斑 ) 2 接 种 植 株非 接 种 叶 片 ( ;: 无坏 死 斑 叶 片 )  。
b c o T i  e e e c d n   n EREBP a c   slg n   n o ig a   /AP — y e ta s rp i n f c? 2- p   r n c i t   a ? t o   t r e h n e   e it n e a a n t a h g n a t c   n   s t   te s o   n a c s r ssa c   g i s  t o e   t k a d o mo i sr s   p a c

i t ac [ ] Pat e , 0 1 1 :0 5 1 6 n o c o J . l   l 2 0 , 3 1 3 —0 .  b nCl 4  


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