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rna干涉研究进展终稿


贵州大学生命科学学院
硕士学位研究生作业(论文)专用封面

作业(论文)题目:RNA 干涉的研究进展 课程名称: 任课教师姓名: 生命科学研究进展 文晓鹏 赵德刚 王嘉福

研究生姓名:胡昌亮 学 年 专 导 号:2016021226 级:2016 级 业:生物化学与分子生物学 师:周英

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任课教师签名: 年 月 日

目录

摘要..................................................... 2 1 RNA 干涉的研究历程 ..................................... 2 2 dsRNA 的生化性质 ....................................... 3 2 .1 dsRNA 长度对 RNAi 效应的影响 ....................... 3 2 .2 dsRNA 与靶基因的同源性 ............................. 4 2 .3 dsRNA 浓度影响抑制作用 ............................ 4

3 基因沉默 ............................................... 4 4 RNAi 的特点 ............................................ 4 4.1 高特异性 ............................................ 4 4.2 高效率 .............................................. 5 4.3 高成功率 ............................................ 5 5 RNAi 的生物学意义 ...................................... 5 5.1 维持基因组稳定 ...................................... 5 5.2 保护基因组免受外源核酸侵入 .......................... 5 5.3 基因表达调控 ........................................ 6 6 展望................................................... 6 参考文献: ................................................ 6 致谢..................................................... 8

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RNA 干涉的研究进展
胡昌亮 贵州大学生命科学学院 2016021226 摘要:生物体内导入双链 RNA(dsRNA)后会引起体内同源基因特异的沉默, 这种现象称为
RNA 干涉(RNAi).RNAi 在维持基因组稳定、保护基因组免受外源核酸侵入、基因表达调控 等方面发挥重要生物学作用.RNAi 作为基因沉默的一个工具, 已被广泛用于基因功能研 究、基因治疗和新药研究与开发等方面[15].

关键词:双链 RNA(dsRNA);RNA 干涉(RNAi);基因沉默

Progress of research on RNA interference
Summary: Introduction of double-st randed RNA(dsRNA)induces specific gene silencing , a
phenomenon called RNA interference(RNAi).RNAi has important roles in maintaining the stabilization of the genome ,protecting the genome from the invasion of the exogenic nucleic acid .As a gene silencing tool , RNAi has been widely used in gene function research , gene therapy and new drug research and development[15].

Keywords:double-st randed RNA (dsRNA);RNA interference(RNAi); gene silencing
RNA 干涉(RNA interference , 简称 RNAi)是目前分子生物学、分子遗传学等学科近 10 年 来研究的热点之一.双链 RNA(dsRNA)介导的遗传干涉机制是 1998 年首次在秀丽线虫中发 现的, 它通过 dsRNA 的介导特异性地降解相应序列 mRNA , 从而导致转录后的基因沉默 (gene silencing)[1] .RNAi 与锥形虫(trypanosomes)、涡虫(planarian)、水螅(hydra)、果蝇 (Drosophila)、斑马鱼、青蛙、小鼠、植物以及真菌(fungi)等物种中的不同名称的基因沉默 现象十分相似[2-9] , 可能在进化的很早期阶段, 生物就获得了这种机制, 它代表了一个古老 的细胞反应通路.

1 RNA 干涉的研究历程
早在 20 世纪 20 年代, 人们就知道, 如果植物受到野生病毒的感染, 就能产生对另一种 有亲缘关系的烈性病毒的防御力.这可能是最早的 RNAi 现象.Jo nathan G .I(1984)在研 究小鼠 L 细胞时就发现反义 mRNA 会干扰与之同源的基因表达 (Izant and Weintraub ,
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1984), 但是其机制并不清楚 .Jorgensen(1990) 研究牵牛花 (petunia) 转导色素合成基因 时观察到, 不仅是转入的基因表达, 而且自身的色素合成也减弱了, Jorgensen 称这种现 象 为 共 抑 制 (co-suppression).Guo Su(1995) 证 明 了 par-1 基 因 的 失 活 会 破 坏 线 虫 (caenorhabclitis elegans) 第一次卵裂的不对称性 , 同时发现把 par-1 基因的反义 RNA(antisenseRAN)注射进线虫性腺的合胞体细胞中后 , 在受注射的亲本及其子一代的体 细胞中, 产生了 par-1 基因功能缺失型或基因敲除型的表型.但令人吃惊的是, 在她的对 照试验中, 正义 RNA 的单独注入也同样使 par-1 基因的表达受到抑制.这与反义 RNA 技术 的传统解释机制完全违背.华盛顿卡耐基研究院的 Andrew Fire 和马萨诸塞大学医学院的 Craig Mello(1998)首次通过大量尝试证实[10]: Guo Su 发现的正义 RNA 对基因表达的抑制, 以及过去利用反义 RNA 技术对基因表达的阻断 , 都是由体外转录制备的 RNA(sense or antisense RNA)中污染的微量 dsRNA 所引起的.他们将 T4 和 T7 RNA 聚合酶体外转录制备 的单链 RNA 电泳纯化后再注射给线虫, 结果只有微弱的基因抑制作用.相反, 用纯化后的 dsRNA 注射给线虫, 抑制基因表达的效率比纯化后的单链 RNA 至少高 2 个数量级.他们将 这一现象称为 RNAi.Waterhouse(1998)等人证明在植物中的 RNAi 现象也同样是由 dsRNA 导致的.随后, 在短短的一年时间内陆续发现 RNAi 现象也存在于真菌、拟南芥、锥虫、水 螅、 涡虫、 斑马鱼等几乎所有真核生物中[2-7] , 后来又发现甚至在大肠杆菌中也存在与 RNAi 相类似的现象[ 8] .这说明 RNAi 机制很可能是进化的很早期阶段的就已经产生了.在涡虫 中发现 RNAi 现象也为再生分子机制的研究开辟了新的途径.密歇根大学 Clemens(2000)等 人又发现 RNAi 在体外培养的细胞系中也能实现[9] .他们发现对于果蝇的 S2 细胞系, 只要 在无血清培养基中加入适量 dsRNA , 就可诱导产生 RNAi 效应.从而 RNAi 技术为研究细胞 复杂的信号转导途径的生化和分子机制提供了方便.剑桥大学的 Zernicka-Goetz(2002)等 人发现, 在哺乳动物小鼠的早期胚胎中 dsRNA 也能产生特异性的 RNAi 效应[11] .用 dsRNA 注射小鼠受精卵和着床前的胚胎 , 发现能够特异性地阻断相应 C-mos 、 E-cadherin 和 GFP(绿色荧光蛋白)基因的表达.这表明 RNAi 也存在于哺乳动物中, 同时也为 RNAi 研究人 类基因功能和治疗人类疾病提供了希望.

2 dsRNA 的生化性质
2 .1 dsRNA 长度对 RNAi 效应的影响
在线虫、果蝇中研究表明较长的(>100bp)dsRNA 阻抑效应较强[12].在哺乳动物中, 大于 30bp 的 dsRNA 引起的阻抑效应是广泛的、 非特异的, 而不对称性突出 2nt 的约 21nt siRNA 双链复合物可以诱导特异的沉默效应[13] .
3

2 .2

dsRNA 与靶基因的同源性

dsRNA 较长时对序列的特异性要求不是非常严格, dsRNA 碱基修饰的不同也会影响其抑制 作用 .碱基修饰主要有磷酸化和糖基化两种 .硫代磷酸化修饰碱基的种类和数量也影响抑 制作用.单个碱基 A 或 C 或 G 被硫化后影响不大, 而 U 被硫化后抑制作用下降很多.两个 碱基硫化后大大减少了抑制作用 ,更多的碱基被硫化时抑制作用基本上就消失了 .当核甘 糖基化, 如胞嘧啶转换为脱氧胞嘧啶, 或尿嘧啶转换为胸腺嘧啶后抑制作用大大降低.另 外每一种情况下反义链的修饰对抑制的影响更大[14] .

2 .3

dsRNA 浓度影响抑制作用

实验中抑制作用不会随着 dsRNA 浓度的增加而增强 . 可能与 RNA 腺嘌呤核昔酸脱氨酶 (ADARS)的存在有关[14] .

3 基因沉默
基因沉默是指外源基因进入受体有时不能正常表达, 即使外源基因完整地整合到受体基 因组中也会出现转基因完全不表达的情况, 这与转基因本身的缺失、突变和丢失引起的表 达受阻不同.可分为两种类型, 即转录水平的基因沉默(t ranscriptional gene silencing , TGS)和转录后基因沉(post-transcriptionalgene silencing , PTGS), 二 者都与基因同源性有关, 统称为同源依赖型基因沉默(homology-dependentgene silencing ,HDGS).TGS 发生于转录的起始和终止, 是由于 DNA 修饰染色体异染色质化等 原因使基因不能正常转录, 一般只有外源基因发生沉默;而在 PTGS 中, 沉默发生在转录 后, 外源基因能够正常或高速率转录但不进行翻译, 转录的 mRNA 在细胞质内积累水平很 低或根本检测不到,通常是外源基因和内源基因一起沉默, 在植物、动物及真菌上普遍发 生, 分别称为共抑制、RNA 介导病毒抗性(RNA mediated virus resistance ,RMVR)、RNAi 和压抑作用.

4 RNAi 的特点
4.1 高特异性
dsRNA 选择性地引起靶基因 mRNA 的降解具有高度特异性.有时一个碱基改变就会大大 降低靶基因封闭效果.如 Brummelkamp 等[4] 利用载体表达的 small hairpin RNA(shRNA) 来封闭人 MCF-7 细胞的 CDH1 基因, shRNA 上仅一对碱基的突变, 就不能抑制 CDH1 基因 的表达.
4

4.2 高效率
在细胞内, RNAi 途径一旦被启动, 反应信号就可以被一定程度地扩增和放大.有人认为, 最低每个细胞一份拷贝的 dsRNA 就可以封闭基因的效果.

4.3 高成功率
RNAi 已被用于线虫全基因组的功能分析.研究结果表明, 其中 50 %~ 80 %序列选择有 效, 12.9 %~27 %的基因封闭产生了明显的异常表型.

5 RNAi 的生物学意义
5.1 维持基因组稳定
抑制转座子运动:早在 1999 年, Tabara 等[15] 和 Ketting 等[18] 在研究线虫 RNAi 缺陷 的突变株时就发现, 一些 RNAi 缺陷的突变株就表现出内源性的转座子运动增加, 抑制转 座子运动可能是 RNAi 在生物体内的一项自然功能.转座子拷贝如果随机反向整合到邻近 启动子下游, 其转录本就可以和原转座子转录本一起, 形成 dsRNA , 从而引发针对此转座 子及其拷贝的转录后基因沉默 .异染色质的形成与维持 :真核细胞异染色质包含了大量的 重复序列和转座子.位于着丝点附近的异染色质通常和细胞分裂时的染色体分离有关 .插 入到异染色质区域的外源基因通常不表达 .这是由于组成染色质的组蛋白 H3 被去乙酰化 和 Lys9 的甲基化.甲基化的 Lys9 可以和异染色质蛋白 1(HP1)结合, 导致该区域转录阻 滞.Volpe 等[16] 在敲除裂殖酵母 S .pombe 的 RNAi 途径基因(如 argonaut 、 Dicer 、 Rdp1) 时发现, 这些基因敲除后, 可以引起异染色质重复序列转录本的错误堆积、插入到异染色 质区域的转基因的去抑制以及组蛋白 H3 Lys9 的甲基化障碍.因此有人[16] 提出这样一个模 式, 异染色质转录得到的 dsRNA 可能在 RNAi 途径的参与下, 加工成 siRNA , siRNA 募集 HP1 , 然后靶向性地引起相应异染色质区域的转基因沉默 .最近, Hall 等[14]] 研究表明, 着丝粒同源重复序列(cenH)和 RNAi 组分一起正负调节着异染色质的形成并且共同促使异 染色质组装成核.RNAi 和异染色质的关系正在成为一大研究热点.

5.2 保护基因组免受外源核酸侵入
抑制转基因表达: 转基因引起内源基因的共抑制最早是在植物和真菌发现的一种现象 . 当动物细胞被发现有 RNAi 现象以后, 人们发现动物细胞(如果蝇[13] , 线虫[16] )也有共抑 制现象.而且, 动物细胞的共抑制也需要以 RNA 为媒介, 以确定它的靶向性[16] .许多共抑 制相关基因(如 qde-1,2 ,3)和 RNAi 也是相关的.RNAi 和共抑制在许多机制上可能是重叠 的. 转基因如果反向插入到某一启动子的下游 , 产生的转录本就可以和内源转录本一起 ,
5

形成 dsRNA ,从而引发 RNAi , 抑制相应基因的表达.抵抗病毒感染:病毒作为外源核酸进 入生物体后, 会产生 dsRNA 复制中间体, 这种 dsRNA 就可以诱导生物体产生特异性的 PTGS 以及非特异性的干扰素等的抗病毒宿主反应.很早就发现 PTGS 与 TGS 和植物的抵抗 病毒感染有关[18] .

5.3 基因表达调控
近来, 在生物界发现了大量的微小 RNAs(miRNAs), 大小在 22 核苷酸左右.它们在细胞 内多发挥调节基因表达的作用.如线虫的 lin4 和 let7 , 它们通过和靶基因 mRNA 的 3′ 末端非翻译区结合而阻断相应蛋白质的翻译[15] .这些 miRNAs 都是由 Dicer 酶从前体分子 上切割而来.另外, RNAi 途径中的 RdRP 可以识别过量的或异常的 mRNA , 从而启动 RNAi , 来抑制相应基因的表达.最近, 也有人认为 RNAi 和基因印迹有关联.

6 展望
RNAi 一经发现, 立即成为科学研究的一大热点.这是因为 RNAi 这个生物领域的新兴事 物, 本身具有它的神秘性, 同时又具有广阔的应用前景[16].RNAi 已经被应用到线虫的系统 性功能基因组研究上 ,RNAi 作为一个工具, 它的应用范围可以从单细胞的原生动物一直 扩展到人.虽然,RNAi 已被广泛应用到不同种生物, 但仍然有许多问题有待我们进一步阐 明.例如, 不同种生物是否沿用同一种 RNAi 机制? RNAi 机制本身又受到哪些调控?我们认 为, 今后对 RNAi 的研究可能会沿着以下方向发展:1.RNAi 具体分子机制研究;2.RNAi 生 物功能究;3.RNAi 技术在功能基因组学, 基因治疗和药物开发等许多领域的应用研究.

参考文献
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致谢
感谢文晓鹏教授、赵德刚教授、王嘉福教授对此门课程精彩的讲解,使我加深了对生物科 学研究进展的认识,感谢他们开启了我对生物学研究的兴趣。感谢三位教授毫无保留的传 授自己的科研经历、体会,让我今后的科研工作受益匪浅。再次感谢您们的辛勤付出!

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