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RT-PCR实验步骤及注意事项


RT-PCR 实验
时间:2013-01-05 22:32 来源:www.Biojie.com 作者:生物界

RT-PCR 实验有三步:抽提 RNA,RT,PCR。 要求: 1.做 RT 前必需测 RNA 浓度,逆转录体系对 RNA 量还是有一些要求,常用 500ng 或 1ug。 2. RT 按要求做,一般不会出太大问题。 3. PCR,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的 cDNA 存在,不是单改变 Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1)RT 和 PCR 时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?必须 在 RT 时, 引物设计有 3 种方法即 a: Random 9mers; Oligo dT-Adaptor Primer; b: 和 c:特异的下游引物。如果用 a 和 b 方法,是扩增的所有的 cDNA(理论上) , 还要用此产物做 PCR 的模板继续扩增。 如果用 c 方法,那么要去那里查它的序列呢?http://www.ncbi.nlm.nih.gov 问题: 在做 RT-PCR 遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一 种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却 得到许多非特异性的条带, 尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其 解! (注:已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出 来) 从这两种组织中提取的 RNA 的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不 会和这有关呢? 请高手指教! 解答: 1.RT-PCR 有两种做法: 条件具备的话可用 kit 进行一步法进行; 若条件不太好的话可分两步进行逆转录 再 PCR。但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推 测是体系更加单一比较利于 PCR 的进行,当然也可能是我买的 kit 不太好。 (promega) 。 2.RT-PCR 应具备的条件 高质量的 RNA(保留后可做 5‘,3’RACE) ;引物的(最好产物短点) ;若涉及粗 略定量的话还应考虑 RNA 的浓度或是 cDNA 的浓度(如果由内标分子更好,但我 发现其实很不容易将 RNA 的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样) ;体系 的均一性等。 3.RACE 我做过 RACE(3’RACE 是宝生物的 Kit;5‘RACE 是 Gibico) ,但现在再进行另 一个同源基因的 3‘RACE 时却怎么也 P 不出来, 这两个基因是由同一对引物扩增 出来的,其中一个已经获得了全序列(RACE 的方法) ,而另一个基因的 3’UTR 却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的 3‘UTR 太长的缘故,我都快绿了, 有无 RT-PCR 的常用内标 b-actin 和 GAPDH 的使用有选择性吗?比如不同的细胞, 不 同的刺激。

有关内参: RT-PCR 内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些) ,最好分开两管,把 除了引物之外的 mixture 统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基 因表达的相对浓度。 问:我曾经作过同一管的 PCR,内有 actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均 一条带但图片质量不理想(而且酶量、Mg2+加倍) 。请教 mxbdna2003 ,你是如 何处理同一管的 PCR 的各成分的浓度? 答: it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using "accurate piptte" is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime. 在同一管中做 RT,其实没有什么问题,不需要 taq 魅加量,taq 酶本来就是过量 的^-^, (平时做 pcr 的时候,完全可以再省一些 taq 酶的,半斤八两就可以了, 我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg 就跟不能变了,一变整个体系就变 了。能看到均一条带就很好了。 关键是摸,十八摸(太少,只争朝夕,开个玩笑)虽然用不着,但是摸上 3、5 摸总是必要的,首先遥分开摸,然后再一起摸,直到摸的好了,还要考虑比较的 不同的模板中的量, 所以我们不建议再同一管中进行,因为还有互相竞争抑制的 问题,即使不同基因之间。 有关内参的建议: 一定要做内参的,每一次,我想。不作内参的结果是不可信的 电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度,着我在好几封帖子里都 谈了,再说一边我得观点,1、半定量和定量 RT-PCR 做的都是基因相对表达量, 不是绝对表达量,除非你能准确知道来自多少细胞,但是细胞还有死的呢。2、 以电泳为基础的半定量 RT-PCR 本身是不可信的,作为实验的粗筛是可以的,但 不能作为最终结果的,3、半定量 RT-PCR 应该再两管中进行,除非内参基因和目 的基因表达相同, 长度差不多, 含量相似, GC 或者实在穷的要省 PCR 管和 taq。 关于平台期和线性期的问题,实际上线性期是指数期,只不过碰巧 2 的冥和 2 的倍数是相同的。看上去任何一个时期都可以,实际上是不对的,因为牵涉到酶 促动力学的问题,这个我也不懂,有一些专门的文章,好像,涉及到很多化学的 东西。我们学医的,也没必要知道那些,但是其中主要是因为模板引物酶原料和 buffer 之间的关系,这种反应单靠改变其中一种成分没有用的,酶一直是过量, 再加酶也没用,引物 ntp 都是这样。烟鬼正传,最好选线性期的开始阶段,但是 要在你的凝胶成像分辨范围内, 所以选一个这两种的契合点。给你一张图你就明 白了,再开始的时候酸的是切线,这图我在 *** 帖过。 关于引物设计, 再可能的情况下, 除了常规要求之外, 最好兼顾跨内含子 (不过, 根据要求,还可以专门设计隔内含子的,这样还可以用于基因组 PCR) 、长度小 于 500bp-600bp 等等。 引物当然要设计成一样的退火温度,即使不再一管中,也要一样的,要在一台机 器里啊。我的引物占了冰箱一格,大部分是一个温度,这样任何几个都可以拿来 披,也不用查。 我反复说过了,别用软件,就用眼睛看,软件涉及的在好,有些基因在它出软件

的时候,还没发现呢,跟不要说在基因组的位置和序列了,怎么考虑内含子的问 题呢? 18s 的引物也和著名的 β actin 一样是设计的,只要拿到序列就可以了,但是限 制是只能用总 RNA 为模板, 但是比 actin 和 bubulin 等可准多了, 更不要说 GAPDH 这个破烂了。18s 除了在细胞中更相同(量)外,主要是它占的比例远远高于看 家基因,所以定量更加准确,我想,不知对不对,请几位主任和 eeflying 指教。 我认为,就像你用某一种东西的数量去概括,因该选那种多的东西,说一座房子 是由 2000 块砖造成的, 比说又 29 根梁更准确吧。更不要说没有看家基因不看家 的缺点,因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。 PE 有专门的用于实时 PCR 的内参试剂盒,就是用 18s,不过我们看懂使用的那条 序列,不知有没有人用过,告知其序列和 genbank 号。 正好问一下,我查了一些序列,一直没有去合成,主要是因为手上的 actin 的荧 光探针还没有完,当初和成了一堆。 有那位高手用过 18s 的内参,请问您的序列(我指的是模板的序列)? 原位杂交最好用 RNA 做探针,效果好一些,反正你有钱卖 roche 的盒子,而且量 也能保证, 因为转录过程嘛, 沿着一条线突突地跑就是了。 正义反义也容易理清。 我觉得做 RT-PCR 的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有 详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难,有时就是得不出结果。因此,我认 为因为每个人所要克隆的片断不同,引物不同等,因此对不同的人来说还是有他 自己的特殊性,我的以下经历说明: 做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好 好动一下脑子。 记得我开始我的RT-PCR 时,按常规方法,提取总RNA后,首先用自己 设计的下游引物进行逆转录,不断改变反应条件,进行了N次均没有结果。后来 考虑到本人的克隆的 PCR 的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中, 而该 同学已经用 RT-PCR 克隆出她的片断(尽管她用这些RT-PCR产物做模版再 进行PCR时也没办法重复出她的产物) ,因此,我先用她的引物和条件扩增出 她的片断,然后用她的RT-PCR产物作模板(有点改进,逆转录反应换用了 9mers 随机引物) ,用我的引进物进行一般 PCR,终于得到我的产物,测序结果 完全正确。 尽管我的这个经历别人很人遇到,但足可以说明实验可以有自己的模 式, 书本的知识和别人的经验很重要,但有时也不定要受到书本框框和别人经验 的限制 请问: 1 引物的特异退火温度怎样设定?可以根据 gc 和 at 含量算出吗?可以用引物 报告单上的 Tm 值吗? 2 PCR 时 20 微升体系中 cDNA 应加多少比较合适?MgCl2 应加多少?各个成分的 量有无确定标准? 3 PCR 结果跑电泳,actin 有,但跑不出目的条带,有几种原因?与 cDNA 的量少 有关吗?Mg 离子太多是否会抑制 Taqase 的活性? 一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩 下的可以摸的. 20 中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加 1,2ul 都可以的.mg 要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的. 如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了. 在所有 RNA 实验中,最关键的因素是分离得到全长的 RNA。而实验失败的主要原

因是核糖核酸酶(RNA 酶)的污染。由于 RNA 酶广泛存在而稳定,一般反应不需 要辅助因子。 因而 RNA 制剂中只要存在少量的 RNA 酶就会引起 RNA 在制备与分析 过程中的降解,而所制备的 RNA 的纯度和完整性又可直接影响 RNA 分析的结果, 所以 RNA 的制备与分析操作难度极大。 在实验中, 一方面要严格控制外源性 RNA 酶的污染;另一方面要最大限度地抑制 内源性的 RNA 酶。RNA 酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。 外源性的 RNA 酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其它分 子生物学实验中使用的 RNA 酶也会造成污染。这些外源性的 RNA 酶可污染器械、 玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中 则含有大量内源性的 RNA 酶。 一、 防止 RNA 酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于 180℃的高温下干烤 6hr 或更长时间。 2. 塑料器皿可用 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被 氯仿腐蚀,故不能使用) 。 3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡 在 3% H2O2 室温 10min,然后用 0.1% DEPC 水冲洗,晾干。 4. 配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC,在 37℃处理 12hr 以上。然后用高压灭 菌除去残留的 DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用 DEPC 处理过的无菌双蒸水配 制,然后经 0.22μ m 滤膜过滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。 6. 设置 RNA 操作专用实验室,所有器械等应为专用。 二、常用的 RNA 酶抑制剂 1. 焦磷酸二乙酯(DEPC) :是一种强烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂。它通过和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。 2. 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的 RNA 酶抑制剂,它在裂解组织的同时也 使 RNA 酶失活。 它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对 RNA 酶有 强烈的变性作用。 3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和 RNA 酶结合 形成过渡态类物质,几乎能完全抑制 RNA 酶的活性。 4. RNA 酶的蛋白抑制剂 (RNasin) :从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。 RNasin 是 RNA 酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种 RNA 酶结合,使其失活。 5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对 RNA 酶也有一定抑制作用。 mRNA 的分离与纯化 真核细胞的 mRNA 分子最显著的结构特征是具有 5’端帽子结构(m7G)和 3’端 的 Poly(A)尾巴。 绝大多数哺乳类动物细胞 mRNA 的 3’端存在 20-30 个腺苷酸组 成的 Poly(A)尾,通常用 Poly(A+)表示。这种结构为真核 mRNA 的提取,提 供了极为方便的选择性标志,寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分 离纯化 mRNA 的理论基础就在于此。 mRNA 的分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常 规方法。此法利用 mRNA 3’末端含有 Poly(A+)的特点,在 RNA 流经寡聚(dT) 纤维素柱时,在高盐缓冲液的作用下,mRNA 被特异地结合在柱上,当逐渐降低 盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下,mRNA 被洗脱,经过两次寡聚(dT) 纤维柱后,即可得到较高纯度的 mRNA。 寡聚(dT)纤维素柱纯化 mRNA

一、试剂准备 1.3M 醋酸钠(pH 5.2) 2.0.1M NaOH 3.1×上样缓冲液:20mM Tris-HCl(pH 7.6);0.5M NaCl;1M EDTA(pH 8.0) ; 0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制 Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至 65℃时,加入经 65℃温育(30min)的 10%SLS 至终浓度为 0.1%。 4.洗脱缓冲液:10mM Tris-HCl(pH 7.6);1mM EDTA(pH 8.0);0.05% SDS 5.无水乙醇、70%乙醇 6.DEPC 二、操作步骤 1.将 0.5-1.0g 寡聚(dT)-纤维悬浮于 0.1M 的 NaOH 溶液中。 2. DEPC 处理的 1ml 注射器或适当的吸管, 用 将寡聚 (dT) -纤维素装柱 0.5-1ml, 用 3 倍柱床体积的 DEPC H2O 洗柱。 3.使用 1×上样缓冲液洗柱,直至洗出液 pH 值小于 8.0。 4.将 RNA 溶解于 DEPC H2O 中,在 65℃中温育 10min 左右,冷却至室温后加入 等体 2×上样缓冲液,混匀后上柱,立即收集流出液。当 RNA 上样液全部进入柱 床后,再用 1×上样缓冲液洗柱,继续收集流出液。 5.将所有流出液于 65℃加热 5min,冷却至室温后再次上柱,收集流出液。 6.用 5-10 倍柱床体积的 1×上样缓冲液洗柱,每管 1ml 分部收集,OD260 测定 RNA 含量。前部分收集管中流出液的 OD260 值很高,其内含物为无 Poly(A)尾的 RNA。后部分收集管中流出液的 OD260 值很低或无吸收。 7. 2-3 倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱 Poly(A+)RNA, 用 分部收集, 每部分为 1/3-1/2 柱体积。 8.OD260 测定 Poly(A+)RNA 分布,合并含 Poly(A+)RNA 的收集管,加入 1/10 体 积 3M NaAc(pH5.2) 、2.5 倍体积的预冷无水乙醇,混匀,-20℃放置 30min。 9.4℃离心,10000g×15min,小心吸弃上清。用 70%乙醇洗涤沉淀。[注意:此 时 Poly(A+)RNA 的沉淀往往看不到]。4℃离心,10000g×5min,弃上清,室温晾 干。 10. 用适量的 DEPC H2O 溶解 RNA。 三、注意事项 1.整个实验过程必须防止 Rnase 的污染。 2.步骤(4)中将 RNA 溶液置 65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个, 一个是破坏 RNA 的二级结构, 尤其是 mRNA Poly(A+)尾处的二级结构, Poly(A+) 使 尾充分暴露, 从而提高 Poly(A+)RNA 的回收率; 另一个目的是能解离 mRNA 与 rRNA 的结合,否则会导致 rRNA 的污染。所以此步骤不能省略。 3.十二烷基肌氨酸钠盐在 18℃以下溶解度下降,会阻碍柱内液体流动,若室温 低于 18℃最好用 LiCl 替代 NaCl。 4.寡聚(dT)-纤维素柱可在 4℃贮存,反复使用。每次使用前应该依次用 NaOH、 灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。 5.一般而言,107 哺乳动物培养细胞能提取 1-5μ g Poly(A+)RNA,约相当于上 柱总 RNA 量的 1%-2%。 RNA 酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义 RNA 探针与样品杂交, 以检测 RNA 表达的技术。 Northern 杂交和 RT-PCR 比较, 与

RPA 有以下几个优点: 1. 检测灵敏度比 Northern 杂交高。由于 Northern 杂交步骤中转膜和洗膜都将 造成样品和探针的损失,使灵敏度下降,而 RPA 将所有杂交体系进行电泳,故损 失小,提高了灵敏度。 2. 由于 PCR 扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题,基于 PCR 产物量进行 分析所得数据的可靠性将下降,而 RPA 没有扩增过程,因此,分析的数据真实性 较高。 3. 由于与反义 RNA 探针杂交的样品 RNA 仅为该 RNA 分子的部分片段,因此,部 分降解的 RNA 样品仍可进行分析。 4. 步骤较少,耗时短。与 Northern 杂交相比,省去了转膜和洗膜的过程。 5. RNA-RNA 杂交体稳定性高,无探针自身复性问题,无须封闭。 6. 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交,无竞争性问题。 7. 检测分子长度可以任意设置,灵活性大。 RPA 的缺点是需要同位素标记探针。 一、试剂准备 1. GACU POOL:取 100mM ATP、CTP、GTP 各 2.78μ l、100mM UTP 0.06μ l,加 DEPC H2O 至 100μ l。 2. 杂交缓冲液 IPES 0.134g、0.5M EDTA(pH8.0)20μ l、5M NaCl 0.8ml、甲 酰胺 8ml,加 DEPC H2O 至 10ml。 3. RNase 消化液: NaCl 120μ l、 Tris-HCl(pH7.4) 20μ l、 5M 1M 0.5M EDTA pH8.0) ( 20μ l、RNase A(10mg/ml) 8μ l、RNase T1(250U/μ l) 1μ l,加 DEPC H2O 至 2ml 二、操作步骤 1. 反义 RNA 可由含 T7 或 SP6 启动子的重组质粒为模板制备,也可以用含启动子 的 PCR 产物为模板制备,本文介绍后者。 (1)设计含 T7 启动子的 PCR 引物 由于 PCR 产物将作为合成反义 RNA 的模板,所以一对引物中的下游引物 5’-端 要含 T7 启动子序列: T7 启动子序列为:5’-TAATACGACTCACTATAGGG 引物设计的其他要求与一般 PCR 引物的设计相同。 产物的长度决定了反义 RNA PCR 探针的长度,具体设计时可考虑 100-400bp 长。最好采用巢式 PCR,即先扩增出 一较长的片段,再以该片段为模板扩增出较短的片段,以保证探针的特异性,如 下图所示: 上游引物 下游引物Ⅱ T7 启动子序列 下游引物Ⅰ (2)PCR 先用上游引物和下游引物Ⅰ进行 PCR,再以 PCR 产物为模板,用上游引物和下游 引物Ⅱ-T7 进行二次 PCR(具体操作参见 PCR 章节)。 (3)探针合成标记与纯化 在 0.5ml 离心管中加入下列试剂: RNasin (40U/μ l) 0.5μ l GACU POOL GAC

(含 GTP、CTP、ATP 各 2.75 mM,UTP 61μ M) 2μ l [α -32P]UTP(10μ Ci/μ l) 2.5μ l DTT (二硫苏糖醇,0.1M) 1μ l 5×转录 buffer 2μ l 模板(50ng/μ l) 1μ l T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μ l 混合后,短暂离心,37OC 保温 1hr。 加入 DNaseⅠ(10U/μ l)1μ l, 37OC 15min, 然后 75 OC 10min 以灭活 DNAse Ⅰ和 T7 RNA 聚合酶。 加入:饱和酚 50μ l 氯仿 50μ l 酵母 tRNA(2μ g/μ l) 4μ l DEPC H2O 100μ l 室温下充分混匀,离心 10000g×2min。取上层液置另一 0.5 ml 离心管中,加入 100μ l 氯仿, 混匀, 离心 10000g×2min。 将上层液转移至另一 0.5ml 离心管中, 再加入 3M NaAc 10μ l、预冷无水乙醇 250μ l,混匀后,-20OC 静置 30min。4OC 离心 13500g×10min。弃上清液,沉淀用 75%乙醇 100μ l 洗涤,4OC 离心 13500g×2min, 弃上清液。 室温下挥发残留乙醇。加入 50μ l 杂交缓冲液溶解沉 淀,4OC 下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。 (参见本节 电泳步骤) 。 2.杂交 (1) RNA 提取后溶解在杂交缓冲液中,浓度为 1μ g/μ l。 (2)取 8μ l RNA 加入 1-3μ l 探针(根据探针检测结果调整)于 0.5ml 离心管 中。 (2) 80OC 保温 2min,然后 40-45OC 下杂交 12-18hr。 3. 消化 (1) 杂交管于 37 OC 保温 15min,加入 RNase 消化液,37 OC 保温 30min。 (2) 加入 10%SDS 10μ l、 10μ g/μ l 蛋白酶 K 20μ l, 混匀, OC 保温 10min。 37 (3) 加入 65μ l 饱和酚和 65μ l 氯仿,混匀,室温离心,10000g×2min。 (4) 转移上层液到另一 0.5 离心管中,加入 10μ l 酵母 tRNA 和 3M NaAc 15μ l, 再加入 200μ l 异丙醇,混匀后,置-20OC 30min,4 OC 离心,135000g×10min。 (5) 弃上清液,室温下挥发乙醇,加入 5-8μ l 上样缓冲液溶解沉淀。 4、电泳与放射自显影 (1)配制凝胶:(50ml) 40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺(19:1) 6.25ml 5×TBE 10ml 尿素 24g 加 H2O 至 50ml 溶解后加入 25%过硫酸胺 50μ l,TEMED 50μ l,混匀,注入电泳槽中,插入梳, 待胶凝固。 (2)预电泳 以 1×TBE 为上下槽电泳缓冲液,加上电压后进行预电泳,如果用测序电泳装置, 电压应达 2000v 以上,功率设定为 100w,温度设为 50 OC。待胶板温度达 50 OC 时,暂停电泳,准备加样。

(3)加样 将已溶解在加样缓冲液中的样品 80 OC 加热 2min,立即加样到胶孔中,电泳 1-2hr。 (电泳条件同预电泳) 。 (3) 电泳结束后,打开胶板,用滤纸取下胶,覆上一层保鲜膜,放置于暗盒中, 暗室红光下,压上一张 X 片,盖上暗盒,-70OC 曝光 1-3 天。暴光结束后,将 X 光片显影、定影、水洗、晾干。 三、注意事项 1.本实验大部分为 RNA 操作,注意 RNA 酶的污染。 2. RNase 消化液消化未杂交的单链 RNA 和探针 RNA,当探针与样品之间有碱基错 配时,错配位点也将被消化,因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行 PCR 时,采取尽量减少错配的措施。 3、 同位素对 RNA 合成有一定影响,有时会产生非全长的探针。因此,标记时间 不宜过长。 4、 RNase 消化液有时会产生过度消化而无检测信号,可以将消化液稀释 10-100 倍后使用。 可能问题出在标本的保存:一般四小时之内就应处理,分离出细胞 说的是套式 PCR,可以在你的第一次 PCR 两个引物内,再设计一对引物进行第二次 PCR 就行了 如果你的第一次 PCR 刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了 第二次的引物设计要求可以低一点 以 50μ l 体系为例 引物各 1μ l 第一次 PCR 产物 5μ l 二次 PCR 和巢式 PCR,即设计两对引物进行扩增,不是一个概念,它是拿第一次 的 PCR 产物,稀释 100-1000 倍做模板,加入底物,从新进行扩增反应,以期增 加产物的量 我做 RT-PCR 时,提总 RNA 时,都是用灭菌 DEPC 水,按 1:100 稀释后测 OD260 和 OD280,后根据公式:RNA 浓度=OD260*稀释度/25(ug/ul),后用 1mg total RNA 分 离 mRNA.做逆转录及 PCR,效果很好. luoyu10 wrote: 各位大哥: 我有一个问题请教,RT-PCR 要求模板 RNA 的 260nm/280nm 的比值最低为多少, 如果太低是不是会影响结果? 最低到 1.8,最好 2.0,我感觉稍微低一点影响不算太大。 问:我是RT-PCR的新手,想请教引物如何设计? 好的引物所具有的令人满意的特点: * 典型的引物 18 到 24 个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低 序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于 24 核苷的引物并不意味着 更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比 短序列杂交慢,从而降低了产量。 * 选择 GC 含量为 40%到 60%或 GC 含量反映模板 GC 含量的引物。 * 设计 5’端和中间区为 G 或 C 的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的

序列杂交的稳定性。 * 避免引物对 3’末端存在互补序列,这会形成引物二聚体,抑制扩增。 * 避免 3’末端富含 GC。设计引物时保证在最后 5 个核苷中含有 3 个 A 或 T。 * 避免 3’末端的错误配对。3’端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 * 避免存在可能会产生内部二级结构的序列,这会破坏引物退火稳定性。 目的序列上并不存在的附加序列,如限制位点和启动子序列,可以加入到引物 5’端而不影响特异性。 当计算引物 Tm 值时并不包括这些序列,但是应该对其进 行互补性和内部二级结构的检测。 有时候, 仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。 比如, 如果仅知道氨基酸序列, 可以设计简并引物。 简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不 同序列的混合物。为了增加特异性,可以参考密码子使用表,根据不同生物的碱 基使用偏好,减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对,降低引物的退火温 度。不要在引物的 3’端使用简并碱基,因为 3’端最后 3 个碱基的退火足以在 错误位点起始 PCR。使用较高的引物浓度(1μ M 到 3μ M) ,因为许多简并混合物 中的引物不是特异性针对目的模板。 【经验】如何确认 RNA 的质量 各位都知道, 提取到质量良好的 RNA (包括总 RNA 和 mRNA, 以下同) 是非常困难, 关于 RNA 的提取技术,我就不说了,为什么呢?或许各位非常关心呢,我是这样 想的,我可以看到的资料或者是厂家的说明书,各位也同样可以看到的,内容当 然都是一样的了,所以实验做的好不好,主要是心的投入多少的问题,所以希望 大家自己多多思考啊! 以下两种方法,相信大家都知道的: 1)检测 RNA 溶液的吸光度 280、320、230、260nm 下的吸光度分别代表了核酸、背景(溶液浑浊度) 、盐浓 度和蛋白等有机物的值。一般的,我们只看 OD260/OD280(Ratio,R) 。 1.82.0 时,我们认为 RNA 中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的,不过 要注意,当你用 Tris 作为缓冲液检测吸光度时,R 值可能会大于 2(一般应该是 <2.2 的) 。当 R<1.8 时,溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显,你可以 根据自己的需要决定这份 RNA 的命运。当 R>2.2 时,说明 RNA 已经水解成单核酸 了。 如果 RNA 的量够,可在 260nm(A260)用分光光度法测定 RNA 的得率,1 个单位 等于 40ug/mlssRNA。纯 RNA 的 A260/A280 的比值为 2.0。A260/A230 的比值还表 明 RNA 的纯度,其值小于 2.0 表明裂解液中有亚硫氰胍和 belta-巰基乙醇残留, 其值大于 2.4,需用乙酸盐,乙醇沉淀 RNA。 2)RNA 的电泳图谱 一般的,RNA 的电泳都是用变性胶进行的,但是根据我的经验,如果你仅仅是为 了检测 RNA 的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的, 用普通的琼脂糖胶就可以 了。 电泳的目的是在于检测 28S 和 18S 条带的完整性和他们的比值,或者是 mRNA smear 的完整性。一般的,如果 28S 和 18S 条带明亮、清晰、条带锐利(指条带 的边缘清晰) ,并且 28S 的亮度在 18S 条带的两倍以上,我们认为 RNA 的质量是 好的(见下图) 。 以上是我们常用的两种方法, 但是这两种方法都无法明确的告诉我们 RNA 溶液中 有没有残留的 RNA 酶。 如果溶液中有非常微量的 RNA 酶,用以上方法我们很难察

觉,但是大部分后续的酶学反应都是在 37 度以上并且是长时间进行的。这样, 如果 RNA 溶液中有非常微量的 RNA 酶, 那么在后续的实验中就会有非常适合的环 境和时间发挥它们的作用了,当然这时你的实验也就完了。 下面,我们介绍一个可以确认 RNA 溶液中有没有残留的 RNA 酶的方法。 3)保温试验 方法很简单的,按照样品浓度,从 RNA 溶液中吸取两份 1000 ng 的 RNA 加入至 0.5 ml 的离心管中,并且用 pH7.0 的 Tris 缓冲液补充到 10 ul 的总体积,然后 密闭管盖。把其中一份放入 70℃的恒温水浴中,保温 1 h。另一份放置在-20℃冰 箱中保存 1 h。 时间到了之后,取出两份样本进行电泳。电泳完成后,比较两者的电泳条带。如 果两者的条带一致或者无明显差别(当然,它们的条带也要符合方法 2 中的条 件) ,则说明 RNA 溶液中没有残留的 RNA 酶污染,RNA 的质量很好。相反的,如 果 70℃保温的样本有明显的降解,则说明 RNA 溶液中有 RNA 酶污染。 如果你的 RNA 样本通过了保温实验的检测并且你在后续的实验中还是非常小心 的防范 RNA 酶的骚扰,那么你的实验应该是很难失败了!


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