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分子生物学实验A实验指导2013


生物化学与分子生物学实验指导

分子生物学实验部分

实验 1
一、实验目的

不连续 SDS-PAGE

掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和操作方法, 以及 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理和方 法。 二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的分辨率,用它分离、检测蛋白质混合样品,主要是根据各蛋白组分 的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。 SDS(十二烷基硫酸钠)是一种阴离子型去污剂,在蛋白质溶解液中加入 SDS 和巯基乙醇后,巯基 乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原。SDS 能使蛋白质的非共价键(氢键、疏水键)打开,并结合带蛋 白质分子上(在一定条件下,大多数蛋白质 SDS 的结合比为 1.4g SDS/g 蛋白质) ,形成蛋白质-SDS 复合 物。由于 SDS 带有大量负电荷,当它与蛋白质结合时,所带的负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的 电荷量,因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。 SDS 与蛋白质结合后,还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质 SDS 复合物的流体力学和光学性质表 明, 它们在水溶液中的形状, 近似于雪茄烟形的长椭圆棒。 不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样, 而长轴则随蛋白质相对分子质量的大小成正比的变化。这样的蛋白质。SDS 复合物在凝胶中迁移率,不 再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而只是椭圆棒的长度,也就是蛋白质相对分子质量的函数。 SDS-PAGE 缓冲系统有连续系统和不连续系统。不连续 SDS-PAGE 缓冲系统有较好的浓缩效应, 近年趋向用不连续 SDS-PAGE 缓冲系统。按所制成的凝胶形状又有垂直板型电泳和垂直柱型电泳。本实 验采用 SDS 不连续系统垂直板型电泳测定蛋白质的相对分子量。 将已知相对分子质量的标准蛋白的迁移率对分子量的对数作图,可得到一条标准曲线。将未知相对 分子量的蛋白质样品,在相同的条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率可在标准曲线上查得它的相对分 于量。也可以用相关分析软件得出回归方程并计算出结果。 三、溶液与试剂 1、30%丙烯酰胺贮存液:29g 丙烯酰胺和 1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于 100ml 热水中,验证其 pH 值不大 于 7.0。置棕色瓶中,4℃保存。 (由于所需药品为为神经毒性物质,注意不要经口鼻吸入,皮肤不要碰到 药品,所以称量时,请戴上口罩,带好手套) 2、1.5mol/L Tris(pH8.8)溶液 3、10% SDS 溶液 4、10%过硫酸铵:新鲜配制 5、TEMED 溶液:4℃保存 6、1.0 mol/L Tris(pH6.8)溶液 7、2×样品溶解液:2%SDS,5%巯基乙醇,10%甘油,0.02%溴酚蓝,0.01mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液。 8、5×Tris-甘氨酸电极缓冲液:每 1000ml 该溶液中,含 15.1g Tris,94g 甘氨酸和 50ml 10%(W/V)SDS 贮存液。 9、固定液:冰乙酸:甲醇:水=1:2:7 10、考马斯亮蓝 R 染色液:每 100ml 甲醇、水、冰乙酸混合物(9:9:2)中,溶解 0.25g 考马斯亮蓝 R,过 滤除去未溶物。 11、脱色液:甲醇:水:冰乙酸=9:9:2 四、操作步骤:

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分子生物学实验部分

1、准备步骤 1)将凝胶板依次用水、洗衣粉、水,洗涤干净,然后使其自然风干或烘干。 2)试样格(梳子)临用前用无水乙醇擦拭,让其挥发至干。 3)灭菌枪头、eppendorf 管。 2、制备凝胶 1)安装玻璃板、板条,并将玻璃板固定在电泳槽中,以 5%琼脂封底。 (手指不能接触灌胶面的玻璃板) 。 2)配制 10%的分离胶(20ml) :依次将 8ml 蒸馏水,6.7ml 30%丙烯酰胺贮存液,5ml 1.5mol/L Tris(pH8.8) 溶液,0.2ml 10% SDS 溶液,0.2ml 10%过硫酸铵,0.008mlTEMED 混合,立即灌胶。 3)迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶,直至剩余的板宽比梳子长度多 1cm。小心在胶上覆一薄层正丁醇。 4)在分离胶聚合的过程(约 40 分钟)中,配制 5%的积层胶(8ml) :依次混合 5.5ml 蒸馏水,1.3ml 30% 丙烯酰胺贮存液, 1.0ml 1.0 mol/L Tris (pH6.8) 溶液, 0.08ml 10% SDS 溶液, 0.08ml 10%过硫酸铵, 0.008ml TEMED。TEMED 应在灌胶前才加入。 5)分离胶聚合完全后,倒去正丁醇,用蒸馏水冲洗胶面数次,用滤纸吸干胶面上的残余水。 6)灌注积层胶,立即插入干净的梳子,避免产生气泡。 7)积层胶聚合完全后,小心拔出梳子,用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次,以除去未聚合的丙烯 酰胺。 8)在上下电泳槽中加入足够的电泳缓冲液。 3、样品的制备 在蛋白溶液中加入等体积的 2×样品溶解液,使蛋白的终浓度为 3-4mg/ml,混合液在沸水浴中加热 3 分钟,冷却后即可上样。 4、上样 用微量进样器(或移液枪)上样,每加入一种样品,应在下槽中洗涤加样器数次,最后在空白加样孔中 加入等体积的 SDS 样品溶解液。 5、电泳 装好冷凝水系统,打开电源,初始电压为 100-120V,当染料进入分离胶(这段时间约为 20min)后, 将电压提高到 200-220V,继续电泳直至染料到达离凝胶底部 1cm 处。 6、后处理 1)固定:从电泳装置上卸下玻璃板,用镊子小心撬开玻璃板,除去积层胶部分,将分离胶移入固定液(固 定液的量至少为胶体积的 5 倍)中固定,直至染料由蓝绿色变为黄色。 2)染色:除去固定液,加入染色液(用量同上) ,室温染色 8 小时或 60℃染色 0.5 小时。 3)脱色:回收染色液,将凝胶浸泡于脱色液中,直至背景脱至无色,其间更换脱色液 3-4 次。 4)拍照:将脱色完后,呈现出清晰蛋白条带的凝胶用数码相机拍照,附于实验报告中。 五、注意事项 N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质,可经皮肤直接吸收,使用时应避免其直接接触皮肤,必要时应 戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。 六、思考题 1. 浓缩胶(积沉胶)和分离胶什么区别?各自在电泳中的主要作用? 2. 配胶时,为什么过硫酸铵和 TEMED 要最后加入? 3. 样品溶解液中各组分的作用分别是什么?

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分子生物学实验部分

实验 2
一、目的要求

蛋白质含量的测定方法

掌握考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量的实验原理和操作方法。 二、实验原理 考马斯亮蓝 G250 比色法是常用的一种蛋白质浓度的测定方法。1976 年由 Bradford 建立,因此也被称 为 Bradford 法。考马斯亮蓝 G250 是一种染料,在酸性溶液中为红色,最大光吸收波长为 465nm。能与蛋 白质通过疏水作用结合,形成蛋白质-染料复合物,颜色由红色转变为蓝色,最大光吸收波长为 595nm,并 且在低浓度范围(0.01―1.0mg/mL)内,与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。 该方法操作简单,反应迅速,2min 左右可以达到平衡;灵敏度高,可测定微克级蛋白含量;生成的染 料-蛋白质复合物颜色稳定,实验重复性好。 三、实验材料 1、实验设备 电子天平、分光光度计、恒温水浴锅 2、试剂 考马斯亮蓝 G250、牛血清蛋白、NaCl、95%乙醇、85%磷酸 四、操作步骤 (一)试剂配制 1、考马斯亮蓝 G250 溶液配制 准确称取 100mg 考马斯亮蓝 G250, 溶于 50mL95%乙醇, 加入 100mL85%磷酸, 最后用蒸馏水稀释定容到 1000mL。 2、牛血清蛋白溶液配制 准确称取 50mg 牛血清蛋白,加入 0.526gNaCl,溶于少量蒸馏水中,然后稀释定容到 500mL,配制成 浓度为 100μ g/mL 的牛血清蛋白原液。 (二)标准曲线的制作 1、 5-7 支试管, 取 分别准确配制不同浓度梯度的牛血清蛋白溶液 (浓度控制在 10~100μ g/mL 范围内) 1mL; 2、在不同浓度的 1mL 牛血清蛋白溶液中,分别加入 5mL 考马斯亮蓝溶液,混合均匀,置于 25℃水浴保温 10min; 3、冷却后测定波长 595nm 处的吸光值; 4、以 1mL 蒸馏水加 5mL 考马斯亮蓝溶液为空白对照。以配制的标准蛋白浓度为横坐标,对应吸光值为纵 坐标制作标准曲线,并做线性回归分析,求线性方程。 (三)目标样品的蛋白浓度测定 取目标蛋白样品按标准曲线方法测定 A595。依据线性方程计算目标样品的蛋白质浓度。 五、注意事项 1、染料-蛋白复合物形成受温度和时间影响较大,反应需控制在同一条件下进行。 2、比色杯易受蓝色污染,应注意用乙醇清洗。

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分子生物学实验部分

实验 3

植物总 DNA 的提取

生物总 DNA 的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不 同,而细胞壁结构的破坏是提取总 DNA 的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异, 因此不同生物采用的提取方法也不同,一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用 CTAB 法 提取植物总 DNA 的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习 CTAB 法提取植物总 DNA 的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定 DNA 的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨,可使细胞壁破裂,加入去污剂(如 CTAB) ,可使核蛋白体解析,然后使蛋白 和多糖杂质沉淀,DNA 进入水相,再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用 CTAB 法,其主要作用是破膜。 CTAB 是一种非离子去污剂,能溶解膜蛋白与脂肪,也可解聚核蛋白。植物材料在 CTAB 的处理下, 结 合 65℃ 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB 与核酸形成复合物,此复合物在高盐 (>0.7mM)浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0.1-0.5mM NaCl)下 CTAB-核酸复合物就因溶解 度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、 多糖、色素等来纯化 DNA,最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将 DNA 沉淀分离出来。 由于核酸、 蛋白质、 多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。 核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在 260nm。 纯的 DNA 样品 A260/280 ≈ 1.8,纯的 RNA 样品 A260/280 ≈ 2.0,并且 1μg/ml DNA 溶液 A260 = 0.020。 [实验器材] 电子天平、高压灭菌锅、冰箱、恒温水浴锅、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、剪刀、陶瓷研钵和 杵子、磨口锥形瓶(50ml) 、滴管、细玻棒、小烧杯(50ml) 、离心管(50ml) 、植物材料 [实验试剂] 1、3× CTAB buffer(pH8.0) 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M 3% 2% NaCl CTAB β-巯基乙醇

2、TE 缓冲液(pH8.0) 10mmol/L Tris· HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液(24:1,V/V) 4、95%乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取 2g 新鲜的植物叶片,用蒸馏水冲洗叶面,滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成 1cm 长,置预冷的研钵中,倒入液氮,尽快研磨成粉末。

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分子生物学实验部分

3、待液氮蒸发完后,加入 15mL 预热(60℃)的 CTAB 提取缓冲液,转入一磨口锥形瓶中,置于 65℃ 水浴保温 0.5h,不时地轻轻摇动混匀。 4、加等体积的氯仿/异戊醇,盖上瓶塞,温和摇动,使成乳状液。 5、将锥形瓶中的液体倒入 50ml 离心管中,在 4℃下 8000rpm 离心 10min。 6、离心管中出现 3 层,用滴管小心地将上层清液吸入另一干净的离心管中,弃去中间层的细胞碎片 和变性蛋白以及下层的氯仿。 (根据需要,上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。 ) 7、收集上层清液,并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入 2 倍体积预冷的 95%乙醇。边加边用细玻 棒沿同一方向搅动,可看到纤维状的沉淀(主要为 DNA)迅速缠绕在玻棒上。 8、小心取下这些纤维状沉淀,加 1~2 mL 70%乙醇冲洗沉淀,轻摇几分钟,除去乙醇,即为 DNA 粗 制品。 9、将粗制品溶于 TE 缓冲液。 10、在分光光度计上测定该溶液在 260nm/280nm 紫外光波长下的光密度值。 [注意事项] 1、液氮研磨时,小心操作,以免冻伤。 2、所有操作均需温和,避免剧烈震荡。 [思考题] 1、 CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别是什么? 2、 液氮研磨的原理是什么? [参考文献] 《精编分子生物学实验指南》 (第四版) [美] F M 奥斯伯,R E 金斯顿等主编 科学出版社 2005

实验 4

质粒 DNA 的提取和酶切

质粒 DNA 是分子生物学实验中广泛应用的载体分子。质粒是细菌独立于染色体外的遗传物质,是环 状的双链 DNA 分子。由于质粒比较小,并且能进行独立的自我复制,常常被改造为克隆和表达的载体分 子。限制性内切酶(Restriction enzyme,RE)是在细菌内发现的细菌降解外来 DNA 的保护机制。由于限 制性内切酶通过识别特定的核酸双链序列并在特定的位点切断磷酸二酯键。不同的限制性内切酶识别的序 列不同。 [实验目的] 通过本实验掌握碱裂解法提取质粒和限制性内切酶酶切的基本原理,掌握碱裂解小量提取质粒的实验 技术。 [实验原理] 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。 在 pH 值介于 12.0~12.5 这个狭窄的范围内, 线性的 DNA 双螺旋结构解开而被变性, 尽管在这样的条件下, 共价闭合环状质粒 DNA 的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入 pH4.8 的乙酸钾高盐缓冲液恢复 pH 至中性时,共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链仍保持在一起,因

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分子生物学实验部分

此复性迅速而准确,而线性的染色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确, 它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA,蛋白质-SDS 复合物等一起沉 淀下来而被除去。 限制性内切酶通过识别特定的 DNA 序列并在特定序列的特定位点打开磷酸酯键。 [实验器材] 恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、Tip 头、Eppendorg 管、含有目的质粒的 E.coli 菌株 [实验试剂] 1、 溶液 I 50mmol/L 5 mmol/L 10mmol/L 2、 溶液 II 3、溶液 III 5mol/L 乙酸钾 冰乙酸 水 4、 TE 缓冲液 10mmol/L Tris· HCl 1mmol/L EDTA(pH8.0) 5、 70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回) 6、 内切酶 EcoRI 和 HindIII 及其对应酶切缓冲液 [实验步骤] 1、 将含有目的质粒的 E.coli 菌株接种于 LB 液体培养基中,37℃振荡培养过夜。 2、 取 1ml 培养物倒入 Eppendorf 管中,12000r/min 离心 30s。 3、 吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。 4、 将细菌沉淀悬浮于 100μ L 冰预冷的溶液 I 中,剧烈振荡。 5、 加 200μ L 溶液 II(新鲜配制) ,盖紧管皿,快速颠倒 5 次,混匀内容物,将 Eppendorf 管放在冰 上。 6、 加入 150μ L 溶液 III(冰上预冷) ,盖紧管口,颠倒数次使混匀,冰上放置 5min。 7、 12000r/min,离心 5min,将上清液转至另一 Eppendorf 管中。 8、向上清液加入 2 倍体积乙醇,混匀后,室温放置 5~10min。 9、12000r/min 离心 5min。倒去上清液,把 Eppendorf 管倒扣在吸水纸上,吸干液体。 10、1ml 70%乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀,振荡并离心,倒去上清液,真空抽干或空气中干燥。 11、20μ L TE 缓冲液,使 DNA 完全溶解,-20℃保存。 12、取 4μ L 所提取的质粒 DNA,加入 1μ L 酶切缓冲液,EcoRI 或 HindIII 1μ L,用超纯水补至总体 积 10μ L。37℃保温 2h 以上。 132、酶切样品待琼脂糖电泳检测。 [注意事项] 操作时,避免剧烈震荡。 [思考题] SDS 和 NaOH 的作用是什么? 葡萄糖 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris· HCl 乙二胺四乙酸(EDTA) (pH8.0)

0.4mol/L NaOH , 2% SDS ,用前等体积混合 60mL 11.5mL 28.5mL

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分子生物学实验部分

[参考文献] 《精编分子生物学实验指南》 (第四版) [美] F M 奥斯伯,R E 金斯顿等主编 科学出版社 2005

图 pBluescriptII SK 质粒载体

实验 5

PCR 基因扩增

[实验目的] 学习和掌握 PCR 反应的基本原理与实验技术。 [实验原理] PCR 技术是在 1985 年由美国 PE-Cetus 公司人类遗传研究室的 Mullis 等发明的聚合酶链反应。 这一技 术具有划时代意义的。 其原理类似于 DNA 的体内复制, 只是在试管中给 DNA 的体外合成提供以致一种合 适的条件---摸板 DNA ,寡核苷酸引物,DNA 聚合酶,合适的缓冲体系,DNA 变性、复性及延伸的温度 与时间。 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction , PCR)的原理类似于 DNA 的天然复制过程。在待扩增的 DNA 片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物, 经变性、 退火和延伸若干个循环后, DNA 扩增 2n 倍。 1、 变性:加热使模板 DNA 在高温下(94℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段。 2、 退火:使溶液温度降至 50~60℃,模板 DNA 与引物按碱基配对原则互补结合,即退火阶段。 3、 延伸:溶液反应温度升至 72℃,耐热 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板,在引物的引导下,利用反应混 合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸(dNTP) ,按 5′→3′方向复制出互补 DNA,即引物的延伸阶段。 上述 3 步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸 3 个阶段。从理论上讲,每经过一个循环, 样本中的 DNA 量应该增加一倍, 新形成的链又可成为新一轮循环的模板, 经过 25~30 个循环后 DNA 可扩 增 106~109 倍。 典型的 PCR 反应体系由如下组分组成:DNA 模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的 DNA 引物、耐热 Taq 聚合酶。 [实验器材]

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分子生物学实验部分

PCR 热循环仪、tip 头、冰盒、PCR 管、超纯水、DNA 相对分子质量标准物、移液枪、琼脂糖凝胶电 泳系统、凝胶成像系统 [实验试剂] 1、10×缓冲液 500mmol/l KCl 100mmol/l Tris?HCl(pH8.3 ,室温) 15mmol/l MgCl2 0.1% 明胶 2、4×dNTP 1mmol/l dATP 1mmol/l dCTP 1mmol/l dGTP 1mmol/l dTTP 3、Taq 酶 4、DNA 模板 5U/μ L 1ng/μ L

5、引物 1 、引物 2 引物溶液浓度 [实验步骤] 1、在 PCR 管内配制 20μ L 反应体系: 反应物 10× buffer dNTP 引物 1 引物 2 Taq 酶 Template ddH2O 总体积 2、按下列程序进行扩增: ①、95℃预变性 ②、95℃变性 ③、55℃退火 ④、72℃延伸 ⑤、重复步骤②~④30 次; ⑥、72℃延伸 3、琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 结果 配制 0.7%琼脂糖凝胶,取 10μ L 扩增产物电泳。保持电流 40mA。电泳结束后,紫外灯下观察结果。 [注意事项] 1、PCR 加样时,尽量保持低温操作,避免酶失活和模板、引物降解。 10min 5min 1min 1min 1min 体积/μ L 2.0 1.0 1.0 1.0 0.5 1 13.5 20 10pmol/μl

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分子生物学实验部分

3、 取样时注意不要污染药品。 [思考题] 1、什么是引物二聚体?出现引物二聚体的原因是什么? 2、PCR 仪的热盖设置有什么优点? 3、PCR 反应体系中,各试剂加样量如何确定? [参考文献] 1、 《PCR 技术操作和应用指南》 主编 林万明 人民军医出版社 1995 年 2、 《PCR 技术实验指南》[美]C.W.迪芬巴赫 G.S.德维克斯勒 科学出版社 2003 年

实验 6
[实验目的]

琼脂糖凝胶电泳检测 DNA

学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的实验技术和原理,以及溴化乙锭染色检测核酸的实验技术。 [实验原理] 琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖,其结构单元是 D-半乳糖-3,6-L 半乳糖。许多琼脂糖分子依 靠氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝胶。该物质对尿素和盐酸胍等破 坏氢键的试剂有较强的抵抗力。在 pH4.0-9.0 的缓冲液中稳定。由于其分子上无带电基团,在缓冲液离子 强度大于 0.05 时,对蛋白质无吸附作用,也无电渗现象,因而分辨率和重现性均较好,是一种优良的电泳 材料。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中,如 DNA 分子的电泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液 对迁移率相关。 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子的高于等电点的 pH 溶液中带 负电荷,在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链 DNA 几乎具有等 量的静电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下,DNA 分子的迁移速度取 决于分子筛效应, DNA 分子本身的大小和构型。 即 具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不一样, 可进行分离。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对 分子质量的 DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的 DNA 分子,如 pUC19 质粒,有 3 种构 型:超螺旋的共价闭合环状质粒 DNA(covalently closed circular DNA,简称 cccDNA) ,开环质粒 DNA, 即共价闭合环状质粒 DNA 1 条链断裂(open circular DNA,简称 OCDNA) ,线状质粒 DNA,即共价闭合 环状质粒 DNA2 条链发生断裂(linear DNA,简称 L DNA) 。这 3 种构型的质粒 DNA 分子在凝胶电泳中的 迁移速度不同。因此电泳后呈 3 条带,超螺旋质粒 DNA 泳动最快,其次为线状 DNA,最慢的为开环质粒 DNA。 核酸染料可以嵌入核酸分子,并且在紫外灯下产生荧光,可用于检测核酸物质。 [实验器材] 琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、DNA marker、检测样品 [实验试剂]

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分子生物学实验部分

1、5×TBE(5 倍体积的 TBE 贮存液) 配 1000ml 5×TBE: Tris 硼酸 0.5mol/l EDTA 2、凝胶加样缓冲液(6×) 溴酚蓝 蔗糖 3、核酸染料(Genview) [实验步骤] (一)制备琼脂糖凝胶 1、按照被分离 DNA 的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表: 琼脂糖凝胶浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线性 DNA 的有效分离范围/kb 5~60 1~20 0.8~10 0.5~7 0.4~6 0.2~4 0.1~3 0.25% 40% 0.5μ g/ml 54g 27.5g 20ml(pH 8.0)

2、称取 0.3g 琼脂糖,放入锥形瓶中,加入 30ml 0.5×TBE 缓冲液,置微波炉或水浴加热至完全溶化, 取出摇匀,则为 1%琼脂糖凝胶液。待冷却至不烫手时,加入核酸染料。 (二)胶板的制备 1、 取有机玻璃内槽,洗净,晾干,用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严,不能留缝 隙) 。 2、 有机玻璃内槽放置于一水平位置,并放好样品梳子。 3、 将冷到 60℃左右的琼脂糖凝胶液,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶 面(注意不要形成气泡) 。 4、 待胶凝固后,取出梳子,取下橡皮膏,放在电泳槽内。 5、 加入电泳缓冲液至电泳槽中,让缓冲液盖过凝胶。 (三)加样 用移液枪将将上样缓冲液与 DNA 样品按 1:5 比例混合,加入加样孔中(记录点样顺序及点样量) 。 (四)电泳 1、接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极,DNA 片段从负极向正极移动) 。DNA 的迁移速度与电 压成正比,最高电压不超过 5V/cm。 2、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 1~2cm 处,停止电泳。 3、将凝胶放入凝胶成像仪中拍照。 [注意事项] 核酸染料操作中应注意安全,不要直接用手接触,并且保持环境的洁净。

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分子生物学实验部分

[参考文献] 《精编分子生物学实验指南》 (第四版) [美] F M 奥斯伯,R E 金斯顿等主编 科学出版社 2005

实验 7
[实验目的]

大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

学习和掌握 CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞的实验技术及热激转化的实验技术。 [实验原理] 在自然条件下, 很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中, 一般 缺乏此种转移所必需的 mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载 体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA。转化过程所用的受体细胞 一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源 DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。 细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态。转化是指质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入 细菌的过程。其原理是细菌处于 0℃,CaCl2 低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的 DNA 形成 抗 DNA 酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经 42℃短时间热击处理,促进细胞吸收 DNA 复合物。 将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如 Ampr 等)得到表 达,然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。 [实验器材] 超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温箱、恒温水浴器、Eppendorf 管、Tip 头、转化的目的质粒、 大肠杆菌菌株 DH5α、试管、培养皿、锥形瓶 [实验试剂] 1、0.1mol/l CaCl2 溶液(高压灭菌、预冷) 2、LB 液体培养基 配制每升培养基,应在 950ml 去离子水中加入: 胰蛋白胨(bacto-typtone) 酵母提取液(bacto-yeast extract) NaCl 菌 20 min。 3、LB 固体培养基 1000ml 加 15g 琼脂。 10g 5g 10g

摇动容器直至溶质完全溶解,用 NaOH 调节 pH 至 7.0,加入去离子水至总体积为 1L,121℃湿热灭

生物化学与分子生物学实验指导

分子生物学实验部分

4、氨苄青霉素(Amp) ,用无菌水配制成 100mg/ml 溶液,置-20℃冰箱保存。 [实验步骤] 一、 受体菌的培养 1、从大肠杆菌 DH5α 平板上挑取一个单菌落接于 2mL LB 液体培养基的试管中,37℃振荡培养过夜。 2、取 0.5ml 菌液转接到一个含有 50ml LB 液体培养基锥形瓶中,37℃振荡培养 2~3 h。 (此时,OD600 ≤0.4~0.5,细胞数务必<108/ml,此为实验成功的关键) 。 二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、吸菌液 1ml 加入 Eppendorf 管,10,000rpm 离心 1min 回收细胞。 2、用冰预冷的 0.1mol/l CaCl2 500μ L 悬浮沉淀,冰上放置 15-30 分钟。 3、再离心 1min(10000rpm) ,回收细胞。 4、再用冰预冷的 0.1mol/l CaCl2 60μ L 重悬沉淀,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 5、在-4℃下可保存 2 周(2~4 d 时,转化效率最高) 。 三、 转化 1、从-70℃ 冰箱中取 200μl 感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。如果是新鲜的感 受态细胞也需放置于冰上。 2、加入质粒 DNA 溶液(含量不超过 50ng,体积不超过 10μl) ,轻轻摇匀,冰上放置 30 分钟后。 同时做两个对照管: 对照组 1:以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生 素的 LB 平板上应没有菌落出现。 对照组 2::以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液,但涂板时只取 5μl 菌液涂布于不含抗生素的 LB 平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。 3、42℃ 水浴中热击 90 秒或 37℃ 水浴 5 分钟,热击后迅速置于冰上冷却 3-5 分钟。 4、每管加入 800μ L LB 液体培养基(不含 Amp) ,37℃培养 1 h(慢摇) ,使细菌恢复正常生长状态, 并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 5、将适当体积(200μ L)已转化的感受态细胞,涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。正面向上放置半 小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,倒置平皿 37℃培养 12~16 h,观察细菌生长情况。 [注意事项] 1、超净上无菌操作注意安全。 2、实验过程中尽量避免杂菌污染。 [思考题] 1、 CaCl2 制备感受态的可能原因是什么? 2、 如果平板培养后出现卫星斑的可能原因是什么? 3、 如何提高转化的效率? [参考文献] 《精编分子生物学实验指南》 (第四版) [美] F M 奥斯伯,R E 金斯顿等主编 科学出版社 2005

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分子生物学实验部分

实验 8
一、实验目的

细菌总 RNA 提取

了解 RNA 的特性,掌握 Trizol 法提取 RNA 的原理及操作技术。 二、实验原理 RNA 分子是化学性质非常活跃的分子。 在提取细胞内 RNA 在的过程中, RNA 分子容易受细胞内核酸 酶、 化学试剂、 机械震荡等多种因素影响而发生分子结构的破坏, 导致提取失败。 Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出核酸酶活性。Trizol 适用于从多种组 织和细胞中快速分离总的 RNA。 三、溶液与试剂 1、Trizol 试剂 2、氯仿 3、异戊醇 4、无水乙醇,4℃保存 5、70%乙醇,4℃保存 6、超纯水 四、操作步骤: 材料准备: E.coli 细胞过夜活化,第二天按 10%转接新培养基继续培养 4h。 1、离心收集细胞样品经无菌水清洗后,用液氮速冻,将组织磨成粉末,趁液氮尚未挥发光时,将粉末转移 到 Eppendorf 管中。每 100mg 组织加入 1.0ml 的 Trizol.细胞样品:用常规方法收集细胞,按照 106-107 个细 胞,加入 1mlTrizol.。 注意:如果者细胞数很少(102-104) ,在样品中加入 800μ L 的 Trizol。剧烈振荡或用匀浆器匀浆。 2、加入 200ul 氯仿/异戊醇(24:1)或氯仿,剧烈振荡混匀 30 秒。 3、12000 转/分,4℃,离心 10 分钟。 4、将上清液小心转移到 RNase-free 1.5ml 离心管中,加入与上清等体积的异丙醇,-20℃置 30 分钟。 注意:不要吸取任何中间层物质,否则会出现 Genomic DNA 污染。 5、12000 转/分,4℃,离心 5 分钟。 6、小心移去上清液,防止沉淀丢失。 7、用 70%酒精洗涤两次,每次 700μ L,12000 转/分,4℃离心 5 分钟。 8、尽可能彻底的吸走上清,防止丢失 RNA 沉淀。 9、真空离心干燥 3-5 分钟或者放在室温下将酒精空干。 10、沉淀用 30-50μ L 的水溶解,检测,-70℃保存。 11、采用电泳技术或光谱技术检测 RNA 的浓度、纯度情况。 六、注意事项 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染 RNA 的抽提并成为 RNA 酶的来源。培养 良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。

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分子生物学实验部分

[植物材料] [实验步骤] 1、称量100 mg的新鲜植物RNA提取样品,迅速转移至用液氮预冷的研钵中,用研杵研磨组织,其间不断 加入液氮,直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒,如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量),趁液 氮未挥发将粉末转移到已事先加入1ml RNAiso Plus的1.5 ml离心管中,盖紧离心管盖,用力振荡均匀,室 温静置5分钟,12,000 g 4℃ 离心5分钟。 2、小心吸取上清液,移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)。加入1/5 RNAiso Plus体积量的氯仿(200 μL), 盖紧离心管盖,用手剧烈振荡15秒(氯仿沸点低、易挥发,振荡时应小心离心管盖突然弹开),待溶液充 分乳化(无分相现象)后,再室温静置5分钟,12,000 g 4℃ 离心15分钟。 3、从离心机中小心取出离心管,此时匀浆液分为三层,即:无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜 色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)。 4、向上清中加入与上清等体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后,在15~30℃ 下静置10分钟, 12,000 g 4℃ 离心10分钟。一般在离心后,试管底部会出现沉淀。 5、小心弃去上清,缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇l ml(切勿触及沉淀),轻轻上下颠倒洗涤离心管管 壁,12,000 g 4℃ 离心5分钟后小心弃去乙醇(为了更好地控制RNA中的盐离子含量,应尽量除净乙醇)。 6、室温干燥沉淀2~5分钟(不可以离心或加热干燥,否则RNA将会很难溶解),加入适量的RNase-free 水溶解沉淀,必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀,待RNA沉淀完全溶解后于-80℃ 保存。

7、检测RNA
(1)完整性检测:制备1%琼脂糖凝胶快速电泳,160-170V,0.5h,检测RNA分子的完整性,观察18S、 28S条带。 (2) 纯度检测: 通过OD260/OD280检测RNA纯度。 若OD260/OD280值在1.9-2.1之间, RNA的纯度较好; 260/OD280 D 值﹤1.8,表明蛋白杂质较多;D260/OD280值﹥2.2,表明RNA已经降解。


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