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乳酸菌的分离、纯化与鉴定


乳酸菌的分离、纯化与鉴定
第一部分:乳酸菌的分离、纯化
一、实验器材:

1.实验药品

新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液

(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙;
0.4gNaOH 固体、4.2ml 浓 HCL(分析纯) 、20gCaCO3 固体、酵母膏 20g 、琼脂 30g 香柏油、脱脂奶粉 100g 、蔗糖 10g;

2.仪器与设备

高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH 试纸、酸乳瓶、培

养皿(φ 9 或 φ 12)、试管、300ml 三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml 锥形瓶、250ml 烧杯。
二、实验步骤:

1.培养基配制(BCG 牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉 100g,水 500ml,加入 1.6%溴甲酚氯乙醇溶液 1ml, 混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅 80℃灭菌 20 min;(1.6%溴甲苯酚 绿(BCG)乙醇溶液用 1.6g 溴甲酚绿加入 20ml 无水乙醇中,再加水至 100ml 制 成) (B)溶液:酵母膏 10g,水 500ml,CaCO3 10g,琼脂 20g,加热溶解,用 精密 pH 试纸调节 pH 到 6.8,分装入三角瓶后在 103kPa 121℃高压蒸汽灭菌 20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2.药品配制 2.1 结晶紫:结晶紫乙醇饱和液(结晶紫 2g 溶于 20ml 95%乙醇中)20ml,1%草 酸氨水溶液 80ml。将两液混匀,放置 24 小时后过滤即可。 2.2 卢哥氏碘液:碘 1g,碘化钾 2g,蒸馏水 300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏 水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水 300ml 即成。 2.3 蕃红溶液:番红 2.5g,95%乙醇 100ml,溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时 取 20ml 与 80ml 蒸馏水混匀即可。

2.4 0.1%的吕氏美蓝染液: 液: A 美蓝 0.3g, 95%乙醇 300ml; 液: B 0.01% KOH 100ml。 混合 A 和 B 液即成,按 1:100 稀释即可。 2.4 生理盐水:称取 9g 氯化钠,溶解在少量蒸馏水中,稀释到 1000 毫升。 3.菌悬液的配制 取 1 洁净三角瓶,盛以 225ml 生理盐水;7 只洁净试管,各盛 9ml 的生理盐 水;加塞包扎于在 103kPa 121℃高压蒸汽灭菌 20Min,得到无菌生理盐水。 将酸奶样品搅拌均匀,用无菌移液管吸取样品 25ml 加入盛有 225ml 无菌生理盐 水的三角瓶中,在旋涡均匀器上充分振摇,使样品均匀分散,即为 10-1 的样品 稀释液; 将 7 只装 9ml 生理盐水的无菌试管,依次标记 10-2、10-3、10-4、10-5、 10-6、10-7,再用无菌移液管吸 10-1 的菌悬液 1ml 放入依次装有 9ml 无菌水的 试管中, 稀释混匀便得到 10-2 稀释液, 如此重复依次制得 10-3~10-7 的稀释液。 4.倒平板 取无菌平板 12 个,编号标明 10-1、10-5、10-6、10-7 各三套;将经高温消 毒的培养基冷却到 50℃左右,按无菌操作法倒 12 只平板,每皿约 15ml;平置使 培养基均匀分布在皿底,待凝固。 5.分离方法 A.平板划线 接种环挑取 10-1 菌液,按无菌操作对标有”10-1”的 3 个平板进行划操作; 划线完毕后,盖上皿盖,倒置放在 40℃恒温培养箱中培养 48 小时。 B.平板涂布 用三支 1ml 无菌移液管分别吸取 10-5、10-6 和 10-7 的稀释菌悬液各 1ml, 对号接种于与之对应的 3 个无菌平板中,每个平皿放 0.1ml;尽快用无菌玻璃涂 棒将菌液在平板上涂布均匀,平放于试验台上 20 Min;然后倒置于 40℃恒温箱 中培养 48 小时。 6.脱脂乳试管的配制与灭菌 直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉 10 克与蔗糖 5 克,水 95 克(蔗糖与水的比 例在 1:10 的范围内)的比例配制,装量以试管的 1/3 为宜,115℃灭菌 15min。 7.菌落观察

恒温培养 48 小时过后,取出培养平板;选择菌落分布较好的平板,先对其 菌落形态进行观察,初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小,大约 1~3 mm, 园形隆起,表面光滑或稍粗糙,呈乳白色、灰白色或暗黄色;在产酸菌落周围还 能产生 CaCO3 的溶解圈。40℃培养 48h,如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围 培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。 8.乳酸菌的分离纯化 选取乳酸菌典型菌落转致脱脂乳试管中,40℃培养 8~24h 若牛乳出现凝固, 无气泡,显酸性,涂片镜检细胞杆状或链球状,革兰氏染色显阳性,则可将其连 续传代 3 次,最终选择出在 3~6h 能凝固的牛乳管,作菌种待用。 9.乳酸发酵及检查 发酵: 观察 BCG 培养基中乳酸菌菌落特征,选取长势比较好的菌落无菌操作 下将乳酸菌接种于装有脱脂乳的试管中,40~42℃静止培养。 取干净载玻片一块, 在载玻片中央加一滴生理盐水,无菌操作法取少量菌体 涂片;结晶紫初染→碘液媒染→乙醇脱色→番红复染,干燥后用油镜观察,菌体 被染成蓝紫色的是乳酸菌; 其中保加利亚乳杆菌呈杆状, 成单杆、 双杆或长丝状; 嗜热链球菌,呈球状,成对或短链或长链状。 革兰氏阳性,无芽胞的球菌或杆 菌可定为乳酸菌,记录测定结果。

第二部分:乳酸菌鉴定
一、实验器材

1.蛋白胨水培养基:蛋白胨 10 g , 氯化钠 5 g , 水 1000 ml , PH : 7.2 ~ 7.4 121 摄氏度湿热灭菌 20 min 2.糖发酵培养基: 蛋白胨水培养基 1000 ml , 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1~2 ml ,PH : 7.6 , 另配 20%糖溶液(葡萄糖,蔗糖)各 10 ml.

3.有关试剂 1.6 % 溴甲酚紫乙醇溶液 :溴甲酚紫 1.6 g 溶于 100 ml 乙醇中,贮存于 棕色瓶中保存备用。

吲哚试剂:对二甲基氨基苯甲醛 8 g , 95 % 乙醇 760 ml , 浓盐酸 160 ml. 10 % 硫酸,2 % 高锰酸钾 含氨的硝酸盐溶液 : 称取硝酸银 2 g , 蒸馏水 100 ml ,待硝酸银溶解后, 取出 10 ml 备用,向其余的 90 ml 硝酸银中滴加氨水,即可形成很厚的沉淀, 继续滴加氨水至沉淀刚刚溶解成为澄清溶液为止,再将备用的硝酸银慢慢滴入, 则溶液出现薄雾,但轻轻摇动后,薄雾状的沉淀又消失,继续滴入硝酸银,直到 摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。

二、鉴定试验

1.形态和培养特征观察 采用牛肉膏蛋白胨培养基,将已纯化后的甘油菌种活化后于 37℃下培养 20~24h ,并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特征的观察。 染色方法:涂片固定;草酸铵结晶紫染 1 分钟;自来水冲洗;加碘液覆盖涂 面染约 1 分钟;水洗,用吸水纸吸去水分;加 95%酒精数滴,并轻轻摇动进行脱 色,20 秒后水洗,吸去水分;蕃红染色液(稀)染 2 分钟后,自来水冲洗。干 燥,镜检。 2.生长条件试验 (1)耐盐性试验(NaCl 浓度:0. 85 、1. 20 和 1. 71) (mol/ L) ; (2)耐酸碱试验(p H :4. 3 、5. 7 、6. 8 、8. 4 、8. 6 和 8. 7) ; (3)温度梯度试验(温度: 10℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃和 65℃) 。 分别将参试菌接种于以上处理的液体培养基中培养 48 h ,记录生长状况。 3.厌氧生长测定 将菌种接入营养肉汤平板后,用密封带包好放入 CO2 培养箱 37℃培养 2 天后, 观察生长情况,生长则为阳性。 含硝酸钾的营养肉汤 加入 2g 硝酸钾入营养肉汤 4.生理生化试验

⑴过氧化氢酶测定

将实验菌接种于 PGY 培养基斜面上,37℃培养 20h—24h,取一环接种的培养 物,涂于干净的载玻片上,然后在其上滴加 3%-—15%的过氧化氢,有气泡则为阳 性反应,无气泡为阴性反应。 蛋白胨、酵母膏、葡萄糖(PGY)培养基:蛋白胨 10g,酵母膏 5g ,葡萄糖 1g,蒸馏水 1L 。 (2)甲基红(M.R)试验 接种实验细菌于 PYG 培养基,于 37℃培养 2 天后,于培养物中加入几滴甲 基红酒精溶液,如呈红色,表示阳性。 (3)吲哚试验 1).试管标记:取装有蛋白胨水培养基的试管 2 支,分别标记乳酸菌和空白对 照。 2).接种培养:以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中,标记有 空白对照的不接种,置 37 摄氏度恒温箱中培养 24~48 小时。 3).观察记录:在培养基中加入乙醚 1~2 ml ,经充分振荡,使吲哚萃取至乙 醚中,静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面,此时沿管壁缓慢加入 5~10 滴吲哚 试剂,如有吲哚存在,乙醚层呈玫瑰色,此为吲哚试验阳性反应,否则为阴性反 应。 (4).糖发酵试验 1).试管标记:取分别装有葡萄糖,蔗糖发酵培养液试管各 2 支,每种糖发酵 试管中分别标记乳酸菌和空白对照。 2).接种培养:以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中,每种糖发 酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置试管中,置 37 摄 氏度恒温培养箱中培养 24 小时,观察结果。 3).观察记录:与对照管比较,若接种培养液保持原由颜色,其反映结果为阴 性;如果培养液呈黄色,反映结果为阳性。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性 反应,杜氏小管内没有气泡为阴性反应。 (5).乳酸的检测 选用已经分离的菌种做小型发酵实验, 取发酵液的上清液约 10 ml 于试管中, 加入 10%硫酸 1 ml ,再加 2%高锰酸钾 1 ml ,此时乳酸转化为乙醛,把事先在含

氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中,微火加热试管至沸,观察滤纸变 化。 (6)乙酰甲基甲醇试验(V-P 试验) 接种新鲜的实验菌种于培养基中, 37℃培养 2 天后,取葡萄糖蛋白胨培养液 1mL 在其中加入 1ml 10%的 NaOH,混匀,再加入 3-4 滴 2%氯化铁溶液。数小时 后,培养基表面的下层出现红色者,为阳性. (7)明胶液化实验 将实验菌接种于明胶基础培养基中,置 37℃培养,以一支未接种的试管作为 对照。将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中,等待对照管凝固后记录实 验结果,反复观察对比多次。如对照管凝固时,接种管液化为阳性反应,凝固为阴 性反应 明胶培养基成分:NaCl 5g,蛋白胨 10g,牛肉膏 3g,明胶 120g,蒸馏水

1000mL。制法:在水浴锅中将上述成分溶化,不断搅拌。溶化后调 pH 7.2~7.4, 121°C 灭菌 30min。 (8)石蕊牛奶的反应 牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白, 在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化 还原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色,酸性时呈粉红色,碱性呈蓝色,还原时则 自上而下地褪色变白。观察其产酸、产碱、胨化、酸凝固、凝乳酶凝固、还原情 况。


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