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提取RNA及用DEPC去除RNase的个人总结 [精华]


快速的操作,低温环境,少量取上清 主要是抽提之后吸取上清时要特别小心,只要不把蛋白层吸出来就不会有RNase污染。 分子克隆第二版343页,上关于提取RNA所用的玻璃容器的处理方法,是用前180度干烤8小时或更长时间;另一种方法是0.1%的depc水浸泡(37 度2小时),然后灭菌水淋
快速的操作,低温环境,少量取上清
主要是抽提之后吸取上清时要特别小心,只要不把蛋白层吸出来就不会有RNase污染。
分子克隆第二版343页,上关于提取RNA所用的玻璃容器的处理方法,是用前180度干烤8小时或更长时间;另一种方法是0.1%的depc水浸泡(37度 2小时),然后灭菌水淋洗数次,100度干烤15分钟,然后高压灭菌除去depc.我们实验室一直是用170度考4小时,且不准离人,不准过夜,可能是怕烤箱长时间高温,线路老化会发生危险吧

提取RNA所用的枪头,EP管。直接高压烘干即可。如果用0.1%DEPC处理,要在DEPC配置后振摇1小时后再浸泡枪头,EP管方有效。我做的都是将枪头泡在配制好的depc中,摇振过夜,然后倒掉depc注意要到干净,再高压,为了防止仍残留液体可120度干烤一会

A.对于提取RNA来说,我认为关键的一点在于实验器材的准备.包括从最初的标本的制备,保存,以及之后的试剂的准备,匀浆器,镊子,tip头的去除RNase处理,尤其是去除RNase的DEPC处理步骤
B. 您在处死大鼠前,先准备好干净的冻存管(用1.5ml的Ep管也可以,就是后面您在从液氮中取出的时候容易爆,您的注意安全),然后将去除的骨骼肌立即用干净的剪刀分成半颗到一颗黄豆大小,装入冻存管后立即投入液氮保存.个人认为在这里使用装标本的管子没必要用DEPC处理
C.在提取RNA之前,将试剂(TRIzol)和器械(tip头,镊子,匀浆器)都准备好
D.从液氮取出标本后,立即转移进入事先加入TRIzol的匀浆器内(最好置冰上操作),立即匀浆,一直到标本完全碾磨碎,这个时候TRIzol液体成浑浊状,而且匀浆器的壁上没有太多的黏附组织,然后将TRIzol转出,继续后续的步骤.

1 Rnase是一种蛋白酶,能够降解RNA。
2我们的手上皮肤上有很多,应该是对我们的身体起保护作用。保护不被RNA病毒感染?或者什么的。
3 这个酶高效稳定。要么在DEPC水中处理n小时,要么在160度高温烘烤6小时。此酶才会失效。
4 所谓DEPC,是一种叫做焦碳酸二乙酯的东西。有毒啊。所谓DEPC水,一般指两种状态,a,配制 好未消毒;b,配制好已消毒。通过高压消毒,该物质会降解,从而无毒。
1 无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯(DEPC),室温搅拌4小时以上至完全溶解,高压灭菌20分钟,冷却备用。这个是DEPC水的b状态。
2 如果你要用DEPC水处理Tips等等东东,那么就要用高压前的水,即DEPC水的a状态。把枪头管子等完全浸泡至少8小时,我一般都是过夜的,或者平时就泡在里面备用。

RNA提取必须创造无RNase的环境,所有仪器与试剂均按照以下方法进行处理 :研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等需在180℃烘干4h以上; 电泳槽、胶板、梳子、用0.1 %~0.2%DEPC水处理过夜或者用洗涤灵清洗干净后用0.5%的SDS (Sodium dodecyl sulfate,抑制RNase的活性)浸泡过夜,然后用ddH2O冲洗干净,晾干备用;离心管,枪头等塑料器皿要用0.1%~0.2%DEPC水处理之后(DEPC有致癌之嫌,须小心操作)。37℃保温12h以上,然后高压灭菌,灭活DEPC ( Diethypyrocarbonate );溶液都需用经DEPC处理过的水配置, RNA提取的所有操作应尽可能在超净工作台上进行。

我们研究所里提RNA用的枪头和EP管都是高压两遍的,没有用DEPC水处理。
1、 有灭菌过的DEPC水,这一般是用来配75%乙醇用,因为乙醇若高压灭菌会挥发,所以乙醇是新开封专用的。
2、 没有经高压灭菌的DEPC水,这主要是用于配你提RNA所用的其他试剂(所说的试剂是可以经高压灭菌的),总的来说,都得经过高压灭菌,目的就是要去除DEPC,以防止它以随后实验的干扰。
3、 DEPC处理水:无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯(DEPC),室温搅拌4小时以上,121 度高压灭菌20分钟,冷却备用。

凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂.

为啥在28s之后还是有影影约约的片断?和模糊的smear?
这都与非变性电泳方式有关。RNA 的电泳,严格讲是要使用变性电泳的,我们平时所知道的 RNA 电泳的知识,实际上都是由变性电泳获得的。但因为非变性电泳实在是太方便了,同时,就一般检测而言,完全可以替代变性电泳,所以我们日常检测就都使用非变性电泳了。

电泳时间太长了容易产生降解。最好是在120V左右。操作的时候有没有注意戴口罩和手套,注意,手套要经常换,不要太节约了。那样也会影响RNA的质量。无论你是提什么RNA只要是用异丙醇沉淀的,都得用75%的酒精洗涤一次。

1 样品不要太多,抽提务必充分,室温放置5min;
2 200ul氯仿 剧烈振荡20s,室温放置2-15min;
3 13000g 离心 15min;
4 取上层水相,一般400-450ul就足够了,千万不要贪多!***
5 加入500ul异丙醇 摇匀,室温放置10min;
6 12000g 离心 10min;
7 75%乙醇 1000ul 洗涤沉淀;
8 7500g 离心 5min;(12000转速太高了吧,沉淀不容易溶解的)
9 弃乙醇,吸干净残余的微量乙醇, 室温干燥3-5min;(时间太久沉淀不易溶解)
10 适量DEPC水溶解沉淀。
电泳的上样量1ug,电泳buffer用DEPC处理的水配制,电泳时间不要太久,95V,10-15min足够了。

建议跑RNA电泳。先用2%琼脂糖胶,若分离效果不好,可用甲醛变性胶。在上样缓冲液中注意加入RNA酶抑制剂。注意观察带形,质量较好的RNA亮度 。28S:18S应为2:1。还要注意观察,在加样孔或刚出加样孔附近,有没有带, 若有,可能为基因组DNA污染。 OD值只有1.5,可能为基因组DNA污染。参考一下分子克隆3。上面有OD值与 污染DNA的关系。建议,酚氯仿抽提后,上清可少吸一些。提取后的RNA样品可用无RNA酶的DNA酶消化一下。注意该酶的buffer中有一种物质在 OD260有吸光度,应严格按照其protocol操作,减少误差。
只要用DEPC处理过的水,打开一瓶新的无水乙醇(或者专用于RNA的,即只用处理过的枪头取过乙醇的)配就可以了。DEPC高温高压时变成CO2和水,再加上乙醇也很容易气化,可能是因为有气体产生吧,如果盖子太紧容易发生瓶子破掉的事情。(我还从来没有听说过把乙醇高温灭菌过)而且,湿热灭菌本身不足以去除RNA酶,所以我觉得有时候,灭菌可能反而引入RNA酶污染也不一定哦

75%的乙醇用于提取RNA 时最好还是现用现配,乙醇最好是新的且以后不要用于其他方面,也就是留一瓶专门用于提取RNA。DEPC一般高压灭菌30分钟就可以了!
75%乙醇:灭菌后的千分之一DEPC水25ml+75ml无水乙醇.配好后装入高温烘烤的玻璃瓶中(160干烘四小时),或塑料器皿的用千分之一的DEPC泡12小时以上再灭30分钟,存放于低温冰箱4度保存!!!

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