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GST融合蛋白表达与纯化


一、蛋白质纯化流程图

图 1 可溶性重组蛋白的纯化图解,这种蛋白质可以被分泌或定位在周质内、膜 组分内,或在大多数情况下在细胞质内。 第一步是得到含有可溶性目的蛋白的提 取物,之后可以进行常规的纯化步骤,或用亲和方法纯化带有标签的融合蛋白。

图 2 在宿主细胞的细胞质中以包含体形式生产的不可溶性重组蛋白的纯化图解。 必须将细胞破碎开, 然后通过差异离心分离不可溶的包含体,使用变性溶剂来溶 解,当除去变性剂后,溶解的蛋白质发生复性,还需要进一步的精制步骤来除去 少量的污染蛋白质和未正确折叠的蛋白质。

图 3 存在于天然宿主细胞中的可溶性蛋白质的纯化图解。必须将细胞破碎,以 释放出蛋白质, 通常每克细胞加入 2-10ml 适当的缓冲液, 在除去不溶性材料后, 处理通常需要几步, 按正确的顺序使用各种标准的分级分离方法。要生产高纯度 蛋白质,可能会需要最后的精致步骤,以除去最终的微量污染物。

图 4 与膜相关的和溶解性差的蛋白质(非重组的)的纯化图解。通过分离含有 目的蛋白的细胞器, 可以实现第一步的纯化。通常用非离子型去污剂来溶解膜蛋 白,尽管松散解离的蛋白质也可以在高 pH、含 EDTA(或使用少量的有机溶剂, 如正丁醇) 的条件下不用去污剂来提取,如果自始至终都需要有去污剂来维持蛋 白质的完整性,则需要对常规的分级分离方法进行一些修改。 二、大肠杆菌表达系统的选择 基本方案一 在 pL 启动子控制下的表达:温度诱导 与含有 pL 启动子载体一起使用的大肠杆菌宿主菌必须含有一种由 cI857 编码 的温度敏感的阻遏蛋白,或作为休眠噬菌体整合到宿主的染色体中,或构建在携 带外源基因的同一质粒中。 在高温下, cI857 基因的表达被灭活, 呈现阻遏作用, 使 pL 启动子下游的基因转录。细胞首先在 30℃生长至理想的密度,然后将温度 升至 42℃,便可诱导蛋白质的合成,合适的抗生素是由表达载体决定的。 材料(带√的项见附录 1)

含有在 pL 启动子控制下的目的蛋白基因质粒转化的大肠杆菌宿主菌株(如 Coli B、W3110) √LB 培养基 √1000x 抗生素贮液 20ml 无菌培养管 42℃水浴摇床 150ml 摇瓶,无菌 1、制备少量大肠杆菌宿主菌株的液体培养物,该大肠杆菌是由处于稳定期 的含有在 pL 启动子控制下的目的蛋白基因质粒转化的。方法是:从新鲜的 LB 琼 脂平板上挑单菌落,接种于含 2ml LB 培养基(补加适当的抗生素贮液)的 20ml 管中,将培养管在 30℃旋转摇床中 200rpm 温浴过夜,不要超过 30℃。 2、用 PBS 将一小份菌液稀释 10 倍,用水作空白对照,测 OD600 值,以证实 培养物已达到稳定期(在 1cm 光径的比色杯中,OD 值为 1-2;OD 值为 1 时,相 当于 0.5x109-1x109 个/ml) 。 3、将一个含有 50ml LB 培养基(含适当抗生素)的 150ml 摇瓶放入 42℃水 浴摇床中,预热培养基。要确保温度准确(过低的温度将导致阻遏物的灭活不完 全,诱导不佳) ,注意某些宿主菌(如大肠杆菌 HB101)不能耐受 42℃,在此温 度下生长明显降低。 4、将 2ml 过夜培养物转移至含有预热培养基的瓶中,取 1ml 样品,按第 5 步所述的方法进行处理。将 50ml 培养物放回 42℃水浴摇床中,在剧烈振荡 (200rpm)下温浴 3h。在温浴的最后,取另外 1ml 样品。在接种和取样品时, 操作要快,以保持温度稳定。 5、 在室温条件下, 用最大速度离心每种样品 2min, 弃去上清, 进行 SDS-PAGE 分析(见辅助方案 2) 。如果要保存的话,在 SDS-PAGE 前,沉淀物可于-20℃长期 保存。 6、用剩余的 50ml 培养物来分析质粒的稳定性、确定样品的可溶性(见辅助 方案 3)或制备周质提取物或细胞外培养基样品(见辅助方案 4 和 5)以获得重 组蛋白。如果要保存的话,保存剩余的培养物(见辅助方案 1) 。 基本方案 2 在 trp 启动子控制下的表达:化学诱导 细胞在最低营养培养基中生长至对数生长期,以获得色氨酸饥饿,用色氨酸 类似物吲哚-3-丙烯酸灭活残余的 trp 阻遏物。 材料(带√的项见附录 1) 用含有 trp 启动子和目的基因的质粒转化的大肠杆菌宿主菌株 √M9 最低营养培养基加 0.5%(m/V)酪蛋白水解物(Difco 公司) √1000x 抗生素贮液 √400x 吲哚-3-丙烯酸(IAA) 20ml 无菌培养管 150ml 摇瓶 37℃定轨摇床 1、从新鲜的琼脂平板上挑取含 trp 启动子和目的蛋白基因质粒转化的大肠 杆菌宿主菌株的单一菌落,接种至含有 2ml M9 培养基(含 0.5%的酪蛋白水解物

和适量的抗生素)的 20ml 培养管,将培养管在定轨摇床上(200rpm)37℃培养 过夜。 2、用水作空白对照,测 OD600。 3、 将过夜培养物移至含有 50ml M9 培养基/酪蛋白水解物 (补加适量的抗生 素)的 150ml 培养管内。 4、取 1ml 起始样品,立即按第 7 步的方法进行处理或-20℃保存。 5、 37℃定轨摇床中, 在 剧烈振荡 (200rpm) 将培养物温浴 1-2h, OD600, 测 以确保细胞进入完全对数生长期(OD600 为 0.2-0.5) 。 6、加入 400xIAA 贮液至终浓度为 1xIAA(25μg/ml)诱导蛋白表达,继续培 养 3h,取第二份(终)1ml 样品。 7、对于每个 1ml 样品,于室温下,用最大速度离心 2min,弃去上清,进行 SDS-PAGE 分析(见辅助方案 2) 。如果要保存的话,-20℃保存沉淀物。 8、 用剩余的培养物来分析蛋白的可溶性 (见辅助方案 3) 蛋白质在周质 、 (见 辅助方案 4)或培养基中(见辅助方案 5)的定位,或分析质粒稳定性。如果希 望,保存剩余的培养物(见辅助方案 1) 。 备择方案 1 在 lac/tac 启动子控制下的表达 对于 lac 启动子或 tac 启动子(lac 和 tac 启动子的杂交体)控制下的蛋白质 表达, 通常往培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)使 lac 阻遏物释放, , 从而诱导表达。宿主菌必须在染色体或质粒(含目的基因的质粒或兼容的质粒) 中含有 lac I 阻遏物基因。对于这些启动子,按基本方案 2(trp 启动子)进行操 作,但应当用适当转化的宿主菌作为其实材料,而且第 6 步的诱导,用 100xIPTG (终浓度为 0.4-1.0mmol/L;见附录 1)代替 400xIAA。 备择方案 2 T7 RNA 聚合酶/启动子表达系统 这种方案是通过具有高度活性和效率的 T7 RNA 聚合酶的 lacUV5 启动子进行 诱导,它与 T7 启动子(pT7)结合,并在其控制下转录基因。该方案使用大肠杆 菌宿主菌,该宿主菌 DNA 中整合有 lacUV5 控制下的 T7 RNA 聚合酶基因,同时 该宿主菌转化有在 pT7 控制下的氨苄青霉素抗性基因和目的蛋白基因的质粒 DNA。对于这种系统,可按基本方案 2(trp 启动子)的步骤进行操作,但应当用 适当转化的宿主菌作为起始材料,使用氨苄青霉素选择,而且第 6 步的诱导,用 100xIPTG(终浓度为 0.5-1mmol/L;见附录 1)代替 400xIAA。 将该系统进行改造,使其能够通过第二个质粒(如 pLysE 或 pLysS,它们也 编码氯霉素抗性)诱导 T7 溶菌酶(它与聚合酶结合,这样便在非诱导条件下停 止转录) ,而且且能够在第二种抗生素选择下维持生存。因此还可以利用第二种 抗生素(如 30mg/L 的氯霉素)进行选择。 辅助方案 1 菌株保存 材料(带√的项见附录 1) 转化的大肠杆菌宿主菌株 √LB 培养基 √1000x 抗生素贮液 √20%(V/V)甘油,无菌的 √LB 平板

20ml 培养管 30℃或 37℃定轨摇床 1、从新鲜琼脂平板上挑单菌落,接种 2ml LB 培养基(补加适当的抗生素; 在 20ml 培养管中) 在定轨摇床上培养过夜。 , 对于基于 pL 的系统, 温度为 30℃, 对于其他系统,温度为 37℃。 2、核实细胞处于稳定期(OD600 为 1-2) ,用 50μl 接种含有 2ml LB 培养基 (加入适当的抗生素)的 20ml 的培养管,培养 2-3h。 3、在每个冷冻管中加入 0.9ml 培养物,标记,充分旋涡混合,立即冷冻, 于-80℃保存冷冻后的菌株。 4、要从冷冻保存物开始新的培养,用无菌环刮冷冻管的表面,然后在 LB 平 板上划线,或浸入液体培养基中,将冷冻管放回-80℃保存。 辅助方案 2 SDS-PAGE 分析样品的制备 目的是在变性条件下将样品中的所有蛋白质溶解到溶液中, 以便在 SDS 胶中 通过一维电泳能够分辨混合物。如果必要,制备过量的样品,以便能够在几块胶 上重复上样。一旦在 SDS 样品缓冲液中溶解,样品便能够在-20℃保存多年。 材料(带√的项见附录 1) 目的样品(见基本方案 1 和 2、备择方案 1 和 2) √2xSDS 样品缓冲液 牙签,无菌的 超声破碎仪(Branson 公司,带微探头) 1a、可溶性样品:在 1.5ml 的微量离心管中,将样品加到等体积的 2xSDS 样 品缓冲液中。 1b、 沉淀物样品: 用无菌牙签将 5-10mg 的沉淀物移至一个预先称重的 1.5ml 的微量离心管中, 称重沉淀物。 10mg 加入 400μl 1xSDS 样品缓冲液, 30-50W 每 在 功率下超声 10s 重悬,始终将超声破碎仪探头置于液面下面,以防止产生泡沫。 2、在加热块中加热至 90℃,保持 5min。按 SDS-PAGE 进行操作。 辅助方案 3 可溶性分析 为了确定后续的纯化策略,需要分析重组蛋白的可溶性(见第 6.1 单元) 。 材料 表达目的蛋白的转化大肠杆菌宿主菌株 25mmol/L HEPES(pH=7.6;高压,4℃保存可达 1 年) 50ml 和 5ml 离心管 离心机(如 Sorvall RC5B,带 SS34 转头) ,4℃ 超声破碎仪 注意:在整个过程中,细胞都应当置于冰浴中,以使样品的改变降低至最低 程度。 1、在 50ml 离心管中,4℃、4000g 离心 15min,收获 25ml 表达目的蛋白的 转化大肠杆菌宿主细胞,弃上清,将沉淀重悬于 1-1.5ml 25mmol/L 的 HEPES

(pH=7.6) ,得到 OD600 的值约为 40。 2、将离心管置于冰浴中,超声 3 次,每次 1min,每次脉冲之间间隔 30s, 以防过热。在 1.5ml 的微量离心管中取 100μl 细胞裂解物(总蛋白质) ,-20℃保 存备用。 3、 将悬液移至 5ml 的离心管中, 4℃、 30000g (在 SS34 转头中为 16000rpm) 离心 30min,将上清(可溶组分)倒入另一个 5ml 的管中,使其与沉淀物(不可 溶组分)分开。 4、制备三种组分(总组分、可溶组分和不可溶组分) ,用于 SDS-PAGE 分析 (见辅助方案 2) 。 辅助方案 4 周质提取物的制备 本方案叙述了用小规模的方法来证实蛋白质表达定位于大肠杆菌周质间隙 中。 材料(带√的项见附录 1) 表达目的蛋白的转化大肠杆菌细胞 √PBS 20%蔗糖(m/V)/10mmol/L Tris·Cl(pH7.5;附录 1) ,冰冷 √0.5mol/L EDTA(pH8.0) 冰冷水 注意:在整个过程中,细胞都应当置于冰浴中,以使样品的改变降至最低程 度。 1、在 1.5ml 离心管中放入约 2x109 个表达目的蛋白的转化大肠杆菌细胞 (OD600 为 1 时相当于约 109 个细胞) ,4℃,最大转速离心 2min,弃上清,将沉 淀重悬于 1ml PBS 中,将管子充分涡旋混合。 2、 重复离心, 弃上清, 将沉淀重悬于 150μl 冰冷的 20%蔗糖/10mmol/L Tris· Cl (pH7.5)中,充分涡旋混合,加入 5μl 0.5mol/L 的 EDTA(pH8.0) 。 3、取出 50μl 代表总细胞组分的小份,-20℃保存,将剩余的样品置于冰上 保持 10min,以使 EDTA 能够将细胞壁结构变疏松。 4、将细胞碎片离心 5min,弃上清,在 100μl 冰水中剧烈涡旋,重悬沉淀。 5、在冰上放置 10min,然后离心 5min。 6、小心地收集上清(周质组分)于 1.5ml 离心管中,-20℃保存。 7、 用棉签除去沉淀中剩余的液体, 100μl 冰水中重悬沉淀, 在 保存此溶液, 作为细胞质和膜组分。 8、制备三种组分(全细胞组分、周质组分和胞质/膜组分) ,进行 SDS-PAGE 分析(见辅助方案 2) 辅助方案 5 细胞外培养基样品的制备 通过分析培养基中的样品能够检查指导目的蛋白细胞外分泌的表达系统。 如 果培养物中蛋白质浓度很低(如低于 100mg/L) ,可以加入牛血清白蛋白(BSA) 作为沉淀的载体和核。 材料 表达目的蛋白的转化大肠杆菌细胞 2g/L BSA(可选;用 0.22μm 的膜除菌,4℃保存≤1 个月) 200g/L 的三氯醋酸(TCA;用 0.22μm 的滤器除菌,4℃保存≤1 个月)

70%(V/V)乙醇 适于水溶液的 0.22μm 膜 1、 1.5ml 的微量离心管中放入 1ml 表达目的蛋白的大肠杆菌细胞培养物, 在 4℃,最高转速离心 2min,收集上清,将其过 0.22μm 的膜,收入 1.5ml 的微量 离心管中,弃沉淀。 2、可选:加入 100μl 2g/L 的 BSA。 3、加入 1ml 200g/L 的 TCA,充分涡旋,将管置于冰上 15-30min,以使蛋白 质沉淀。 4、4℃,最高转速离心 10min,弃上清,用 2ml 70%乙醇洗涤沉淀物至少 2 次,以除去 TCA。 5、制备沉淀物用于 SDS-PAGE 分析(见辅助方案 2) 。 三、GST 融合蛋白的表达与纯化 可使用 pGEX 载体(图 5)在大肠杆菌中高水平地表达与谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合的多肽,这种表达是可诱导型的,且是细胞内表达,用谷胱甘肽 -Sepharose 4B 结合物的亲和层析,在非变性条件下,很容易纯化这种 GST 融合 蛋白。 使用 GST 和重组多肽之间的特异性蛋白酶切割位点, 可以从目的蛋白上切 下氨基酸的 GST 部分,最后,将样品重新上谷胱甘肽-Sepharose 柱,能够除去 GST 部分。

图 5 pGEX 载体是质粒表达载体,它将克隆基因与谷胱甘肽 S 转移酶(GST)融合表达。

在用异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷 (IPTG) 诱导之前, 阻抑物基因与 lac 启动子 tac) lac (p 结合,阻抑 GST 融合蛋白的表达,使用如括号内所示的多接头位点能够将目的多肽正好插 在 GST 基因的后面,在 GST 载体蛋白和目的蛋白之间有蛋白酶切割位点,所以能够将 GST 部分除去。 在多接头序列的下面和在质粒上标明了限制性内切核酸酶位点, 选择载体和适当 的克隆位点的一个很重要的考虑是加到靶多肽 N 端的外来残基尽可能少。

基本方案一 谷胱甘肽 S 转移酶融合蛋白的表达 本方案内容:在振荡培养箱中制备 1.8L 转化的大肠杆菌(3 个 2L 的培养瓶 中各装 600ml) ,使用更多或更大的培养瓶可以进行中等的规模放大,进一步的 规模放大要使用发酵罐来完成。 通过 550nm(OD550)的光密度读数或通过 SDS-PAGE 分析细菌培养物都可以 检测培养物的生长,在诱导之后,不要让细胞生长过长的时间,因为会发生细胞 裂解,释放出能够降解融合蛋白的蛋白酶,对于鉴定细胞破裂,用显微镜观察细 胞是一种很有用的方法。 材料(带√的项见附录 1) √LB 培养基,调 pH 至 7.2 √5mg/ml 氨苄青霉素 在 pGEX 载体中表达 GST 目的蛋白融合蛋白的转化大肠杆菌细胞的甘油培养 物 √100mmol/L 异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG) 500ml 和 2L 培养瓶 紫外/可见光分光光度计 大离心杯 低速制冷离心机(如 Beckman J6-B 和 JS4.2 转头或相当的) ,4℃ 1、制备 LB 培养基,往 3 个 2L 的瓶中各加入 600ml,往两个 500ml 的瓶中 加入各 100ml,在慢排气(液体)设定下高压灭菌 20-30min,冷却至室温。 2、往一个含 100ml LB 培养基的瓶中加入 1ml 5mg/ml 的氨苄青霉素,使用 接种环接种表达目的 GST 融合蛋白的转化大肠杆菌, 用火焰烧所有瓶口, 以降低 污染的危险。37℃振荡(250-300rpm)培养过夜,用紫外/可见光分光光度计测 量 OD550,从第二个 500ml 的瓶(无氨苄青霉素)取培养基作为对照(过夜培养 物的 OD550 应约为 1.0) 。 3、在无菌条件下,往每个含 600ml LB 培养基的 2L 的瓶中加入 6ml 5mg/ml 的氨苄青霉素(终浓度为 0.1mmol/L)往每个 2L 的瓶中加入 30ml 过夜培养物, 37℃振荡培养,直到 OD550 达到 0.5-0.7(约 2h) ,从每个瓶中取出 1ml 的样品, 留作凝胶分析。 应当靠经验确定每种重组蛋白的最佳生长条件, 如果细胞在较低的温度下生 长能够将表达的蛋白质由包含体转变为可溶性的组分,必须延长培养时间。 4 、 诱 导 细 胞 表 达 : 往 每 个 瓶 中 加 入 6ml 100mmol/L IPTG ( 终 浓 度 为 1.0mmol/L) ,37℃培养 2.5-3h。从摇瓶中取培养物,测定最终的 OD550,从每个 瓶中取出 1ml,用作凝胶分析。 5、将各培养物各倒入一个离心杯中,4℃,4000g 离心 20min,小心倒出上 清,在每个离心杯中留下 15-50ml 上清,在这些上清中重悬沉淀的细胞。 6、将悬液移至一个 50ml 的离心管中,4℃,4000g 离心 20min,倒掉上清,

将其放入-80℃冰箱中冷冻沉淀。 7、用 SDS-PAGE(见第 10.1 单元)分析诱导前和诱导后的样品,证实诱导蛋 白质的表达。 基本方案二 可溶性 GST 融合蛋白的亲和层析纯化 材料(带√的项见附录 1) 谷胱甘肽-Sepharose 4B 树脂(Amersham Pharmacia Biotech 公司) √PBS √谷胱甘肽缓冲液 √PBS/EDTA/PMSF 缓冲液 表达融合蛋白的大肠杆菌培养物沉淀(见基本方案 1 第 6 步) √裂解缓冲液,冰冷的 √洗涤缓冲液,冰冷的 √PBS/EDTA 2.5cm×8cm 谷胱甘肽-Sepharose 4B 柱(如 Bio-Rad Econo 公司) 蠕动泵 超声破碎仪,装有细尖探头(如 Branson 公司) 60ml 离心杯(能够承受 48000g 的离心力) 高速冷冻离心机(如 Beckman JZ-21M 离心机和 JA-18 转头,或相当的)4℃ Dounce 匀浆器 注意:除 SDS-PAGE(室温)外,所有步骤都应当在 4℃冷室中进行,除非另 有说明。 1、将 20ml 谷胱甘肽-Sepharose 4B 树脂倒入 2.5cm×8cm 的柱中(装柱的细 节参见第 8.3 单元) ,用蠕动泵,用 5-10 倍体积的 PBS 洗涤谷胱甘肽柱,流速为 1.5ml/min,以除去乙醇贮存溶液。 树脂的量应当足够纯化 1.8L 培养物中的融合蛋白,这 1.8L 培养物中含有 60-120mg 的融合蛋白。 2、用 3-5 倍体积的谷胱甘肽缓冲液洗涤柱,流速为 1.5ml/min,然后用 10 倍体积的 PBS/EDTA/PMSF 洗涤柱,流速为 1.5ml/min。 以前用过的柱在贮存过程中可能会被部分氧化,在使用前 24h 以内应当重 新平衡(第 2 步) 。 3、将每 600ml 培养物的沉淀重悬于 15ml 冰冷的裂解缓冲液(25-50μl 缓冲 液/ml 的培养物)中,用装有细尖探头的超声破碎仪超声裂解细胞,超声 10 次, 每次工作 10s、 间歇 1min, 在超声过程中, 要将细胞置于冰上, 并防止产生泡沫, 否则会使融合蛋白变性,保留裂解物样品(约 100μl)用于凝胶分析,将其余的 裂解物移至一个 60ml 的离心杯中。 4、将裂解物于 4℃,48000g 离心 20min,将上清(含可溶性的融合蛋白) 倒入一个干净的 50ml 离心管中。 5、将沉淀重悬于冰冷的洗涤缓冲液,体积与第 3 步所用的裂解缓冲液体积

相同,用 Dounce 匀浆器重悬沉淀。 6、用 SDS-PAGE(见第 10.1 单元)分析裂解物、上清和重悬的沉淀物,证实 融合蛋白在上清中。 7、将上清上到一根预平衡过的谷胱甘肽柱(第 2 步)中,流速≤0.1ml/min (如过夜) ,收集各组分,用 SDS-PAGE(见第 10.1 单元)分析未结合峰的多个组 分,以证实融合蛋白已经结合,而且未超过柱的容量。 在早期的未结合组分中没有融合蛋白, 但在晚期未结合组分中出现融合蛋白, 这表明已经超过了柱的容量。 8、用 5-10 倍体积的 PBS/EDTA/PMSF 洗涤柱,流速为 1.5ml/min,之后用 10 倍体积的 PBS/EDTA 洗涤柱,流速为 1.5ml/min,以除去 PMSF。 如果要用凝血酶或 Xa 因子切割样品 (见基本方案 3) 必须首先从样品中除 , 去任何的丝氨酸蛋白酶抑制剂(如 PMSF) 。 9、 5 倍床体积的谷胱甘肽缓冲液从柱上洗脱融合蛋白, 用 流速为 0.3ml/min, 用在线式紫外检测仪或通过各个组分的吸收读数,在 280nm 处监测融合蛋白的 洗脱,用 SDS-PAGE 分析各组分,合并含 GST 融合蛋白(纯度通常>90%) ,0-4℃ 保存。 备择方案 用亲和层析从包含体中纯化 GST 融合蛋白 在用尿素或另一种变性剂将包含体溶解之后,再用透析(见第 6.3 单元)的 方法复性,通常能够从包含体中纯化谷胱甘肽 S 转移酶(GST)融合蛋白。作为 从包含体中纯化蛋白质的一种备选方案,当使用 pGEX 载体时,让细胞在较低的 温度下生长通常能够将融合蛋白转变到上清中, 而每升的培养物中仍然能够产生 ≥10mg 的融合蛋白。 附加材料(也见基本方案 2;带√的项见附录 1) √U 缓冲液 Triton-100 √PBS/甘油缓冲液 低速制冷离心机(如 Beckman J6-B 和 JS-4.2 转头,或相当的) ,4℃ 注意:所有步骤都应当在 4℃冷室中进行,除非另有说明。 1、预平衡谷胱甘肽柱、裂解细胞、分离裂解物的沉淀(含有包含体)和上 清(见基本方案 2 第 1-5 步) 。 2、将洗涤过的沉淀于 4℃,48000g 离心 20min,倒掉上清,将每 600ml 原 始培养物的沉淀溶于 12ml 新配制的 U 缓冲液中,在冰上温育 2h。 3、4℃,48000g 离心 20min,将上清(含有提取的融合蛋白)小心地移至一 支干净的 50ml 离心管中,加入 Triton-100,使终浓度为 1%(V/V) 。 4、加入 20 倍体积的 PBS/甘油缓冲液透析 2-3h,然后加入大于 100 倍体积 的 PBS/EDTA/PMSF 缓冲液透析过夜。 5、 从透析袋中取出样品, 4℃, 于 4000g 离心 20min, 过柱纯化融合蛋白 (见 基本方案 2 第 7-9 步) 。

基本方案三 蛋白酶切割融合蛋白溶液以除去 GST 亲和标签 对于每种重组融合蛋白必须凭经验确定最佳的切割条件(如温度、酶-底物 比率、温育时间的长度和缓冲液条件) 。 材料(带√的项见附录 1) 亲和纯化的融合蛋白溶液 凝血酶(Sigma 公司) ,溶于水中,浓度为 0.5U/μl;或 1μg/μl 的 Xa 因子 (Boehringer Mannheim 公司) 0.15mol/L PMSF,溶于异丙醇中 √PBS/EDTA/PMSF 缓冲液 Beckman J6-B 离心机和 JS-4.2 转头(或相当的) ,4℃ 1、往亲和纯化的融合蛋白溶液中加入适量的凝血酶(pGEX-T 载体)或 Xa 因子(pGEX-X 载体) ,在 37℃(凝血酶)或 25℃(Xa 因子)振荡水浴消化 2-8h。 对于每种重组融合蛋白必须先凭经验确定适当的酶量, 即在试验性的蛋白酶 解分析实验中试验大量消化的条件。 2、中止制备性消化:加入 1:500 稀释的 0.15mol/L PMSF 贮液,37℃温育 15min(凝血酶)或 25℃温育 30min(Xa 因子) 。 3、于 4℃加入 2L PBS/EDTA/PMSF 透析 2 次,每次换液至少间隔 4h。 如果要将样品重新上谷胱甘肽-Sepharose 层析, 以除去 GST 部分和未被切 割的融合蛋白,则将谷胱甘肽完全除去是很重要的。 当使用 MWCO<12000 的透析袋时, 由于在透析过程中谷胱甘肽平衡很慢, 所以透析条件应当增加到至少换 3 次液,每次使用 2L 透析缓冲液。 4、 将透析后的样品于 4℃, 4000g 离心 20min, 以除去任何的沉淀物, 0-4℃ 在 将上清移至一个干净的管中,用 SDS-PAGE(见第 10.1 单元)分析。 在谷胱甘肽柱上重新层析可以将切下的目的蛋白与 GST 和未切开的融合蛋 白分开。 四、装柱 基本方案一 脱盐(分组分离) 材料(带√的条目见附录 1) 对目的蛋白具有适当排阻极限的 GF 介质或 GF 预装柱 √GF 脱盐缓冲液 带色的标准参照物:0.2mg/ml 蓝色葡聚糖 2000 或 0.2mg/ml 维生素 B12 √空白标准参照物(void marker) √总液体体积标准参照物

带脱盐的蛋白质样品 90℃水浴(可选) 布氏漏斗或烧结的玻璃漏斗 GF 层析柱,带有外延柱(column extension;可选) 、可调式街头和缓冲液容 器(图 6) 水平仪 蠕动泵(图 6) 0.22μm 滤器:缓冲液过滤可用任意的 0.22μm 滤器;样品过滤必须使用蛋白 质相容性的滤器 检测仪(可选,图 6) 记录仪(可选,图 6) 上样器:上样环(如 Superloop、Amersham Pharmacia Biotech 公司)或注射 器 组分收集器(可选,图 6) 如果 GF 介质是干粉 1a、 根据生产商提供的溶胀系数 (swelling factor) 和要充填的大概柱床体积, 计算所需要的 GF 干介质的量,将计算好量的干胶加入 GF 脱盐缓冲液中,所用 缓冲液的量为所计算的最终凝胶体积的 2 倍(即大约柱床体积的 2 倍) 。 2a、用玻璃棒小心地搅拌凝胶悬液,让凝胶于室温溶胀过夜或在 90℃水浴 中溶胀 3h, 根据需要进行搅拌, 保持凝胶处于悬浮状态。 不要使用磁力搅拌器, 它会将脆弱的凝胶颗粒打碎。

图 6 凝胶过滤设备。A、简单的脱盐装置,用巴斯德吸管制成的开放床柱子。B、柱子和附 件。C、全自动系统。图片由 Amersham Pharmacia Biotech 公司提供。

3a、让凝胶床沉降,然后轻轻地倒出浑浊的溶液,除去凝胶细粒和破碎的胶 珠,重复这个步骤(如果必要可进行 4 或 5 次) ,直到沉降下来的凝胶与上清形 成一条界限分明的带,然后用 GF 缓冲液稀释凝胶成 50%的凝胶浆。接着进行第 4 步。 如果 GF 介质是预先溶胀过的 1b、在布氏漏斗或烧结的玻璃漏斗中,用过量的 GF 缓冲液洗涤凝胶,以除 去贮存缓冲液。 2b、如果凝胶中含有凝胶细粒,按第 3a 步的操作将其除去。 3b、用 GF 缓冲液稀释凝胶成 50%的凝胶浆,接着进行第 4 步。 4、检查柱子,要确保洁净,而且保护网(support net)未损坏,如果必要, 更换新的保护网。 5、 将层析柱安装在一个稳固的试验架上, 用水平仪调整, 确保柱子的垂直。 如果 50%以上的层析柱需要装填料,则在层析柱上加装外延柱,外延柱和柱子合 在一起足够装下所有的凝胶浆(即沉降后凝胶体积的 2 倍) 。 6、排出出口管和底部接头内的空气,方法是将 GF 缓冲液注入出口管内(使 用注射器或蠕动泵) 直到保护网上方的缓冲液达到 0.5cm 高, , 关闭柱子的出口。 7、将 GF 缓冲液注入可调式接头的入口管内,直到保护网湿润,同时保持出

口向上,以确保空气易于从保护网内排出,将可调式接头置于一装有 GF 缓冲液 的烧杯中,直到使用时取出。 8、将第 3a 步或第 3b 步准备好的凝胶浆轻轻回旋,将一根玻璃棒倾斜放在 柱子或外延柱的内壁上,沿玻璃棒将全部凝胶浆倒入柱内,用 GF 缓冲液填满剩 余的空间,同样小心地沿玻璃棒倒入缓冲液,尽量不要破坏凝胶层。将外延柱用 盖子盖好(或在层析柱上安装上部接头) 。 9、在缓冲液容器中装满 GF 缓冲液,放在高于泵的位置。用大内径的管子连 接泵和缓冲液容器。 10、用 GF 缓冲液清洗泵,将泵的出口连接到层析柱或外延柱的入口上。打 开层析柱的出口,开启泵,流速为生产商推荐的适合于所用凝胶、层析柱组合的 流速。一起泵入缓冲液,直到凝胶床的高度恒定位置(一般需要 1-4h) 。 11、关闭泵和层析柱出口,取下外延柱,调整柱床高度(只有要出去过多的 凝胶时才需要) ,用刮勺小心地搅动凝胶面的上部,吸去过多的凝胶浆。调整入 口接头,使其与柱床表面平齐,避免在保护网下形成气泡。 12、重新连接泵和层析柱,打开层析柱的出口,重新进行第 10 步的液流条 件,维持 1h,以使柱床高度稳定。重新调整接头,使其与新柱床表面平齐。 13、用肉眼对光,检查填充的柱床是否有裂纹、气泡和颗粒聚集物,按照第 20-23 步, 用带色的标准参照物 (2mg/ml 的蓝色葡聚糖 2000 或 0.2mg/ml 的维生 素 B12)进行层析,确定所得到的区带平行、锐利。 14、计算层析所需的 GF 缓冲液的用量,多加 50%,用 0.22μm 的滤器过滤。 如果必要,可调整 pH,将过滤后的缓冲液加到缓冲液容器内。 15、按照生产商的说明书,安装 GF 系统,将检测仪和记录仪(如果使用) 连接好,但先不连接层析柱。将泵和缓冲液容器连接好,在安装柱子前,用 GF 缓冲液洗泵。 16、通过上样阀门将泵的出口和层析柱连接起来,用 GF 缓冲液运行系统, 流速为要用于蛋白质分离的流速,用组分收集器收集组分,并记录泵的实际流速 (如通过称量或用量筒测量所收集的组分来计算实际流速) 。 17、按照第 20-23 步的方法,用空白标准参照物进行层析,根据得到的洗脱 体积来确定系统的外水体积(Vo,图 7)

图 7 由外水体积(Vo)和总液体体积(Vt)所决定的凝胶过滤的分离体积 Vi 层析示意图。总 柱床体积 c) (V 等于总液体体积加介质体积。 柱效的计算公式为 N=5.54 r/Wh) 在此式中, (V 。 N 是以理论塔板数表示的柱效,Vr 是峰的洗脱体积,Wh 是半高峰宽。在 10%峰高处,峰的 对称性的计算公式为 b/a,b 是峰尾部的宽度,a 是峰头部的宽度。

一般来说,非刚性凝胶(如琼脂糖)的 Vo 为柱床体积的 30%-33%,刚性凝

胶(如硅胶)的 Vo 为柱床体积的 36%-40%。 18、按照第 20-23 步的操作,用总液体体积参照物进行层析,根据所得到的 洗脱体积确定系统的总液体体积(Vt) 。 一般来说, 对于非刚性凝胶,Vt 为几何柱床体积(πr2L, 为层析柱的内径) r 的 85%-95%,对于刚性凝胶,Vt 为几何柱床体积的 70%-80%。 19、计算层析柱的分离体积(Vi) ,等于 Vt-Vo。 20、将待脱盐的样品溶于 GF 缓冲液中,用 0.22μm 的滤器过滤。 21、打开层析柱的出口,启动泵,让 2 倍体积的 GF 缓冲液流过系统。打开 检测仪和记录仪,让基线稳定。 22、将适量要脱盐的样品加到上样器上,不要超过第 19 步所确定的分离体 积。 将上样阀门打开到上样位置, 在记录纸上坐好起始标记 (如果没使用记录仪, 则启动秒表) 。 23a、确定洗脱体积:让 GF 缓冲液以适当的流速通过层析系统,在收集组分 的同时,用记录仪记录检测仪的反应,得到一幅层析图,计算洗脱体积,洗脱体 积等于蛋白质(或其他溶质)从起始点到达峰尖的时间乘以泵的流速(如第 16 步所确定的) 。 23b、让 GF 缓冲液通过层析柱,用量等于外水体积减去上样体积的一半, 收集废液。在层析柱下放一个可容纳 1.5 倍加样体积的容器,然后向层析柱中加 入与上样体积等量的 GF 缓冲液,收集脱盐的蛋白质(样品层析图见图 8) 。

图 8 用凝胶过滤进行蛋白质脱盐的层析示意图。使用装填 Sephadex G-25 的 4cm×85cm 层析 柱。样品室 400ml 血红蛋白(蛋白峰;实线)和 NaCl(盐峰;虚线) 。注意,样品体积接近 于 填 充 介 质 的 空 隙 体 积 ( 即 490ml ) 样 品 体 积 未 作 任 何 修 正 , 从 图 上 计 算 得 到 , Vo=560-200=360ml,为几何柱体积(Vc)的 31%。改图经层析杂志允许后复制。

24、用超过 1 倍柱体积的含抗菌剂的 GF 缓冲液洗涤层析柱,关闭层析柱的 出口,保存层析柱。

基本方案二 蛋白质分级分离 材料(带√的条目见附录 1) 对目的蛋白具有适当选择性的 GF 介质或 GF 预装柱(见策略设计) √GF 分级分离缓冲液 带色的标准参照物:0.2mg/ml 的蓝色葡聚糖 2000 或者 0.2mg/ml 的维生素 B12 低分子质量标准参照物(如 5mg/ml 丙酮或者 2mmol/L NaCl) 待分离的蛋白质样品 GF 层析柱(典型长度为 30-100cm) 1、如脱盐方法(见基本方案 1,第 1a-3a 步或第 1b-3b 步)所述,准备 GF 介质,但在表明 GF 缓冲液的地方均使用 GF 分离缓冲液。 2、装柱(见基本方案 1 第 4-12 步) ,肉眼检查装柱的质量(见基本方案 1 第 13 步) ,安装和测试系统(第 14-16 步) 。 3、用带色的标准参照物(2mg/ml 的蓝色葡聚糖 2000 或 0.2mg/ml 的维生素 B12)进行层析,确定所得到的区带平行、锐利。 4、用低分子质量标准参照物(如 5mg/ml 丙酮或 2mol/L NaCl;见基本方案 1 第 20-23 步)进行层析,得到一幅层析图,确定柱效。 在该步中,上样体积对峰宽的影响很大,并会造成柱效低的假象。对于使用 平均颗粒直径为 100μm、30μm 和 10μm 的 GF 介质所装填的层析柱,样品体积 分别不应超过柱床体积的 0.9%、0.5%和 0.4%。 5、根据公式 N=5.54(Vr/Wh)2 计算每根层析柱的理论塔板数,N 为柱子的 理论塔板数,Vr 为峰的洗脱(保留)体积,Wh 为半高峰宽。有关这些变量的图 形描述见图 7,有关柱效的讨论见第 8.1 单元。 6、根据公式 As=b/a 计算峰的不对称因子(asymmetry factor) 为在 10% ,a 峰高处峰前半部分的宽度,b 为在 10%峰高处后半部分的宽度。 7、将实验获得的柱子塔板数和不对称因子与生产商提供的这些参数的可接 受限(acceptance limit)进行比较。 8、 将要分级分离的蛋白质样品溶解、 上样、 层析分离 (见基本方案 1 第 20-23 步) ,用 HPLC(见第 8.5 单元)或电泳(见第 10.1-10.3 单元)检测所收集组分的 纯度。 五、蛋白质电泳 基本方案 变性(SDS)不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳:Laemmli 法 在变性条件下(即在 0.1%SDS 存在的条件下)进行单向凝胶电泳,当蛋白质 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳基质向阳极泳动时,基于分子的大小来分离蛋白。灌制 凝胶时,先灌注分离胶(有时又称电泳胶) ,再在其上部灌制积层胶(浓缩胶) , 然后固定在电泳槽上。将蛋白质样品在 SDS 中煮沸,使其溶解,在溶解过程中, 加入 2-巯基乙醇(2-ME)或二硫苏糖醇(DTT) ,以还原二硫键。本方案适用于 最大尺寸为 0.75mm×14cm×14cm 的垂直板凝胶,对于较厚的凝胶,必须调整积 层胶和分离胶的体积以及工作电流。 注意: 现在可购得预制凝胶, 规格有大型胶和微型胶, 使用不同的缓冲系统, 有均一胶也有梯度胶。供应商有 Amersham Biosciences 公司、Bio-Rad 公司、

Genomic Solutions 公司、 Invitrogen 公司、 BioExpress 公司、 Bio Technologies ISC Jule 公司和 Sigma 公司,另外还有其他公司。 材料(带√的条目见附录 1) 分离胶和积层胶溶液(表 1) 水饱和的异丁醇 √1×Tris· Cl/SDS,pH8.8(用 4×Tris· Cl/SDS,pH8.8 稀释) 要分析的蛋白质样品 √2×SDS 样品缓冲液 √6×SDS 样品缓冲液 分子质量标准品混合物(如 Bio-Rad 公司、New England Biolabs 公司、Pierce 公司、Sigma 公司和其他公司) √1×SDS 电泳缓冲液 电泳装置, 带夹子、 玻璃板、 灌胶支架和缓冲液槽 (如 Bio-Rad 公司、 Amersham Pharmacia Biotech 公司) 0.75mm 隔条 25ml 带侧支的三角瓶(凝胶溶液脱气用) 有冷阱的真空泵(凝胶溶液脱气用) 带有 1、3、5、10、15 或 20 个梳齿的 0.75mm 塑料梳子 25μl 或 100μl 注射器,带钝头针头 恒流电源 1、按厂商的说明书,用两块干净的玻璃板和 2 个 0.75mm 的隔条,组装电 泳装置的玻璃平板夹层,并将其固定在灌胶支架上。 2、 配制分离胶溶液(表 1) 对于分子质量为 60-200kD 的 SDS 变性蛋白质, , 使用 5%的分离胶、16-70kD 的 SDS 变性蛋白质用 10%的分离胶、12-45kD 的 SDS 变性蛋白质用 15%的分离胶。用一根巴斯德吸管,将分离胶溶液沿着一个隔条的 边缘加到玻璃板夹层中,直到玻璃板之间溶液的高度约为 11cm。样品体积少于 10μl 时(不需灌制积层胶) ,管分离胶一直到梳子处,以形成加样孔(第 6 步和 第 7 步) 。 3、用另一根巴斯德吸管,先从一侧的隔条边缘,再从另一侧隔条边缘缓缓 地往凝胶的顶部加入一层水饱和的异丁醇(厚约 1cm) ,让凝胶在室温聚合 30-60min。 聚合后, 在顶层异丁醇与凝胶界面间可见一清晰的折光线。胶的聚合失败往 往是过硫酸铵和(或)TEMED 有问题。加入水时过硫酸铵应该有“劈啪”的声响, 如果没有,应该购买新鲜的过硫酸铵。购买小瓶的 TEMED,以便在需要的时候 可试用新开封的 TEMED。 4、倾去异丁醇,用 1×Tris· Cl/SDS(pH8.8)彻底冲洗。 5、配制积层胶溶液(表 1) 。用巴斯德吸管,将积层胶溶液缓缓地沿着一侧 隔条边缘加入到玻璃平板夹层中,直到夹层中的溶液高度离玻璃板顶部约 1cm 高为止。小心不要产生气泡。

6、插入 0.75mm 厚的塑料梳子,再补加积层胶溶液填满梳子间的空隙,仍 然注意避免产生气泡。让积层胶在室温聚合 30-45min。 7、在密封的螺盖微量离心管中,用 2×SDS 样品缓冲液按 1:1(V/V)的比例 稀释蛋白质样品, 100℃煮沸 3-5min。 于 如果样品使蛋白质沉淀物, 加入 50-100μl 1×SDS 样品缓冲液溶液;如果样品是蛋白质稀溶液,可考虑用 6×SDS 样品缓冲 液(终浓度为 1×) ,以增加蛋白质的上样量。根据供应商的说明书,用 1×SDS 样品缓冲液溶解蛋白质分子质量标准品混合物。 用考马斯亮蓝染色时,对分成分复杂的蛋白质混合物,0.8cm 宽的加样孔的 加样体积不超过 20μl(25-50μg 总蛋白质)为宜,对于只有一种或几种蛋白质的 样品,只需 1-10μg 的总蛋白质。采用银染时,样品用量可减少 10-100 倍。为了 得到均一的条带,配制蛋白质样品时,浓度和等体积要相同。 在加入 SDS 样品缓冲液前后, 要将样品一直置于冰上。 SDS 样品缓冲液的 含 样品,如未经 100℃加热灭活蛋白酶之前,切勿将其放于室温。 8、小心拔出塑料梳子,避免撕裂凝胶加样孔,用巴斯德吸管以 1×SDS 电泳 缓冲液冲洗加样孔,并充满加样孔。 9、根据厂商说明书,将灌好的凝胶夹层固定至上层缓冲液槽上,在下层缓 冲液槽中加入 1×SDS 电泳缓冲液,然后将凝胶板夹层放入下层缓冲液槽中,往 上层缓冲液槽中加入部分 1×SDS 电泳缓冲液至覆盖凝胶加样孔为止。
表 1 聚丙烯酰胺分离胶和积层胶配方 a 分离胶:在一个 25ml 带侧支的三角瓶中,混匀 30%丙烯酰胺/0.8%甲叉双丙烯酰胺溶液(见 附录 1) 、4×Tris· Cl/SDS(pH8.8) (见附录 1)和水,真空脱气约 5min,加入 10%过硫酸铵 和 TEMED,轻轻旋转混匀,立即使用
贮液
b

分离胶中丙烯酰胺的终浓度 /%

c

5 2.50 3.75 8.75
d

6 3.00 3.75 8.25 0.05 0.01

7 3.50 3.75 7.75 0.05 0.01

7.5 3.75 3.75 7.50 0.05 0.01

8 4.00 3.75 7.25 0.05 0.01

9 4.50 3.75 6.75 0.05 0.01

10 5.00 3.75 6.25 0.05 0.01

12 6.00 3.75 5.25 0.05 0.01

13 6.50 3.75 4.75 0.05 0.01

15 7.50 3.75 3.75 0.05 0.01

30%丙烯酰胺/0.8%甲叉双 丙烯酰胺 4×Tris· Cl/SDS,pH8.8 H2O 10%(m/V)过硫酸铵 TEMED

0.05 0.01

积层胶(3.9%丙烯酰胺) :在一个 25ml 带侧支的三角瓶中,混匀 0.65ml30%丙烯酰胺/0.8% 甲叉双丙烯酰胺、 1.25ml4×Tris· Cl/SDS (pH8.8) (见附录 1) 3.05ml 水, 和 真空脱气 5-10min, 加入 25μl10%过硫酸铵和 5μl TEMED,轻轻旋转混匀,立即使用。 a:本方法配制 15ml 的分离胶和 5ml 的积层胶,足够灌制一块 0.75mm×14cm×14cm 大小的 凝胶。本配方基于 Leammli(1970)的 SDS(变性)不连续缓冲体系。 b:实验方案中的所有试剂盒溶液都必须用 Milli-Q 纯水或同等质量的水配制。 c:体积单位是 ml。分离胶中丙烯酰胺的百分浓度取决于待分离蛋白质的分子大小。 d:最好现配现用。

10、用一个 25μl 或 100μl 带钝头针头的注射器,小心地加样,使样品在孔的 底部成一薄层,在对照孔中加入分子质量标准品。如有空置的加样孔,加入等体 积的 1×SDS 样品缓冲液。 11、再往上层槽中加入 1×SDS 电泳缓冲液,完全覆盖上层槽的铂电极。此 操作必须缓慢小心,以免冲起样品孔中的样品。 12、连接电源,对于一块 0.75mm 厚的凝胶,先在 10mA 恒流下电泳,直到

溴酚蓝指示剂进入分离胶,将电流增至 15mA,继续电泳,直到溴酚蓝到达分离 胶底部为止。 对于一块标准的 16cm 凝胶板,每 0.75mm 厚的凝胶在 4mA 恒流下电泳约 需 15h(即过夜) ;每 0.75mm 厚的凝胶在 15mA 下电泳只需 4-5h。两块凝胶或 一块 1.5mm 厚的凝胶电泳,将电流加倍。对于一块 1.5mm 厚的凝胶,在 30mA 恒流下电泳,必须用循环水浴将温度控制在 10-20℃,以防止出现“微笑效应” (迁 移条带弯曲) 。 13、关闭电源,弃去电泳缓冲液,取出固定凝胶夹层的上层缓冲液槽。 14、确定凝胶方向,以便识别样品孔的顺序,从上层槽中取出凝胶板,放置 在一张吸水纸或纸巾上。 15、沿着隔条的整个长度的方向,小心地从凝胶夹层的边缘将其中一个隔条 抽出一半,并以露出的隔条为杠杆撬开玻璃板,露出凝胶。小心地从下面的玻璃 板下取出凝胶, 在凝胶的一角上切去一小三角, 以便在染色和凝胶干燥后仍能认 出加样顺序。 凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染色(见第 10.4 单元) ,或将蛋白质电洗脱, 也可电转移至膜上(见第 10.5 单元)后再染色(见第 10.6 单元)或进行序列分 析、 或转移到膜上进行免疫印迹 (见第 10.7 单元) 如果蛋白质已用同位素标记, 。 则可用放射自显影检测。 基本方案 非变性连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 在非变性凝胶中,蛋白质的迁移率取决于其大小、形状和固有电荷。非变性 凝胶电泳分离蛋白质的装置与变性凝胶所用装置相同(见第 10.1 单元) ,而且适 合于多种尺寸范围(如从 7.3cm×8.3cm 的微型胶到 14cm×16cm 全长的凝胶)和 基质类型(如均一胶和梯度胶) 。 连续电泳系统 (配制丙烯酰胺溶液所用的缓冲液与电泳缓冲液相同)分离蛋 白质由缓冲液的 pH 所控制。本方案阐述了 4 种类型的缓冲液,可在 pH3.7 到 pH10.6 的范围内使用。pH 主要取决于目的蛋白和任何杂蛋白的等电点、蛋白质 的迁移率和溶解度, 确定应用何种 pH 主要靠经验。 预先知道蛋白质的等电点 (见 第 10.3 单元)可确定在分离条件下蛋白质所带的净电荷(如果凝胶的 pH 小于蛋 白质的等电点,蛋白质带正净电荷;如果凝胶的 pH 大于蛋白质的等电点。蛋白 质带负电荷) 。 电泳时,应当包含天然蛋白质标准品,这一点很重要。一些厂商提供等电聚 焦用的蛋白质标准品,也适用于非变性电泳。也可选择 Sigma 公司的蛋白质标准 品试剂盒,在中性 pH、非变性条件下计算分子质量时很有用。 材料(带√的条目见附录 1)

√4×乙酸凝胶缓冲液,pH3.7-5.6 √4×磷酸盐凝胶缓冲液,pH5.8-8.0 √4×Tris 凝胶缓冲液,pH7.1-8.9 √4×甘氨酸凝胶缓冲液,pH8.6-10.6 待分析的蛋白质样品 蔗糖 迁移指示剂:细胞色素 c(pI9-10)或溴酚蓝 天然蛋白质标准品 电泳缓冲液:适当的 4×凝胶缓冲液,用水稀释为 1× 1、安装凝胶电泳装置的玻璃板夹层,固定在制胶架上(有关凝胶电泳更详 细的内容见第 10.1 单元) 2、配制丙烯酰胺溶液(表 2-表 5) ,使用前加入过硫酸铵和 TEMED。脱气可 加速凝胶聚合,但一般不需要脱气。 3、灌注凝胶到距离凝胶夹层顶部 2cm 处,插入梳子,避免产生气泡,让凝 胶聚合 1-2h。 4、用含有迁移指示剂(阳离子系统,每条泳道 5-10μg 细胞色素 c;阴离子 系统, 10μg/ml 溴酚蓝) 5% 的 (m/V) 蔗糖[溶于水或稀凝胶缓冲液 (1-5mmol/L) 中]溶解蛋白质样品。同法配制天然蛋白质标准品。 对高度富集的样品(如蛋白质标准品)进行考马斯亮蓝染色时,所用浓度为 1-2mg/ml;对于较复杂的混合物,使用 5-10mg/ml。银染时,样品的浓度要减少 10-100 倍。以最小体积上样(0.75mm 和 1.5mm 厚凝胶的上样量分别为 10μl 和 20μl) 。 5、小心地取出梳子,用电泳缓冲液冲洗加样孔,然后用电泳缓冲液充满加 样孔。 6、可选:将凝胶预电泳,以去除所有带电荷的材料(如过硫酸铵) 。在 300V 电压下电泳,直到电流不再下降(约 30min) 。拆开凝胶装置,弃去缓冲液。 7、仔细地上样使样品在孔底部形成一薄层,样品或蛋白质标准的上样量为 每泳道 10μl(0.75mm 凝胶)或 20μl(1.5mm 凝胶) 。在剩余的所有空孔中均加 入等量的电泳缓冲液,防止泳道中样品的扩散。 8、安装凝胶电泳装置,在上、下缓冲液槽中加入电泳缓冲液,连通凝胶装 置与电源。如果在分离条件下蛋白质带负电,应该使用标准的 SDS-PAGE 电极极 性 (蛋白质向阳极或正极迁移) 如果蛋白质带正电荷, 。 则将电源上的电极对调, 以便蛋白质向阴极迁移。 9、1.5mm 厚的凝胶,电流设定为 30mA;0.75mm 厚的凝胶,则为 15mA, 进行电泳, 直到迁移指示剂到达凝胶的底部 (标准胶需要 4-6h, 微型胶需要 1-2h) 时,关闭电源,拆开凝胶装置,从玻璃夹层中取出凝胶,根据第 10.4 单元的方 法对凝胶染色。
表 2 乙酸非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的配方 a:pH3.7-5.6b 贮液 c 凝胶中丙烯酰胺的终浓度 d/%

5 30%丙烯酰胺/0.8%甲叉双丙烯酰胺 300mmol/L 亚硫酸铵 4×乙酸凝胶缓冲液 H2O 10%(m/V)过硫酸铵 TEMED
f e,f e

7.5 10 0.4 10 19.28 0.3 0.02

10 13.3 0.4 10 15.98 0.3 0.02

12.5 16.8 0.4 10 12.48 0.3 0.02

15 20 0.4 10 9.28 0.3 0.02

17.5 23.32 0.4 10 5.96 0.3 0.02

20 26.6 0.4 10 2.68 0.3 0.02

6.7 0.4 10 22.58 0.3 0.02

凝胶制备:在一个 75ml 带侧支的三角瓶中,混匀 30%丙烯酰胺/0.8%甲叉双丙烯酰胺(见附 录 1) 、300mmol/L 亚硫酸钠、4×乙酸凝胶缓冲液(见附录 1)和 H2O。若要加速凝胶聚合, 真空脱气约 5min。加入 10%过硫酸铵和 TEMED。轻轻旋转混匀,立即使用。 a、本配方配制 40ml 凝胶溶液,足够制备一块 1.5mm×14cm×16cm 大小的凝胶,或两块 0.75mm×14cm×16cm 的凝胶。 b、使用未稀释的乙酸代替 4×乙酸凝胶缓冲液,可使 pH 范围延伸至约 2.0(乙酸的 pH) , 尽管在 pH2.0 时几乎没有缓冲能力。 c、本方案中的所有试剂和溶液均需要 Milli-Q 纯水或同等质量的水配制。 d、体积单位是 ml。凝胶溶液中丙烯酰胺的百分比浓度取决于待分离蛋白质的分子大小。 e、必须现配现用。在酸性 pH 条件下所有凝胶的有效聚合,需要使用亚硫酸钠。 f、加入后即开始聚合。 表 3 磷酸盐非变性聚丙烯酰胺凝胶的配方 a:pH5.8-8.0 贮液
b

凝胶中丙烯酰胺终浓度 c/% 5 6.7 10 23.08
d,e

7.5 10 10 19.78 0.2 0.02

10 13.3 10 16.48 0.2 0.02

12.5 16.8 10 12.98 0.2 0.02

15 20 10 9.78 0.2 0.02

17.5 23.32 10 6.46 0.2 0.02

20 26.6 10 3.18 0.2 0.02

30%丙烯酰胺/0.8%甲叉双丙烯酰胺 4×磷酸凝胶缓冲液 H2O 10%(m/V)过硫酸铵 TEMED
e

0.2 0.02

凝胶制备: 在一个 75ml 带侧支的三角瓶中, 混合 30%丙烯酰胺/0.8%甲叉双丙烯酰胺溶液 (见 附录 1) 、4×磷酸凝胶缓冲液(见附录 1)和 H2O。必要的话,真空脱气 5min 以加速凝胶聚 合。再加 10%过硫酸铵和 TEMED。轻轻旋转混匀,立即使用。 a、本配方配制 40ml 凝胶溶液,足够制备一块 1.5mm×14cm×16cm 大小的凝胶,或两块 0.75mm×14cm×16cm 的凝胶。 b、本方案中的所有试剂和溶液均需要 Milli-Q 纯水或同等质量的水配制。 c、体积单位是 ml。凝胶溶液中丙烯酰胺的百分比浓度取决于待分离蛋白质的分子大小。 d、必须现配现用。 e、加入后即开始聚合。 表 4 Tris 非变性聚丙烯酰胺凝胶的配方 a:pH7.1-8.9 贮液 b 30%丙烯酰胺/0.8%甲叉双丙烯酰胺 4×Tris 凝胶缓冲液 H2O 10%(m/V)过硫酸铵 TEMEDe
d,e

5 6.7 10 23.08 0.2 0.02

凝胶中丙烯酰胺终浓度 c/% 7.5 10 12.5 15 17.5 10 10 19.78 0.2 0.02 13.3 10 16.48 0.2 0.02 16.8 10 12.98 0.2 0.02 20 10 9.78 0.2 0.02 23.32 10 6.46 0.2 0.02

20 26.6 10 3.18 0.2 0.02

凝胶制备: 在一个 75ml 带侧支的三角瓶中, 混合 30%丙烯酰胺/0.8%甲叉双丙烯酰胺溶液 (见

附录 1) 、4×Tris 凝胶缓冲液(见附录 1)和 H2O。若要加速凝胶聚合,可真空脱气约 5min。 再加 10%过硫酸铵和 TEMED。轻轻旋转混匀,立即使用。 a、本配方配制 40ml 凝胶溶液,足够制备一块 1.5mm×14cm×16cm 大小的凝胶,或两块 0.75mm×14cm×16cm 的凝胶。 b、本方案中的所有试剂和溶液均需要 Milli-Q 纯水或同等质量的水配制。 c、体积单位是 ml。凝胶溶液中丙烯酰胺的百分比浓度取决于待分离蛋白质的分子大小。 d、必须现配现用。 e、加入后即开始聚合。 表 5 甘氨酸非变性聚丙烯酰胺凝胶的配方 a:pH8.6-10.6 贮液
b

凝胶中丙烯酰胺终浓度 c/% 5 6.7 10 23.08
d,e

7.5 10 10 19.78 0.2 0.02

10 13.3 10 16.48 0.2 0.02

12.5 16.8 10 12.98 0.2 0.02

15 20 10 9.78 0.2 0.02

17.5 23.32 10 6.46 0.2 0.02

20 26.6 10 3.18 0.2 0.02

30%丙烯酰胺/0.8%甲叉双丙烯酰胺 4×甘氨酸凝胶缓冲液 H2O 10%(m/V)过硫酸铵 TEMEDe

0.2 0.02

凝胶制备: 在一个 75ml 带侧支的三角瓶中, 混合 30%丙烯酰胺/0.8%甲叉双丙烯酰胺溶液 (见 附录 1) 4×甘氨酸凝胶缓冲液 、 (见附录 1) H2O。 和 若想加速凝胶聚合, 可真空脱气 5min。 再加 10%过硫酸铵和 TEMED。轻轻旋转混匀,立即使用。 a、本配方配制 40ml 凝胶溶液,足够制备一块 1.5mm×14cm×16cm 大小的凝胶,或两块 0.75mm×14cm×16cm 的凝胶。 b、本方案中的所有试剂和溶液均需要 Milli-Q 纯水或同等质量的水配制。 c、体积单位是 ml。凝胶溶液中丙烯酰胺的百分比浓度取决于待分离蛋白质的分子大小。 d、必须现配现用。 e、加入后即开始聚合。

六、蛋白质检测 基本方案一考马斯亮蓝 R-250 染色 考马斯亮蓝 R-250 可非特异性地结合几乎所有的蛋白质, 整个染色过程较为 快速、简单,而且价格便宜。检测极限是每条带 0.3-1μg 蛋白质。 材料(带√的条目见附录 1) 含有目的蛋白的聚丙烯酰胺凝胶(见第 10.1-10.3 单元) √考马斯亮蓝 R-250 染色液 脱色液:15%(V/V)甲醇/10%(V/V)乙酸(室温可保存 1 个月) 7%(V/V)乙酸(可选) 带密闭盖子的玻璃或塑料容器,大小适合于盛放凝胶 台式摇床 基于蛋白质的脱色材料(可选) :100%白色羊毛纱、纤维素海绵或 Whatman 3MM 滤纸 可重复密封的塑料袋(可选) Whatman 3 MM 滤纸(可选) 塑料保鲜膜(可选) 干胶仪(可选) 1、从电泳仪内取出聚丙烯酰胺凝胶,放入塑料或玻璃容器中,容器内含有

10 倍凝胶体积的考马斯亮蓝 R-250 染色液。对于≤1mm 厚的凝胶,在台式摇床 上缓慢摇动 30-60min,大于 1mm 厚的凝胶则摇动 1-3h。丙烯酰胺浓度较高的凝 胶需要较长的染色时间。可将凝胶在染色液中染色过夜,不会有不良效果。 2、弃去染色液,用去离子水短暂地冲洗凝胶,加入 5-10 倍凝胶体积的脱色 液。为了加速脱色过程,可往溶液中加入基于蛋白质的脱色材料(可选) 。摇动 脱色,直至去除背景染色(长达 24h,如果使用脱色材料,则只需 2-3h) 。如果 需要,可更换脱色液。 3、为了保存,可将凝胶放入含有 1-2ml 脱色液或 7%乙酸的热封塑料袋或可 重复密封的塑料袋内。室温可保存数周,4℃可保存数月。 4、为了永久记录,可将凝胶进行扫描或照相(见辅助方案) ,或按照下述方 法在干胶仪上干燥,在干胶仪上放置一块湿的 Whatman 3 MM 滤纸,用水冲洗 凝胶后放在滤纸上,用塑料保鲜膜覆盖凝胶,然后再放置一块湿的 Whatman 3 MM 滤纸,在 80℃干燥 1-2h,或者按照干胶仪说明书操作。另一种方法是,在 一个支持架上,用多孔膜将凝胶夹于中间,在工作台上将凝胶于室温干燥过夜。 备择方案一 快速考马斯亮蓝 G-250 染色 考马斯亮蓝 G-250 染色的灵敏度通常略高于考马斯亮蓝 R-250。 附加材料(见基本方案 1) 异丙醇固定液:25%(V/V)异丙醇/10%(V/V)乙酸(室温可保存数月) 快速考马斯亮蓝 G-250 染色液:10%(V/V 乙酸)/0.006%(m/V)考马斯亮 蓝 G-250(Bio-Rad 公司,室温可保存数月) 10%(V/V)乙酸 1、从电泳仪内取出聚丙烯酰胺凝胶,放入塑料或玻璃容器中,容器内含有 10 倍凝胶体积的异丙醇固定液。对于 1mm 厚的凝胶,在台式摇床上缓慢摇动 10-15min,1.5mm 厚的凝胶则摇动 30-60min。 2、弃去固定液,加入 10 倍凝胶体积的快速考马斯亮蓝 G-250 染色液,1mm 厚的凝胶,摇动 30-60min;1.5mm 厚的凝胶则摇动 2-3h。 3、弃去染色液,加入 5-10 倍凝胶体积的 10%乙酸,缓慢摇动,直到在清晰 的背景上出现蓝色的蛋白质条带(1-2h) 。 4、为了保存,见基本方案一(第 3 步) ,但是在塑料袋中加入少量的 10% 乙酸,对凝胶进行扫描或照相,见辅助方案。干燥凝胶,见基本方案一(第 4 步) 。 备择方案二 酸性考马斯亮蓝 G-250 染色 酸性考马斯亮蓝 G-250 染色可同时进行凝胶固定和染色, 而且不需要脱色液。 检测能力为每条带少至 50-100ng 的蛋白质。 附加材料(见基本方案一;带√的条目见附录 1) √酸性考马斯亮蓝 G-250 染色液 1、从电泳装置上取下聚丙烯酰胺凝胶,如果凝胶中有 SDS,根据凝胶的厚 度,在 5-10 倍凝胶体积的去离子水中至少温育 5-15min。 2、将凝胶置于含有约 100ml 酸性考马斯亮蓝 G-250 染色液的容器中,放到 台式摇床上,温和地振摇 5h 至过夜。在 30min 内即可见到含有大量蛋白质的条

带,但是染色时间≥5h 可得到最高的灵敏度。 3、倒出染色液,加入去离子水,在 2-5min 内,在清晰的背景上出现亮蓝色 的蛋白质条带。 4、贮存见基本方案一(第 3 步) ,但是在塑料袋中加入少量的水;扫描或凝 胶成像,见辅助方案;凝胶干燥,见基本方案一(第 4 步) 。 附录 1 4×乙酸凝胶缓冲液,pH3.7-5.6 11.49ml 冰醋酸(总浓度 200mmol/L) 加入 500ml H2O 用 1mol/L NaOH 调 pH 至 3.7-5.6 补加 H2O 至 1L 于 4℃可保存 1 个月 酸性考马斯亮蓝 G-250 染色液 用水配制 0.2% (m/V) 考马斯亮蓝 G-250 Bio-Rad) ( 染色液。 加等体积的 1mol/L H2SO4。充分混匀后放置≥3h。用 Whatman 1 号滤纸过滤以去除颗粒状物质。重 新测量溶液体积,加入 1/9 体积的 10mol/L KOH。加 100%(m/V)三氯乙酸至终 浓度为 12%(m/V) 。考马斯亮蓝的终浓度约为 0.08%(m/V) 。保持溶液 pH1.0 一下可保存数月。 丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液,30%/0.8% 混合 30.0g 丙烯酰胺、0.8g 甲叉双丙烯酰胺,加水至终体积为 100ml。用 0.45μm 滤膜过滤。于密闭棕色玻璃瓶中 4℃可保存 1 个月. 若有氨味出现则废弃。 建议用 2×结晶级的丙烯酰胺和双丙烯酰胺 警告:丙烯酰胺单体是一种神经毒素。称量丙烯酰胺粉末时戴手套和口罩, 操作未聚合的丙烯酰胺时应小心。 5mg/ml 氨苄青霉素 500mg 氨苄青霉素溶于 100ml 水中, 0.22μm 滤器过滤除菌, 4℃可保存数月。 不要采用高压灭菌;氨苄青霉素在温度大于 50℃时即失活。 考马斯亮蓝 G-250 染色液 200ml 乙酸(终浓度为 10%) ,1800ml 水,0.5g 考马斯亮蓝 G-250(终浓度 为 0.025%) ,混合 1h,过滤(Whatman 1 号滤纸) ,室温可长期保存。 考马斯亮蓝 R-250 染色液 浓贮液:将 24g 考马斯亮蓝 R-250(Bio-Rad,Pierce 公司)和 600ml 甲醇混

合,加入 120ml 乙酸,搅拌 2h 以上,最好过夜。室温下可保存数月。 染色液:将 1L 甲醇和 60ml 浓贮液混合,加入 800ml 水,再加入 200ml 浓乙 酸。如果出现沉淀,用前用 Whatman 1 号滤纸过滤。室温可保存数月。 最终的染色液大约含 50%(V/V)甲醇、0.1%(m/V)考马斯亮蓝 R-250 和 10%(V/V)乙酸。 谷胱甘肽缓冲液 50mmol/L Tris 碱,10mmol/L 还原性谷胱甘肽(Sigma 公司) ,用 6mol/L HCl 调 pH 至 8.0,用冷 H2O 定容。每天新鲜配制,4℃保存,直到使用。 4×甘氨酸凝胶缓冲液 15.01g 甘氨酸(终浓度为 200mmol/L) ,加入 500ml 水,用 1mol/L NaOH 调 pH 至 8.6-10.6,加水至 1L,4℃可保存 1 个月。 100mmol/L IPTG 1g IPTG,42ml 灭菌水,在无菌管中分装,每份 6ml,-20℃可保存 1 年。 裂解缓冲液 50mmol/L NaCl, 50mmol/L Tris 碱, 5mmol/L EDTA, 1μg/ml 亮抑酶肽, 1μg/ml 胃蛋白酶抑制剂,0.15mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF) ,溶于异丙醇中,1mmol/L 二异丙基氟磷酸盐 (DFP) 用 6mol/L HCl 调 pH 至 8.0, , 用冷 H2O 加至最终体积, 每日新鲜配制。 警告: DFP 是一种神经毒物。 只有在化学通风橱中戴双层手套处理纯的 DFP。 严格遵守生产商给出的所有注意事项。 PBS/EDTA 1×PBS,5mmol/L EDTA,用 1mol/L NaOH 调节 pH 至 7.4,用冷水补至终体 积,4℃下可保存 1 个月。 PBS/EDTA/PMSF 缓冲液 1×PBS, 5mmol/L EDTA, 0.15mmol/L 苯甲基磺酰氟 (PMSF) 溶于异丙醇中, , 用 1mol/L NaOH 调节 pH 至 7.4,用冷水补至终体积,4℃可保存 1 周。 PBS/甘油缓冲液 1×PBS, (V/V) 20% 甘油, (V/V) 1% Triton X-100, 5mmol/L 2-巯基乙醇 (2-ME) , 5mmol/L EDTA,0.1μg/ml 亮抑酶肽(leupeptin) ,0.1μg/ml 胃蛋白酶抑制剂, 0.15mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF) ,溶于异丙醇中,0.1mmol/L 二乙丙基磺酰氟 (DFP) ,用 1mol/L NaOH 调节 pH 至 7.4,用冷水补至终体积,每日新鲜配制。 警告: DFP 是一种神经毒物。 只有在化学通风橱中戴双层手套处理纯的 DFP。 严格遵守生产商给出的所有注意事项。

4×磷酸盐凝胶缓冲液,pH5.8-8.0 55.2g NaH2PO4· 2O H (终浓度为 400mmol/L 磷酸钠) 加水至 500ml, 1mol/L , 用 NaOH 调节 pH 至 5.8-8.0,加水至 1L。4℃可保存 1 个月。 5×SDS 电泳缓冲液 15.1g Tris 碱,72.0g 甘氨酸,5.0gSDS,加水至 1000ml,稀释成合适的 1×或 2×工作液。 不用调节贮液的 pH, 因为当稀释后溶液的 pH 为 8.3.保存于 0-4℃直到使用 (可达 1 个月) 。 2×SDS 样品缓冲液 25ml 4×Tris· Cl/SDS,pH6.8,20ml 甘油,4g SDS,2ml 2-巯基乙醇或 3.1g 二硫 苏糖醇,1mg 溴酚蓝,加水至 100ml,混合,1ml 分装,保存于-70℃。 为避免蛋白质还原为亚基,缓冲液中可不加 2-巯基乙醇或二硫苏糖醇(还 原剂)而要防止二硫互换 , (disulfide interchange)可加入 10mmol/L 碘乙酰胺。 , 6×SDS 样品缓冲液 7ml 4×Tris· Cl/SDS,pH6.8,3.0ml 甘油,1g SDS,0.93g DTT,1.2mg 溴酚蓝, 加水至 10ml(如果必要) ,室温保存或 0.5ml 分装,保存于-70℃。 4×Tris·Cl/SDS,pH6.8 溶解 6.05g Tris 碱于 40ml 水中(终浓度为 0.5mol/L) 。用 1mol/L HCl 调节 pH 至 6.8。 加水至 100ml。 0.45μm 滤器过滤, 用 再加入 0.4g SDS(终浓度为 0.4%) 。 4℃可保存 1 个月。 Tris·Cl/SDS,pH8.45 溶解 182g Tris 碱于 300ml 水中(终浓度为 3.0mol/L) 。用 1mol/L HCl 调节 pH 至 8.45。 加水至 500ml。 0.45μm 滤器过滤, 用 再加入 1.5g SDS (终浓度为 0.3%) 。 4℃可保存 1 个月。 4×Tris1Cl/SDS,pH8.8 溶解 91g Tris 碱于 300ml 水中(终浓度为 1.5mol/L) 。用 1mol/L HCl 调节 pH 至 8.8。加水至 500ml。用 0.45μm 滤器过滤,再加入 2g SDS(终浓度为 0.4%) 。 4℃可保存 1 个月。 4×Tris 凝胶缓冲液,pH7.1-8.9 加 24.23g Tris 碱 (终浓度为 200mmol/L Tris· Cl)至 500ml 水中,用 1mol/L HCl 调 pH 至 7.1-8.9,加水至 1L。4℃可保存 1 个月。 2×Tris/甘油样品缓冲液

25ml 0.5mol/L Tris· pH6.8,20ml 甘油, Cl, 1mg 溴酚蓝, 加水至 100ml 并混合, 1ml 分装,-70℃可保存 6 个月。 Tris/甘氨酸电泳缓冲液 15.1g Tris 碱,72.0g 甘氨酸,加水至 5000ml,4℃可保存 1 个月。 U 缓冲液 5mol/L 尿素, 50mmol/L Tris 碱, 5mmol/L EDTA, 5mmol/L 2-巯基乙醇 (2-ME) , 1μg/ml 亮抑酶肽, 1μg/ml 胃蛋白酶抑制剂, 0.15mmol/L 苯甲基磺酰氟 含 (PMSF) 的异丙醇溶液, 1mmol/L 二异丙基氟磷酸盐 (DFP)用 6mol/L HCl 调节 pH 至 8.0。 , 冷水加至终体积,当天新鲜配制。 警告:DFP 具有神经毒性,必须在化学通风橱中戴双层手套处理纯 DFP。认 真遵守生产商给出的所有注意事项。 洗涤缓冲液 50mmol/L Tris 碱,5mmol/L EDTA,1μg/ml 亮抑酶肽,1μg/ml 胃蛋白酶抑制 剂,0.15mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)的异丙醇溶液,用 6mol/L HCl 调节 pH 至 8.0。加冷水至终体积。每日新鲜配制。


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