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RNA干涉


RNA 干涉(RNA interference,RNAi)是 1998 年由 Fire 等在线虫中发现的一种转录后的基因 沉默 (Posttranscriptional gene silencing, PTGS)机制。 双链 RNA(double-stranded RNA, dsRNA) 能特异地抑制或沉默目的基因表达,产生如同目的基因突变的缺陷表型,这种由 dsRNA 介 导的基因阻抑作用被称为 RNAi。1990 年,美国和荷兰的两个转基因植物实验组,在矮牵牛 中发现的一种转基因能同时抑制相应的内源基因以及自身表达的基因沉默现象, 当时将这种 现象称为共抑制。到 1994 年,由 Cogni 等在真菌中发现转录后的基因沉默现象,在野生型 粗糙链胞霉中转入胡萝卜素基因 albino 1 或 albino 3 时,发现在部分实验中,内源性 al 1 或 al 3 基因的表达水平反而减弱,称此现象为基因压制(quelling)。1998 年,Fire 等在线虫中发 现了 RNAi 现象,并揭示了 SuGuo 发现正义 RNA 对基因表达也有抑制作用的原因,认为 SuGuo 发现的这种现象是由于体外转录制备的 RNA 中污染了微量的双链 RNA, 而且 dsRNA 能比反义 RNA 或正义 RNA 更有效地抑制基因的表达,把由 RNA 引起的基因表达的抑制 称为 RNA 干涉。 最初普遍认为共抑制、基因压制以及 RNAi 是机制完全不同的基因抑制现象。但经过科 研人员的不断研究,发现在共抑制、真菌中的基因压制以及 RNAi 现象之间存在着密切的联 系。都是由 RNA 引起的转录后的基因沉默,可能有共同的生物学意义和相似的作用机制。 但是共抑制与 RNAi 并不是完全相同,在植物的共抑制中,dsRNA 不仅能引起转录后的基 因沉默,而且还能引起转录水平的沉默,其可能机制是 dsRNA 能引起染色质的重组或甲基 化而改变其内源基因的序列。 因此, 在植物共抑制中还存在 RNAi 以外的由 RNA 指导的 DNA 甲基化,而引起转录水平抑制的机制。dsRNA 能特异地抑制目的基因的表达,其广泛存在 各种有机体中,包括线虫、果蝇、涡虫、水螅、锥虫、真菌、植物以及哺乳动物。 1 RNAi 的特征 RNAi 是发生在转录后水平的基因沉默。 dsRNA 具有很高的特异性,能特异地将与其同源的 mRNA 降解。Andrew 在植物中用 3 种转基因诱导的转录后的基因沉默(PTGS)都检测到有约 25 nt(nucleotide)长的 siRNA(short interference RNA)。Shi Chenyang 等从已转染 dsRNA 的未分化的胚胎干细胞、卵母细胞以及 老鼠胚胎细胞的细胞质提取物中都发现有 21~23 nt 长的 siRNA。 这些 siRNA 可能具有指导 核酸酶特异地识别靶 mRNA 而将其降解的功能,21~23 nt 以下的片段还没有发现,由于这 些片段不稳定,易被胞内其他核酸酶降解。 极低浓度的 dsRNA 就能完全抑制基因的表达。 这可能由于 RNA 存在复制或由于 dsRNA 具有很强的催化功能。 dsRNA 抑制效应具有传递性。 Timmons 等用含目的基因表达 dsRNA 载体大肠杆菌喂养 线虫, RNA 从肠中吸收,但在体细胞及生殖细胞中都有分布表达。此外,RNAi 不仅发生 在亲代动物本身, 其子代伴随基因表达过程也产生了强烈而特异的抑制效应。 细胞的这种抑 制能力还能在细胞与细胞之间通过胞间连丝传递, 甚至可以通过植物的维管组织在整个植物 体中传递。Jorgenese 等将有共抑制现象的植物作为砧木,没有抑制现象的植物作为接穗, 一段时间以后在接穗中产生了共抑制现象。 说明有某种信号分子通过植物的维管系统进行传 递,由于这种系统获得的沉默具有序列特异性的特点,这种信号分子可能是一种 RNA 与蛋 白质的复合体。

dsRNA 模板有选择性。对不同目的基因结构序列而合成的 dsRNA 所产生的抑制效应存 在显著差异。Fire 等发现,基因外显子编码区的 dsRNA 能够产生特异和高效的抑制作用, 而人对应于内含子和启动子序列的 dsRNA 不能发生可检测的抑制效应。 2 RNAi 的作用机制 2.1 RNAi 作用的自我扩增机制 Nellen 等报道,RNA 的作用机制可能类似于反义 RNA 抑制,以双链中的反义 RNA 链 与同源 mRNA 通过碱基互补结合,从而抑制其翻译或触发降解机制导致其丰度下降,但这 无法解释微量的双链 RNA 就能阻断基因的表达,并且这种效应可以传递到子代细胞中的现 象。研究者们推测细胞内可能存在 RNAi 效应的扩增系统。 Wassenegger 等发现在植物的共抑制现象中,以 RNA 为模板指导 RNA 合成的聚合酶 (RNA-direceted RNA polymerase, RdRP)参与了以病毒为模板的 RNA 合成。 Smardon 等发现, EHO-1 缺陷型线虫中 dsRNA 对同源基因表达的抑制作用显著下降,认为在真核细胞中也存 在 RdRP。在 RdRP 的作用下,进入细胞内的双链 RNA 通过类似于 PCR 的反应过程,呈指 数级的数量扩增。 2.2 dsRNA 介导的 mRNA 降解机制 研究者猜测,在 RNAi 作用中 dsRNA 首先被切割成 20~23 bp 的小片段,随后这些小 片段通过碱基互补直接或间接介导了同源 mRNA 的降解。 随后, Elbashir 等通过一系列哺乳 动物细胞系的体外实验表明,RNAi 反应中,加入的 dsRNA 被切割为 21~23 核苷酸长的 RNA 片段。后者会使同源 mRNA 被切割为 21~23 核苷酸长的片段,而非同源 mRNAi 不被 切割,进一步证实了上述观点。在 RNAi 作用中,可能存在一种核酸酶使 dsRNA 被切割成 双链小片段。Hammond 等从已经发生 RNAi 作用的果蝇 S2 细胞中部分纯化了一种核酸酶, 该核酸酶具有序列特异性,它仅降解与引起 RNAi 的 dsRNA 具有同源序列的 mRNA,把此 酶命名为 Dicer 酶。Hammond 等在纯化该核酸酶时,共分离出 21~23 核苷酸长的 dsRNA 片段,该核酸酶对 mRNA 的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的。根据 Hammond 的实验结果, 研究者提出一种 RNAi 作用的简单模型。 dsRNA 导入细胞后, 当 被一种 dsRNA 特异的核酸内切酶识别, 切割成 21~23 核苷酸长的小片段, 这些片段可与该核酸酶的 dsRNA 结合结构域结合,并且作为模板识别目的 mRNA,识别之后,mRNA 与 dsRNA 的有义链发 生链互换, dsRNA 中的有义链被 mRNA 代替, 原 从酶-dsRNA 复合物中释放出来, mRNA 而 则处于原有义链的位置。核酸酶在同样位置对 mRNA 切割,产生了 21~23 核苷酸长的 dsRNA 小片段,与核酸酶形成复合物,继续对目的 mRNA 进行切割,使目的基因沉默,从 而产生 RNAi 现象。Dicer 酶是 RNA 酶Ⅲ家族的一个成员,RNA 酶Ⅲ家族是一种能切割双 链 RNA 的酶。 Dicer 酶在进化过程中十分保守,在蠕虫、果蝇、真菌、植物及哺乳动物体 内都找到了同源基因,它的结构中包括一个螺旋酶结构域,两个 RNA 酶Ⅲ结构域,一个双 链 RNA 结合位点。 2.3 RNAi 的可能反应机制

双链 RNA 一方面在 Dicer 酶的作用下被裂解成 21~23 核苷酸长的 dsRNA 小片段,这 些小片段被称为 siRNA, 另一方面在 RdRP 的作用下自身扩增后, 再被 Dicer 酶裂解成 siRNA。 siRNA 的双链解开变成单链, 并和某些蛋白形成复合物, Argonaute2 是目前唯一已知的参与 复合物形成的蛋白。此复合物同与 siRNA 互补的 mRNA 结合,一方面使 mRNA 被 RNA 酶 裂解,另一方面以 siRNA 作为引物,以 mRNA 为模板,在 RdRP 作用下合成 mRNA 的互 补链。结果 mRNA 也变成了双链 RNA,它在 Dicer 酶的作用下也被裂解成 siRNA。新生成 的 siRNA 也具有诱发 RNAi 的作用,通过聚合酶链式反应,细胞内的 siRNA 增加,显著增 加了对基因表达的抑制。从 21~23 个核苷酸的 siRNA 到几百个核苷酸的双链 RNA 都能诱 发 RNAi,但长的双链 RNA 阻断基因表达的效果明显强于短的双链 RNA。 3 RNAi 的应用 目前基因干涉主要有干涉基因 DNA 和干涉基因 mRNA 两种方法。干涉靶基因 DNA 的 方法主要有:①基因敲除细胞分裂时,靶载体与目标基因通过同源重组发生连锁互换,从而 破坏目的基因,可进行时空特定性基因敲除;②用合成的寡核苷酸与双链 DNA 杂交,形成 三链 DNA,可能通过防止双链 DNA 解链或抑制转录因子与基因结合,阻止靶基因转录并 启动基因修复程序; ③采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子与靶基因结合, 抑制靶基 因转录,但应用此技术时前必须明确转录因子。干涉靶基因 mRNA 的方式主要有 3 种:① 利用反义 RNA 技术阻遏翻译过程,破坏内源性 mRNA;②设计寡核苷酸来破坏与 mRNA 结合的蛋白质,使 mRNA 不稳定;③双链 RNA 干涉技术。

从应用的角度考虑,RNAi 是一种非常有用的基因敲除(geneknockout)方法,用基因打靶 来敲除基因的方法费时费力,RNAi 是快速、高效、便于操作的使靶基因失活的技术,它能 非常有效地鉴定特定基因的功能。 随着各种模式生物体基因组计划的完成, 生物学家可以非 常方便地从大规模数据库中获得全基因组序列, 从而找到感兴趣基因的序列, 据此设计出使 该基因沉默的 dsRNA,这是研究疾病机理和鉴定候选药靶的关键步骤,也为将来可控地打 开或关闭某一特定基因奠定基础,为疾病的治疗开辟了新途径。RNA 干涉理论上能减少病 毒感染所需的蛋白质, 从而达到减少病毒数量的目的; 也可以用来减少某些遗传疾病不正常 基因的蛋白质制造量,以治疗该疾病。 2002 年 RNA 干涉研究取得了新进展,科学家研究了酵母和四膜虫两种生物体的 RNAi 现象,发现 RNAi 对染色体的形状有极大的控制作用。RNAi 能永久性关闭或删除一部分 DNA,而不只是简单地使 DNA 暂时沉默。冷泉港实验室的研究人员发现,缺失平常的小 RNA 的裂殖酵母细胞不能在中心粒正确形成异染色质,从而破坏了正常的细胞分裂。弗吉 尼亚大学和罗切斯特大学的研究人员也发现,RNAi 能引发四膜虫细胞分裂期间的 DNA 缺 失或序列重组。目前科学家试图确定成百种 RNAi 各自的功能,确定哪些物种中含有哪些 RNAi 以及它们在该物种中的作用。 RNAi 方法在植物遗传及发育等研究领域得到广泛的应用。拟南芥是植物遗传和发育研 究领域很重要的模式生物,Cioppa 等用烟草的 mosaic 病毒导入了几千种不同的遗传序列, 系统地进行基因敲除来筛选有用的性状,如抗病或耐旱。Gutterson 等敲除了康乃馨的一种 激素,使花期延长。多聚半乳糖醛激酶在西红柿成熟时消化细胞壁,Zenera 实验室将它敲除 后,西红柿可晚一些采摘,味道变得更为鲜美。

RNAi 是研究信号转导通路的新方法,Clemens 等应用 RNAi 亦研究了果蝇细胞系中胰 岛素的信号转导通路,在整个实验中发现 RNAi 技术比传统的转染实验简单、快速、重复性 好,克服了转染实验中重组蛋白非特异性聚集和转染效率不高的缺点,RNAi 技术将成为细 胞信号转导通路研究的重要方法。 RNAi 的出现重新唤起了科学家对“RNA 世界”的重视和对 “生命起源于 RNA 分子”这一命题的兴趣。有的科学家认为成千上万非编码蛋白质的 RNA 分子组成了巨大的网络, 调节着细胞中的生命活动, 它们与蛋白质一蛋白质相互作用网络相 对应,将为基因组和生命科学研究提供广阔的前景。 文章来源:东北农业大学学报,2005 年第 36 卷第 3 期


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