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RNA干扰的研究进展


【摘 要】rna 干扰( rnai) 是指内源产生或人为转染进入细胞的小干扰双股 rna 在细胞内特 异性地诱导同源互补的 mrna 降解, 从而阻断相应基因表达的现象。rnai 在生物界中广泛存 在, 其发生过程主要分为 3 个阶段:起始阶段、效应阶段和扩增阶段。它在抵御病毒感染、 维持基因组稳定、 基因表达调控等方面发挥重要生物学作用。 随着人们对 rnai 研究的不断深 入,rnai 技术作为基因沉默的一个工具,已被广泛用于基因功能研究、疾病的靶点治疗等方 面的研究。 【关键词】rnai;基因沉默;sirna;基因治疗 【中图分类号】r394 【文献标识码】a 【文章编号】1008-6455(2012)02-0031-02 rna 干扰(rna interference, rnai)是近年来新发现的一种重要的基因表达调控方式, 它是由内源产生或人为转染进入细胞的小干扰双股 rna(small interfering double strand rna, sirna)诱导产生的一种转录后基因沉默(post2transcrip tional gene silencing, ptgs) 现象。它是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制,广泛存在于生物界, 从低等原核生物,到植物、真菌、无脊椎动物,甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象, 由于使用 rnai 技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达, 所以被广泛用于探索基因功能和 传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗等领域。 1 rnai 的发现 1990 年,jorgensen 等[1]将产生色素的基因导入矮牵牛中,试图加深花朵的颜色,结果 很多花没有变成深紫色,反而成了花斑的甚至白的。表明不仅导入的基因未表达,而且本身 同源的基因失活。从而发现在转基因植物中存在基因表达的共抑制现象,即转入的外源基因 和本身的同源基因都被抑制,出现基因沉默现象。后来发现在其它许多植物中也有类似的现 象。首次发现 dsrna 能够导致基因沉默的线索来源于线虫的研究。1995 年康乃尔大学的 guo 和 kem-phues 发现正义 rna 与反义 rna 一样能够阻断 par-1 基因的表达。 1998 年 fire 等[2] 证实, 将制备的 rna 高度纯化后发现, 单链 rna 的基因抑制作用很微弱, 而用纯化后的 dsrna 却能高效、特异地阻断相应基因的表达。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链 rna 已经 足够完全阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫中注入双链 rna 不但可以阻断整个线 虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默,他们将这种现象称为 rnai。在 随后的几年中, 研究者们发现 rnai 现象广泛的存在于真菌、水螅和斑马鱼等真核生物中。 哺乳动物的 rna 干扰机制与低等生物并不完全一致[3]。在哺乳动物细胞中,将 dsrna 转入哺乳动物体细胞内通常会激活双股 rna 依赖的蛋白激酶和 rna 酶 l 通路,结果导致被转 染的细胞发生了非特异的蛋白质合成障碍并且诱导凋亡。最近研究表明,只要 dsrna 短于 30bp, 就以避免由较长的 dsrnas 所带来的问题, 表明 sirna 可以在哺乳动物细胞中有效地诱 发 rnai[4]。 2 rnai 的作用机制 近年的研究表明,虽然开始时细胞制造非常长的 dsrnas,但其最终被分解为 21-25 bp 长度的片段,形成 sirna 后才真正诱导了 rnai[5]。sirna 两条单链末端为 5′端磷酸和 3′ 端羟基,此外,每条单链的 3′端均有 2-3 个突出的非配对的碱基,可介导识别并靶向切割 同源性靶 mrna 分子。 细胞中 dsrna 的形成是 rnai 的第一步,有数种合成方式可以产生 dsrna, 其中通过转录相反的重复区合成发卡型 mrnas, 或通过启动子分别合成互补的正义和反义股, 然后退火形成 sirnas 是最为经典的方式。 2.1 rnai 的作用过程 现在已初步阐明 rnai 的作用机制,具体作用机制如下:(1)起始阶段,主要是 sirna 的 形成: 在细胞质中内源或是外源的 dsrna(直链的或是发卡状的)与 dicer 酶结合从而将 dsrna

切割形成长度为 20-30 bp 的 sirna 片段,这个过程需要 atp 的参与。 (2)效应阶段,主要是 沉默复合物(risc)的形成:sirna 与 argonaute 蛋白结合 rna 诱导的沉默复合物 risc,risc 的激活需要 atp 的参与。在 sirna 反义链的指导下,激活的 risc 与目的 mrna 结合并对目的 mrna 进行切割。试验发现目的 mrna 上的切割点位于与 sirna 中反义链互补的第一个核苷酸 下游 1l 或 12 个核苷酸处。另外具有平齐末端的 sirna 更能有效地引起 rnai 作用。 (3)扩增 扩散阶段,即倍增放大机制:大量试验表明只需要极少量的 sirna 就可以引发 rnai 现象,因 此推测在整个过程中存在倍增放大机制。rdrp 是一种依赖于 rna 的 rna 聚合酶。在这个过程 中它发挥了重要作用,但是目前仅在一些线虫、真菌和植物中发现了它的存在.因此它并不 是真核生物中发生 rnai 所必须的。不管是内源还是外源的 sirna 都可以作为 rdrp 扩增的引 物,目的 rna 可以作为模板,在细胞内扩增 dsrna,由此产生的 dsrna 再次被 dicer 作用形 成 sirna,进入下一轮循环,以此来使 rnai 作用放大。 2.2 rnai 的必需基因 3.1 rnai 抑制转座子活性 ketting 等[9]发现蠕虫 mut-7 基因参与 rnai 并且与转座子的转座抑制有关[8]; 而在果 蝇中, 参与 rnai 的 rna 解螺旋酶 spindle-e 的突变将导致该基因引起的基因沉默的缺失。 同 时提高了反转录转座子活性。由此可见,rnai 参与转座子转座的抑制。 3.2 rnai 抵御病毒感染 rnai 在生物体抵御外来病毒的入侵方面有着重要的作用, 可能是其最原始的生物功能之 一。在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现,sgs2/sdel 基因突变的拟南芥对病毒的侵 染表现出高度的敏感性[7]。 而且在被病毒感染的植物细胞中, 病毒通过自身进化的基因阻碍 rnai 的产生。novina 等[11]合成分别针对 hiv-1 细胞受体 cd4、病毒结构蛋白 cag 基因的 sirnas, 发现 sirnas 能够有效抑制 hiv-1 进入细胞、 hiv-1 生活周期的整合前和整合后感染。 3.3 rnai 参与异染色质的形成和遗传 hall 等[12]研究表明,着丝粒同源重复序列和 rnai 组分一起正负调节着异染色质的形 成并共同促使异染色质组装成核。 mikel 等[13]异染色质的遗传需要通过 rna 干扰(rnai),它 引导细胞周期中 dna 复制时组蛋白的改变,他们发现复制起源的交换重排和着丝粒周围的沉 默 rna 导致酵母菌 schizosaccharomyces pombe 转录和复制之间的竞争,rnai 释放 rna 聚合 酶 ii(poli), 允许通过主导链 dna 聚合酶和打开带有复制叉的异染色质的相关组蛋白修饰酶 来完成 dna 复制,如果缺乏 rnai,停滞的复制叉通过同源重组而不是组蛋白修饰进行校正。 3.4 rnai 在干细胞增殖分化中的作用 4 rnai 的应用 4.1 基因敲除 rnai 能使在体外培养的细胞达到基因敲除的效果 , 对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会 死亡的基因, 可以在体外培养的细胞中利用 rnai 技术研究它的功能。如 van brocklyn[16] 等应用 rna 干扰技术敲低神经鞘氨醇激酶( sphk1)表达, 显著减少恶性胶质瘤细胞系的增殖 率;而且, 在敲低 sphk2 表达时更能抑制恶性胶质瘤细胞系的增殖。 4.2 基因功能的研究 借助 rnai 技术可以迅速简便的干扰细胞中某个基因的表达, 分析该基因缺失后对细胞产 生的影响, 从而研究目标基因的功能。 有研究报道, 设计 laminbl、 laminb2、 nupl53、 gas41、 arc21、cdkl 等目的基因的 sirna,并在体外合成后将这些 sirna 直接注入大鼠成纤维细胞、 hela 细胞和 3t3 细胞中成功抑制了目的基因的表达,从而研究部分基因的功能[17]。 2005 年人类基因组计划完成的基因图谱中人类大多数基因的功能还不清楚。而 rnai 这 种反向遗传学方法显示了在这方面的极大优势。chia 等[18]用一个整基因组 rnai 筛选来鉴 别 hescs 中调整自我更新和多能特性的基因,筛选出了 hescs 中具有多能性调节中功能的转

录子 prdm14。fraster 等[19]利用 rnai 技术分析了线虫 i 号染色体上 80%以上的基因,并 且发现了 1 772 个基因的 rnai 表型。将 sirna 注射到线虫胚胎后,筛选了ⅲ号染色体上大约 90%的基因,确定了其中 133 个基因是必须的,并分析了这些基因的功能。这两个试验为利 用 rnai 研究哺乳动物全基因功能的研究奠定了坚实的基础。 4.3 基因治疗 rnai 可以特异性的抑制基因表达,所以可用于基因病、病毒感染、癌症的治疗。作为基 因治疗的工具, rnai 既高效特异, 又简便易行。 近来人们把 sirna 技术引入到 c-myc 功能的 研究中, 通过体外合成的 c-myc-sirna 抑制急性淋巴细胞白血病 jurkat 细胞的 c-myc 表达活 性, 成功抑制了 jurkat 细胞的增殖[20]。 zuber 等[20]利用通过筛选靶向急性骨髓性白血病 (aml)小鼠模型染色质调节子的 shrnas 文库,鉴别出了 brd4 蛋白是 aml 的关键因子,进一 步使用 shrnas 沉默 brd4,无论是体内还是体外实验都表现出了明显的抗病性。为此, 可以 预测 rnai 技术在不久的将来用于某种基因突变或过度表达所引起的疾病的基因治疗具有广 阔和光明的前景。 5 rnai 的展望 人们对 rnai 的研究只有短短的几年时间,但进展却极为迅速。可以认为 rnai 是一个以 小分子 rna 为中心的真核细胞基因表达调控系统,它可以在多个层面调节基因表达和细胞的 增殖分化, 通过对 rnai 的研究将会使人们对生命现象的认识更加深入。 在今后的研究中, rnai 技术不仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学) 的发展,还有可能设计出 rnai 芯片,高 通量地筛选药物靶基因,逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能,并且它还 将应用于基因治疗、 新药开发、 生物医学研究等领域, 用 rnai 技术来抑制基因的异常表达, 为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。


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