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微生物工程期末复习习题及全部答案


绪论 1680年列文虎克制成显微镜 ─── 证明了微生物的存在。 1857年,巴斯德(Louis Pasteur)微生物之父证明了酒精是由活的酵母发酵引起的。并提出了著名的发酵理 论:一切发酵过程都是微生物作用的结果。 1897 年德国化学家毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精 ─── 酶 1905年,柯赫建立微生物纯培养技术,为微生物学的发展奠定了基础。科赫的固体培养基也是微生物学研究 史上的一大突破。 第一章生产菌种的筛选 1、工业化菌种的要求有哪些? ①遗传性能要相对稳定,不易变异退化;②能够利用廉价的原料,简单的培养基,大量高效地合成产物; ③抗病毒能力强,不易感染它种微生物或噬菌体;④产生菌及其产物的毒性必须考虑(在分类学上最好与致病菌 无关,不产生任何有害的生物活性物质和毒素,包括抗生素、激素和毒素等,保证安全); ⑤有关合成产物的途径尽可能地简单,或者说菌种改造的可操作性要强;⑥生产特性要符合工艺要求(如生长速 度和反应速度较快,发酵周期短等)。⑦培养和发酵条件温和(糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等) 2.在工业生产中常用的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌 3、自然界分离微生物的一般操作步骤?从环境中分离目的微生物时,为何一定要进行富集培养? 样品的采集-预处理—培养—培养—菌落的选择—出筛—复筛—性能的鉴定—菌种保藏 富集培养的原因:自然界中目的微生物含量很少,非目的微生物种类繁多,进行富集培养,使目的微生物在最适 的环境下迅速地生长繁殖,数量增加,由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种,使筛选变得可能。 4.每克土壤的含菌量大体上有一个十倍系列的递减规律: 细菌(~108)>放线菌 (~107)>霉菌(~106)>酵母菌(~105)>藻类(~104)>原生动物(~103) 第二章 微生物的代谢调节和控制 1、酶活性调节的反馈抑制类型和抑制机制。 反馈抑制——主要表现在某代谢途径的末端产物过量时可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性, 促使整个反 应过程减慢或停止,从而避免了末端产物的过多累积。 主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。 特点:作用直接、效果快速、末端产物浓度降低时又可解除

同功酶的主要功能在于其代谢调节。 在一个分支代谢途径中, 如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功

酶所催化时,则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用 协同反馈抑制: 指分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节 方式。 ③ 增效反馈抑制: 系指两种末端产物同时存在时,可以起着比一种末端产物大得多的反馈抑制作用。 累积反馈抑制: 每一分支途径的末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中前面的酶,所以当几种末端产物 共同存在时,它们的抑制作用是累积的。 ⑤ 顺序反馈抑制:当 E 过多时,可抑制 C→D,这时由于 C 的浓度过大而促使反应向 F、G 方向进行,结果又 造成了另一末端产物 G 浓度的增高。由于 G 过多就抑制了 C→F,结果造成 C 的浓度进一步增高。C 过多又对 A→ B 间的酶发生抑制,从而达到了反馈抑制的效果。这种通过逐步有顺序的方式达到的调节,称为顺序反馈抑制 联合激活或抑制调节一种中间产物参与 2 个独立的代谢过程, 其浓度影响 2 个代谢, 存在激活抑制的联合调节。

2、大肠杆菌的乳糖操纵子模型中包含几部分? 结构基因、启动基因、操纵基因、调节基因 3、微生物细胞初级代谢的调节有哪两种类型?

4、次级代谢产物、初级代谢产物 初级代谢产物是指微生物通过代谢活动产生的,生长和繁殖所必需的物质,如蛋白质、核酸等。 次级代谢产物是指微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能,或并非 是微生物生长和繁殖所必需的物质。 5、酶的诱导和阻遏 诱导(induction):是酶促分解底物或产物诱使微生物细胞合成分解代谢途径中有关酶的过程。 根据酶的生成与环境中是否存在酶的底物或其有关物,可把酶划分成组成酶和诱导酶两类。 组成酶:不依赖酶底物而合成的酶,如:EMP途径的一些酶。微生物细胞内一直存在,合成是受遗传物质控制。

诱导酶: 是细胞为适应外来底物或其结构类似物通过诱导作用而临时合成的一类酶。 如E.coli在含乳糖的培养基 中合成β-半乳糖苷酶和半乳糖苷渗透酶 能促进诱导酶产生的物质称为诱导物, 它可以是该酶的底物, 也可以是难以代谢的底物类似物或是底物的前体物 质。 酶的诱导合成类型 同时诱导: 即当诱导物加入后, 微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成, 它主要存在于短的代谢途径中。 例如,将乳糖加入到 E.coli 培养基中后,即可同时诱导出β-半乳糖苷透性酶、β-半乳糖苷酶和半乳糖苷 转乙酰酶的合成; 顺序诱导:即先合成能分解底物的酶,再依次合成分解各中间代谢物的酶,以达到对较复杂代谢途径的分段 调节。 (二)酶合成的阻遏 阻遏(repression) :在微生物的代谢过程中,当代谢途径中某末端产物过量时,除可用前述的反馈抑制的 方式来抑制该途径中关键酶的活性以减少末端产物的生成外,还可通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关键 酶在内的一系列酶的生物合成,从而更彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。 阻遏作用有利于生物体节省有限的养料和能量。 阻遏的两种类型: 1、末端产物阻遏 末端产物阻遏(end-product repression)指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起的阻遏。 对直线式反应途径来说,末端产物阻遏的情况较为简单,即产物作用于代谢途径中的各种酶,使之合成受阻 遏,例如过量的精氨酸阻遏了参与合成精氨酸的许多酶的合成。 2、分解代谢物阻遏 分解代谢物阻遏(catabolite repression) :指细胞内同时有两种分解底物(碳源或氮源)存在时,利用快 的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。最早发现于大肠杆菌生长在含葡萄糖和乳糖的培 养基时, 葡萄糖分解代谢物阻遏乳糖分解酶而出现“二次生长(diauxic growth)。 ” 分解代谢物的阻遏作用,并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果,而是通过甲碳源(或氮源等)在 其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。 因此, 分解代谢物的阻遏作用, 就是指代谢反应链中, 某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏代谢途径中一些酶合成的现象。

第三章 优良菌种的选育
1、经常用于菌种的初筛的方法有哪些?各有什么特点?菌种选育中常用的三种培养基 ①初筛常用的方法:平皿快速检测法 a.是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应,将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态” 变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等。 b.这些方法简单,快速,可大大提高筛选的效率。但缺点是较粗放,一般只能定性或半定量用;而且由于培 养平皿上的条件与摇瓶培养,尤其是发酵罐深层液体培养的条件差别很大,有时会造成两者结果不一致。 c.平皿快速检测法操作时应注意将培养的菌体充分分散, 以形成单菌落, 避免多菌株混杂一起, 引起“形态” 大小测定的偏差。 ? 1) 纸片培养显色法:将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中,将待筛选的菌悬液稀 释后接种到滤纸上,保温培养形成分散的单菌落,菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈 与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产 生颜色的化合物。 ? 2)变色圈法:将指示剂直接掺入固体培养基中,进行待筛选菌悬液的单菌落培养,或将指示剂喷洒在已 培养成分散单菌落的固体培养基表面,在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产 淀粉酶菌株的菌悬液,使其呈单菌落,然后喷上稀碘液,发生显色反应。变色圈越大,说明菌落产酶的 能力越强。 ? 3) 透明圈法:在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分,造成浑浊、不透明的培养基 背景。接种后待筛选的菌落周围会形成透明圈,透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。

?

在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或 CaCO 可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大 3

小。 ? 4) 生长圈法:利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌, 若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下, 能合成该营养物,或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物,那么,在这些菌的周围就会有工具菌生 长,形成环绕菌落生长的生长圈。 ? 该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。 ? 5)抑制圈法: ? 待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质,或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具 菌有毒的物质,从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。 菌种选育中常用的三种培养基: 1)基本培养基(MM):仅能满足某微生物的野生型或原养型菌株生长需要的最低成分组合培养基。不同微生 物的基本培养基成分差别比较大。 [-] 2)完全培养基(CM):可满足某种微生物一切营养缺陷型菌株营养需要的培养基。通过将富含各种氨基酸、 维生素、碱基的天然物质(如牛肉膏、蛋白胨、麦芽汁)加入基本培养基中制成。 [+] 3)补充培养基(SM):只能满足某种微生物的一种或几种营养缺陷型及野生型菌株生长需要的培养基。一般 由基本培养基加入相应营养成分构成。 2、最为常用的物理诱变剂是什么?紫外诱变的有效波长范围及注意事项? 物理诱变剂:射线如紫外线、X—射线、γ—射线,快中子; ? 紫外线诱变一般采用 15W 紫外线杀菌灯,波长为 253.7nm.灯与处理物的距离为 15~30cm,照射时间依 菌种而异, 一般为几秒至几十分钟。 一般我们常以细胞的死亡率表示, 希望照射的剂量死亡率控制在 70~ 80%为宜。 ? 6 6 7 被照射的菌悬液细胞数,细菌为 10 个/ml 左右,霉菌孢子和酵母细胞为 10 ~10 个/ml。由于紫外

线穿透力不强,要求照射液不要太深,约 0.5~1.0cm 厚,同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌,使照射 均匀。 ? 由于紫外线照射后有光复活效应,所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。 3、诱变育种?回复突变? 诱变育种:利用各种诱变剂(能够提高生物体突变频率的物质,如物理因素和化学试剂)处理微生物细胞,提高 基因突变效率,再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。 回复突变:高产菌株在传代的过程中,由于自然突变导致高产性状的丢失,生产性能下降的现象。 4、自然选育的特点? 优点:简单易行,自然选育虽然突变率很低,但却是工厂保证稳产高产的重要措施。 缺点:效率低,进展慢,不能满足育种工作要求;发生负向突变,表现为菌株的衰退和生产质量的下降的几率更 高。 5、选育发酵高产菌种的方法包括基因突变育种 和 基因重组育种 ,其中后者包括基因工程育种、杂交育种、和 原生质体融合育种。 第四章 菌种的保藏及种子的扩大培养 1、各种菌种保藏方法的保藏原理、适用范围和时间长短。 ①定期移植法:将斜面培养、液体培养或穿刺培养好的菌种,置于 4-6℃冰箱保存,定期移植到新的培养基上生 长后继续保藏。 一般保存期 3-6 个月。保存的温度和时间各菌种不一 ②隔绝空气法 该法是定期移植法的辅助方法。用 170℃下灭菌 1-2h 的液体石蜡封住半固体穿刺培养物,在 4-5℃冰箱中保藏, 保存期 6-12 个月。

适用于各种好气性、且不能以石蜡为碳源的菌种,如固氮菌、分枝杆菌、沙门氏菌、毛霉、根霉等。特别对难于 冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。 原理:利用低温、缺氧抑制微生物代谢,推迟细胞老化,防止培养基水分蒸发,从而延长微生物的寿命。 ③沙管保藏法、土壤保藏法 原理:利用干燥、低温、隔氧、无营养物的条件保藏菌种。土壤是自然界微生物的共同活动场所,土壤 颗粒对微生物具有一定的保护作用。 保藏期:4-5 ℃冰箱保藏,也可常温下保存,时间可达数年,甚至数十年。 特点:保藏的效果较好,制作也简单,比液体石蜡法保藏时间长。 适用菌种:产孢子的丝状真菌和放线菌以及产芽孢的细菌。 方法:取河沙过 24 目筛,用 10~20%的盐酸浸泡除去有机质,洗涤,烘干,分装入安瓿管,加塞灭菌。 需要保藏的菌株先用斜面培养基培养,再用无菌水制成细胞或孢子悬液,将 10 滴悬液注入装有洗净、灭 菌河沙的沙管内,使细胞或孢子吸附在沙上,放到干燥器中吸干沙中的水分,将干燥后的沙管用火焰熔 封管口。可以室温或低温保藏。 土壤法以土壤代替河沙,不需酸洗,经风干、粉碎、过 24 目筛,分装灭菌后,同上制备。以上两种方法 统称为沙土管法。 ④蒸馏水悬浮法 这是最简单的保藏方法。每个试管中装 5 毫升灭菌的无菌水,用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细 胞,接入蒸馏水中并使之悬浮,试管用无菌的橡皮塞塞紧,放置 10℃低温保藏。需用时,可从管内移出 一环接到培养基上,而原来的管加塞后仍可继续保藏。该法为菌种创造了一个无营养的环境,也是一种 保藏菌种的好方法,保藏期为 1 年以上。 根瘤病土壤杆菌 Agrobacterium ( 适用菌种: 该法适宜保藏诡谲棒状杆菌 Cornebacterium insidiosum)、 ( tumefaciens)、假单孢菌(Pseudomonas sp.)等。也有人将其用于酵母、丝状真菌、及肠道细菌的保藏。 ⑤ 麸皮保藏法 麸皮保藏法(或称曲法保藏)常用于放线菌和霉菌的保藏。我国制曲已有悠久历史,曲既是酿造的酶制 剂,又是保藏酿造用微生物的一种方式。 将麸皮(也可用各种谷物代替)与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀,加水或培养液与麸皮的比例 为 1:0.8 或 1:1 或 1:1.5,原则是按照不同菌种对水分要求不同而定。将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿 管等容器中,装入的麸皮应保持疏松,不要紧压。高温灭菌后,将菌种接入在适宜温度下培养,直至形 成孢子。再放在干燥器中干燥后,20℃以下温度保藏。也可将小管用火焰熔封,保存期可达 1-3 年。 该法操作简单,菌种保藏时间长,不易退化。工厂中经常采用。 6.真空冷冻干燥法 利用低温、干燥和隔绝空气等几个保藏菌种的重要方法的综合作用。该法是将菌液在冻结状态下升华其 中水分,最后获得干燥的菌体样品。它同时具备干燥、低温和缺氧的菌种保藏条件,所以,可使微生物 菌种得到较长时间的保存。冻干的菌种密封在较小的安瓿管中,避免了保藏期间的污染,也便于大量保 藏。它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法。 但是,该法操作相对繁琐,技术要求较高。根据文献记载,除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此 法外,其它多数微生物,如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等都能冻干保藏。许多菌种用此法 可保藏 10 年以上。

具体步骤: ① 预先将安瓿管用 2%盐酸浸泡,洗净、烘干后,加入菌种编号标签纸条,加棉塞,湿热灭菌后烘干。微生 物斜面培养至稳定期(最好形成孢子) ,加入保护剂制成细胞悬液。液体培养的菌体最好用离心法除去培养 基后加保护剂制成细胞悬液。 在冷冻干燥脱水的过程中,保护剂起到稳定细胞膜的作用,即能推迟或逆转膜成分的变性,同时,又可 以使细胞免于冰晶损伤而死亡。保护剂还在菌种保藏和复苏过程中起稳定细胞的作用。保护剂一般为脱 脂牛奶或马血清等。 8 10 ② 悬液的细胞浓度以 10 ~10 个/ml 为宜。将 2~3ml 保护剂加入斜面内,用接种针轻刮菌苔,注意不 使悬液中带入培养基,也不能有过多的气泡。随即将悬液分装安瓿管。 为避免保护剂或带入的培养基中某些成分或产物的影响,在 1 小时内必须将分装好的安瓿管放到 -25~-40℃的低温冰箱或冻干装置中预冻。 预冻的目的是使水分在真空干燥时直接由冰晶升华为水蒸汽。预冻一定要彻底,否则,干燥过程中一部 分冰会融化而产生泡沫或氧化等副作用,或使干燥后不能形成易溶的多孔状菌块,而变成不易溶解的干 膜状菌体。预冻的温度和时间很重要。 预冻温度一般应在-30℃以下。在 0~?10℃范围内冻结,所形成的冰晶颗粒较大,易造成细胞损伤。-30℃ 下冻结,冰晶颗粒细小,对细胞损伤小。 ③ 待结冰坚硬后(约需 0.5~1 小时) ,可开始真空干燥。要求真空度在 15 分钟内达到 0.5mmHg,并逐渐 达到 0.2~0.1mmHg 。在 0.2mmHg 真空度后水分大量升华,此时也可以略加温,以加快样品中水分升华, 但需注意不能超过 30℃。 抽真空过程中样品应始终保持冷冻状态。当样品基本干燥后,样品温度上升,加速了样品残留水分的蒸 发。少量样品经 4 小时左右便可以干燥。当真空度达到 0.01mmHg 时继续抽几分钟后,一边抽气,一边即 可用喷灯熔封安碚管口。然后以高频电火花检查各安瓿的真空情况,管内呈灰蓝色光表示已达真空。检 查时电火花应射向安瓿的上半部,切勿直射样品。制成的安瓿管可在 4℃冰箱或室温下保藏。 ⑦液氮超低温保藏法

这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法,而其它方法又不能长期保藏,根据液氮保存精子和血液等的 启发而发展起来的菌种保藏法。 几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏。只有少量对低温损伤敏感的微生物例外。液氮 保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏,不论孢子或菌体、液体培养物或固体培养 物均可使用该法。 液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一,也是适用范围最广的微生物保藏 法。但缺点是保藏费用高,仅用于保存经济价值高、容易变异,或其他方法不能长期保存的菌种。 液氮超低温保藏过程是将菌种悬浮液封存于圆底安瓿管或塑料的液氮保藏管(材料应能耐受较大温差骤 然变化)内,放到-150~-196℃的液氮罐或液氮冰箱内保藏。 操作过程中一大原则是“慢冻快融”。为了减轻冷冻损伤程度,可采用保护剂。液氮保藏一般选用渗透 性强的保护剂,如甘油和二甲亚砜。它们能迅速透过细胞膜,吸住水分子,保护细胞不致大量失水,延 迟或逆转细胞膜成分的变性并使冰点下降。 通常将菌种悬浮在 10%(V/V)甘油蒸馏水或 10%(V/V)二甲亚砜蒸馏水保护剂中。孢子或菌体悬液的浓度 8 大于 10 个/ml 为好。事先,保护剂甘油应在 121℃,蒸汽灭菌 15 分钟。二甲亚砜应过滤除菌。 ⑧其他冷冻保藏技术(-20℃) (1)普通冷冻保藏技术(-20℃) 将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管内,然后贮藏于-20℃的普通冰箱中。也 可将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上,待生长适度后,将试管或瓶口用橡胶塞严格封好,同上置于 冰箱中保存。 用此方法可以维持若干微生物的活力 1—2 年。 应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度,培养瓶或试 管应严格密封。 这一方法虽简便易行,但不适宜多数微生物的长期保藏。 超低温冷冻保藏技术(-60 一-80℃) 要求长期保藏的微生物菌种,一般都要求在-60℃以下进行保藏。 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是: 1.离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞; 2.用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞; 3.加入等体积的 20%甘油或 10%二甲亚砜; 4.混匀后分装入冷冻指管或安瓿中,于-70℃超低温冰箱中保藏。 如果待保藏菌种生长在斜面上,则可用含 10%甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速 度一般控制在 1-2℃/min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏 5 年而活力不受影响。 ⑨基因工程菌的保藏 由载体质粒等携带的外源 DNA 片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。 质粒基因通常为宿主细胞生长非必需,且一般情况下当细胞丢失这些质粒时,生长速度会加快。 当培养基中加入抗生素时,抗生素提供了一个有利于携带质粒的细胞群体的极为有用的生长选择压力。 而且抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。 所以建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。 2、接种量的概念? 移入种子的体积 接种量= ————————— 接种后培养液的体积 3、发酵级数及特点? 种子罐级数 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数,但有时,工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数;

种子罐级数越少,越有利于简化工艺,便于控制,减少染菌;减少消毒及值班工作量,减少因种子罐生 长异常而造成的发酵波动。 级数大,难控制、易染菌、易变异,管理困难,一般 2-4 级。 接种方式: 一级种子罐:火圈保护接种法和压差法 ;二级种子罐:压差法 ; 发酵级数的确定 ①种子的性质(如菌种传代后的稳定性) ;②孢子瓶中孢子的密度(密度大则级数少) ;③孢子发芽及菌 丝繁殖速度(生长特性) ;④发酵罐中种子的最低接种量;⑤种子罐与发酵罐的容积比(发酵规模) ; 其中菌种的发生长特性影响最大 放线菌(生产抗生素)三级放大, (其中链霉素须四级扩大) ; 细菌生长较快,用二级放大培养(斜面菌种→一级种子摇床培养→二级种子罐培养→发酵罐) 。 还要随着工艺条件的改变作适当的调整。 4、扩大培养时接种的时机选择?

5、什么是种子的扩大培养?种子扩大培养的目的、要求及一般步骤? 种子扩大培养:种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后, 再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种的过程。这些纯种培养物称为种子。

步骤:休眠孢子→母斜面活化→摇瓶种子或茄子瓶斜面或固体培养基孢子→一级种子罐→二级种子罐→发酵 罐 种子扩培的目的:接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平 种子的要求:总量及浓度能满足要求,生理状况稳定,个体与群体,活力强,移种至发酵后,能够迅速生长, 无杂菌污染 6、微生物发酵的种子应具备哪些条件? ①菌种细胞的生长活力强,转种至发酵罐后能迅速生长,延迟期较短。②菌种生理状态稳定,如菌体形态、菌丝 生长速率和种子培养液的特性等符合要求; ③菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求, 一般接种量大, 发酵时间较短;④无杂菌污染,保证纯种发酵;⑤菌种经驯化后适应性更强,能保持稳定的生产能力。 7、导致菌种衰退的原因有哪些? 变异衰退; 分离现象; 自然衰老 第五章 培养基的制备 1、培养基及其分类和组成?微生物的培养基根据生产用途主要分为哪几类? 是采用化学成分还不清楚或还不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、 水解液等物质(例 ①天然培养基: 如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等)制成的。适合于除自养菌外各类微生物生长。

②合成培养基: 用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的。 成分精确, 重复性强, 可以减少不能控制的因素; 但由于培养基营养单一,一般微生物在合成培养基上生长较慢,有些微生物营养要求复杂,在合成培养基上不能 生长, 且价格较高。 适于在实验室范围作有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析等定量研究工作。 ③半合成培养基:多数培养基配制是采用一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源,再适当加入一些化 学药品以补充无机盐成分,使其更能充分满足微生物对营养的需要。 大多数微生物都能在此培养基上生长繁殖。因此,在微生物工业生产上和试验研究中被广泛使用。 工业发酵中培养基往往依据生产流程和作用分为:斜面培养基;种子培养基;发酵培养基 2、发酵培养基的特点和要求是什么?(培养基设计) ①提供必要的营养成分:培养基成分必须满足细胞生长,代谢活动和合成产物所需的基本要求;还要注意原料价 格低廉,质量稳定,取材容易。而且还要根据产物合成的特点来设计培养基; 对菌体生长与产物相偶联的发酵类型,充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。 对于生产氨基酸等含氮的化合物时,它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外,还应该添加足够的铵盐 或尿素等氮素化合物。 ②配制合适的浓度: 可以从发酵动力学有关生长、 产物合成和基质利用物料平衡的关系中大致推算所需原料或大 致计算出所需主要原料的需要量。还要注意主成分与其他成分的配比,并且保持适当的粘度和渗透压,以保证灭 菌质量。 ③控制合适的 pH:微生物的生长繁殖或产物的合成往往需要—定的 pH 环境,在最适 pH 值下有利于加快各种酶 的反应。因此在整个发酵过程中应使培养基的 pH 适合于微生物生长或产物合成所需。 ④避免产生微生物不能利用的物质或形成沉淀 葡萄糖与铵盐或氨基酸的氨基在灭菌高温下作用形成深褐色物质。这种物质不被微生物利用。因此这两 类营养物不宜直接配在一起进行灭菌,而应采用分开灭菌后再加入发酵罐内。 硫酸铵中的 SO 2与钙盐易形成难溶的硫酸钙,因此二者也不宜直接配成培养基。 4

⑤注意代谢调节物的影响: 有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或抑制发酵产物的形成。 前体物质;诱导剂;阻遏物;抑制剂;金属离子 3、培养基中各种成分的作用? (1)碳源功能 ①构成菌体成分的重要元素, ②产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的主要 原料, ③同时又是化能异养型微生 物的能量来源。 (2)氮源功能 ①为细胞生长和产物合成提供氮元素。 氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素, 而蛋白质和核酸是微生物 原生质的主要组成部分。②氮素一般不提供能量,但硝化细菌却能利用氨作为氮源和能源。③就某一类微生物而 言,由于其合成能力的差异,对氮营养的需要也有很大区别。 (3)无机盐类功能和微量元素 ①构成菌体成分;②作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性;③调节渗透压、pH 值、氧化还原电位等; ④作为自养菌的能源。 但不同菌种需求不同;同一微生物在不同生长阶段对这些物质的最适需求量也不同。 (4)前体 功能:指某些化合物加入到发酵培养基中,能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去,而其自身的 结构没有多大的变化,但产物的产量却因加入前体而有较大的提高。 (5)促进剂和抑制剂 促进剂:是一类刺激因子,指那些既不是营养物又不是前体,但却能提高产量的添加剂,这类物质加入或者可以 影响微生物的正常代谢,或者促进中间代谢产物的积累,或者提高次级代谢产物的量。 抑制剂:抑制剂会抑制某些合成其它产物的途径,同时会使另外一些代谢途径活跃,从而获得人们所需要的某种 产物或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。

(6) 水 ①水是良好的溶剂, 菌体所需要的营养物质都是溶解于水中被吸收的。 所有的生化反应也都是在水溶液中进行的。 ②渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介的; ③水直接参与代谢作用中的许多反应。所以,水在生物化学反应中占有极为重要的地位。 ④水是热的良导体,比热高,能有效地吸收代谢过程中所放出的热,可调节细胞的温度,使细胞内温度不致骤然 上升。 (7) 生长因子 广义说,凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子(又称生长素), 包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等;狭义说,生长素仅指维生素。 与微生物有关的维生素主要是 B 族维生素,这些维生素是各种酶的活性基的组成部分,没有它们,酶就 不能活动。 有机氮源是这些生长因子的重要来源,多数有机氮源含有较多的 B 族维生素和微量元素及一些微生物生 长不可缺少的生长因子。 (8)酶制剂 功能:①使培养基中大分子成分降解,便于微生物的利用;②降低培养基黏度和起泡能力(淀粉酶)③提高培养 基成分利用率 (9) 酸和碱 功能:调节培养基的 pH。 4、生长因子主要包括哪几类?生长因子的特点?(见上) 包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等;狭义说,生长素仅指维生素。 5、前体及使用方法? 前体概念:是指当添加到发酵培养基中的某些化学物质基本上不改变其分子结构而直接进入产物中的小分子物 质,从而在一定条件下控制产物的合成方向和提高产量。 一般采用流加的方式 6、产物抑制剂、功能及举例(酵母甘油生产)?产物促进剂? 促进剂:是一类刺激因子,指那些既不是营养物又不是前体,但却能提高产量的添加剂,这类物质加入或者可以 影响微生物的正常代谢,或者促进中间代谢产物的积累,或者提高次级代谢产物的量。 抑制剂:抑制剂会抑制某些合成其它产物的途径,同时会使另外一些代谢途径活跃,从而获得人们所需要的某种 产物或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。 举例: 酵母微生物发酵生产甘油中,亚硫酸氢钠与代谢过程中的乙醛生成加成物。反应式如下:

这就使乙醇代谢途径中的乙醛不能成受氢体,而使 NADH 在细胞中积累,从而激活 α -磷酸甘油脱氢酶的 活性,使磷酸二羟基丙酮取代乙醛作为 NADH 的受氢体,而还原为 α - 磷酸甘油,其水解后即形成甘油 7、常用的有机和无机氮源有哪些?功能? ① 无机氮源:铵盐、硝酸盐、氨水 无机氮源的特点:A. 微生物对其吸收利用比有机氮快,所以也称速效氮。B. 氨碱性强,易挥发,不能加 热灭菌需过滤灭菌。C. 利用无机氮时应注意引起的 pH 变化。 ② 有机氮源:花生饼粉(peanue meal) ;黄豆饼粉(soybean meal);棉子饼粉(cotton seed meal ) 玉米麸质粉(corn gluten meal);鱼粉(fish meal ); 蛋白胨、酵母膏、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等 它们在微生物分泌的蛋白酶作用下,水解成氨基酸,被菌体进一步分解代谢。 玉米浆(corn steep liquor) :是玉米淀粉生产中的副产物,其中固体物含量在 50%。还含有有机酸、还原 糖、磷、微量元素、生长素。由于玉米浆的来源不同,加工条件也不同,因此玉米浆成分有较大波动。 有机氮源特点: 一般无毒,可在培养基中使用较高浓度,但高浓度尿素使培养基中 pH 上升; 含有丰富的蛋白质、多肽和游离的氨基酸;还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及生长因子。

有机氮源成分复杂,且来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取和使用过程中,必须考虑原料的波动对发酵 的影响 选择氮源时:有机氮源和无机氮源应当混合使用。 早期:容易利用易同化的氮源—无机氮源; 中期:菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质 工业生产上常用硫酸铵、尿素、氨水、豆饼粉、花生饼粉、麸皮等原料作氮源。 8、常用的碳源有哪些?常用的糖类有哪些,各自有何特点? 糖 单糖:己糖 寡糖:蔗糖、麦芽糖、棉子糖 多糖:淀粉、纤维素、半纤维素、甲壳质和果胶质等,其中淀粉是大多数微生物都能利用的碳源。 脂类 有机酸:醋酸、乳酸、柠檬酸、丙酮酸、酒石酸等。 低碳醇:碳酸气、石油、天然气、甲醇、乙醇等 葡萄糖:是最易利用的糖,并且作为加速微生物生长的一种有效的糖。但过多的葡萄糖会过分加速菌体 的呼吸,以致培养基中的溶解氧不能满足需要。 糖蜜:是制糖厂生产糖时的结晶母液,是蔗糖厂的副产物。含有较丰富的糖、氨素、无机盐和维生素等, 是微生物工业的价廉物美的原料。 淀粉:一般要经菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被吸收利用。可克服葡萄代谢过快的弊病。来源丰富, 价格比较低廉。常用的为玉米淀粉、小麦淀粉和甘薯淀粉。 油和脂肪:在微生物分泌的脂肪酶作用下水解为甘油和脂肪酸,在溶解氧的参与下,氧化成水和 CO2。 因此用脂肪作碳源时需比糖代谢供给更多的氧。 9、培养基设计的一般步骤?培养基成分选择考虑的问题? 1、首先必须做好调查研究 2.其次,对生产菌种的培养条件 3、最好先选择一种较好的化学合成培养基做基础,开始时先做一些摇瓶试验;然后进一步做小型发酵罐 培养,摸索菌种对各种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。 4、有些发酵产物,如抗生素等,除了配制培养基以外,还要通过中间补料法,一面对碳及氮的代谢予以 适当的控制,一面间歇添加各种养料和前体类物质,引导发酵走向合成产物的途径。 此外,还需注意培养过程中的 pH 变化,观察适合于菌种生长繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同 pH, 不断调整配比来适应上述各种情况。培养基内 pH 可由添加碳酸钙来调节。 5、根据生产和科学研究的需要选择培养基 6、根据经济效益选择培养基原料 10、在大规模发酵的种子制备过程中,实验室阶段和生产车间阶段在培养基和培养物选择上各有何特点? 实验室阶段培养物选择的原则:种子能扩培到一定的量和质,获得一定数量和质量的孢子/菌体。培养基的选择 应该是有利于菌体的生长,对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。在原料方面,实验室种子培养阶段,规模一 般比较小,因此为了保证培养基的质量,培养基的原料一般都比较精细。 生产车间阶段培养物的选择原则最终一般都是获得一定数量的菌丝体。 培养基选择首先考虑的是有利于孢子的发 育和菌体的生长,所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面:不如实验室阶段那么精细,而是基本接近于发酵 培养基,这有两个方面的原因: 一是成本二是驯化 第六章 发酵工艺控制 1、影响培养基中溶解氧浓度的因素? OTR= KLa( C*-CL ) 、KLa 反映了设备的供氧能力、发酵常用的设备为:摇瓶和发酵罐 影响 Kla 的因素 1、影响摇瓶 kla 的因素

主要为装液量和摇瓶机的种类 2、影响发酵罐中 Kla 的因素 搅拌、空气流量、培养液性质、微生物生长、消沫剂、离子强度 2、微生物最适生长温度及特点?温度对发酵的影响? 选择最适发酵温度应主要考虑两个方面: 微生物生长的最适温度、产物合成的最适温度、还应根据其他条件合理调整,如菌种、培养基成分和浓度、菌体 生长阶段和培养条件等 对微生物细胞生长影响、对产物形成影响、影响发酵液物理性质、改变菌体代谢产物的合成方向,影响微生物的 代谢调控机制,进而影响生物合成方向。 3、发酵过程中较常测定的参数有哪些? 物理参数:温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、溶解氧、表观粘度、浊度、排气氧(二氧化碳)浓度、料液 流量等; 化学参数:基质浓度(糖、氮、磷等) 、pH、产物浓度、氧化还原电位、核酸量等 生物参数:菌丝形态、菌体浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等。 4、饱和溶氧浓度?临界溶氧浓度?临界溶氧浓度和细胞的比耗氧速率的关系。引起溶氧异常下降的原因 : 临界溶氧浓度, 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。 不同菌种、 同种菌在不同生理期具有不同的 C 临界值; CCr =1~25%饱和浓度 溶解氧的饱和浓度( C*) :一定温度与压力下,气体分子在气液两相中扩散达到动态平衡,此时液相中气体分 子的浓度。受温度、溶质性质和气相中氧分压的影响。 。 引起溶氧异常下降的原因: (1)污染好气性杂菌,大量溶氧被消耗 (2)菌体代谢发生异常,需氧要求增加 (3)某些设备或工艺控制发生故障或变化,如搅拌功率消耗变小或搅拌速度变慢,消泡剂加入过多; (4)影响供氧的工艺操作如停止搅拌等。 当不存在其他限制性基质时,如果溶氧浓度高于临界值,细胞的比耗氧速率保持恒定; 如果溶氧浓度低于临界值,细胞的比耗氧速率大大下降,这时细胞处于半厌氧状态。 5、生理性酸性物质?生理碱性物质? 生理碱性物质(硝酸钠) :被微生物利用后,可使 pH 上升的物质。 生理酸性物质(硫酸铵) :被微生物利用后,可使 pH 下降 6、发酵过程中 pH 会不会发生变化,为什么?发酵过程的 pH 控制可以采取哪些措施?pH 对发酵的影响表现在哪 些方面? 在发酵过程中,随着菌种对培养基中碳、氮源的利用,随着有机酸和氨基酸的积累,会使 pH 值产生一定的变化。 1、生长阶段:菌体产生蛋白酶水解培养基中的蛋白质,生成铵离子,使 pH 上升至碱性;随着菌体量增多,铵离 子的消耗也增多,另外糖利用过程中有机酸的积累使 pH 值下降。 2、生产阶段:这个阶段 pH 值趋于稳定。 3、自溶阶段:随着养分的耗尽,菌体蛋白酶的活跃,培养液中氨基氮增加,致使 pH 又上升,此时菌体趋于自溶 而代谢活动终止。 由此可见,在适合于菌体生长及合成产物的环境条件下,菌体本身具有一定的调节 pH 的能力,但是当外界条件 变化过于剧烈,菌体就失去了调节能力,培养液的 pH 就会波动。 首先考虑和试验发酵培养基的基础配方,调节培养基中生理酸性物质和生理碱性物质的配比,或通过添加 pH 缓 冲物质,使发酵过程中的 pH 值变化在合适的范围内,然后通过中间补料进一步控制。 在发酵过程中直接补加酸或碱和补料的方式来控制;或补充生理酸性物质和生理碱性物质来控制。 pH 低和氨氮含量低时:补氨水或尿素、pH 高和氨氮含量低:补加硫酸铵、pH 高和氨氮含量高:补糖 pH 对发酵的影响 1、影响菌体形态和生长

影响酶的活性,当 pH 值抑制菌体中某些酶的活性时,会阻碍菌体的新陈代谢; 2、影响细胞膜、营养物的电荷状态 影响微生物细胞膜所带电荷的状态,改变细胞膜的通透性,影响微生物对营养物的吸收和代谢产物的排泄;影响 培养基中某些组分的解离,进而影响微生物对这些成分的吸收; 3、影响产物稳定性 4、影响生物合成的途径 pH 值不同,往往引起菌体代谢过程的不同,使代谢产物的质量和比例发生改变。 7、深层通气发酵中搅拌的作用及选择原则。 搅拌的作用:①、将空气打散成细小气泡,增大气液相间有效接触面积 ②、使液体形成涡流,延长气泡停留时间 ③、增加液体湍流,减少传递过程阻力 ④、使培养液成分均匀 8、影响微生物需氧的因素有哪些?为何溶解氧容易成为好氧发酵的限制性因素? 细胞浓度直接影响培养液的摄氧率,在分批发酵中摄氧率变化很大,不同生长阶段需氧不同,对数生长后期达最 大值。培养基的成分和浓度显著影响微生物的摄氧率,碳源种类对细胞的需氧量有很大影响,一般葡萄糖的利用 速度比其他的糖要快。 9、根据工业微生物对氧气的需求不同,培养法可分为哪几种? 好氧培养和厌氧培养 10、 KLa 的意义及影响因素?比耗氧速度(或呼吸强度) KLa(容积氧传递系数)反映了设备的供氧能力。 主要为装液量和摇瓶机的种类 、装液量 比耗氧速度或呼吸强度(QO2) :单位质量的干菌体在单位时间内所消耗氧的量。mol/kg·s 11、发酵过程中补料的目的是什么? 在分批培养过程中补入新鲜的料液, 以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。 在这样一种系统中可以维持 低的基质浓度,避免快速利用碳源的阻遏效应;可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件;还可以利用 计算机控制合理的补料速率,稳定最佳生产工艺。 12、发酵热包括哪四部分? 生物热、搅拌热、蒸发热、辐射热 第七章 1、分批式发酵中,微生物生长一般可以分为哪几个时期。适于产生次级代谢产物的时期是哪个? 2、微生物发酵培养(过程)方法主要有哪几种? 3、连续式培养及特点? 4、Monod 方程及其使用条件如何?各参数的意义与求解? 3、菌体的生长比速?产物的形成比速?基质的消耗比速? 4、底物主要消耗在以下三个方面: 5、一类发酵?二类发酵?三类发酵? 6、影响停滞期长短的决定因素有哪些? 7、细胞得率系数、产物得率系数,倍增时间计算。


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