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欧洲黑杨基因资源材性关联基因的SNP分析


HEREDITAS (Beijing) 2008 年 6 月, 30(6): 795― 800 ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn

研究报告

DOI: 10.3724/SP.J.1005.2008.00795

欧洲黑杨基因资源材性关联基因的 SNP 分析
丁明明 1, 黄秦军 2, 苏晓华 2
1. 国家林业局国有林场和林木种苗工作总站, 北京 100714; 2. 中国林业科学研究院林业研究所 国家林业局林木培育重点实验室, 北京 100091

摘要: 以 115 个欧洲黑杨(Populus nigra L.)无性系为材料, 利用 TaqMan 技术分析了欧洲黑杨基因资源参与木质 素和纤维素合成的酶(4CL、PAL 和 CesA2)的单核苷酸多态性, 并对分型的 SNPs 与木材材性性状(物理性状:基 本密度、纤维长、纤维宽、微纤丝角; 化学性状: 木质素含量、纤维素含量、α 纤维素含量等)进行了相关分析。 结果如下: (1)在对 4CL、 PAL 和 CesA2 等 3 个基因进行检测时, 共获得 27 个 SNPs 标记, 对其中转换(A-G, C-T) 有 17 个位点, 颠换(A-C, G-C, G-T, A-T 等)有 10 个位点; (2)对其中的 3 个 SNPs 进行了分型, 分别记作 SNP1、 SNP2 和 SNP3; (2)对已经分型 SNPs 位点与材性性状进行方差分析, 结果显示, 3 个 SNPs 中只有 SNP1 与 4 年生 欧洲黑杨综纤维素含量显著相关, 表现为负效应, 贡献率为 11.11%; (3)对欧洲黑杨 4CL 基因的 SNP1 标记的不 同基因型所对应的材性性状进行方差分析, 结果显示基因型为 CC 和 CT 的欧洲黑杨相对于基因型为 TT 的欧洲 黑杨有较高的纤维素含量。 关键词: 欧洲黑杨; 材性; 单核苷酸多态性

Analysis on SNPs linked with wood properties of Populus nigra L. gene resources
DING Ming-Ming1, HUANG Qin-Jun2, SU Xiao-Hua2
1. General Administration of State Forest Farms, Tree seeds and seedlings, SFA, Beijing 100714, China; 2. The Research Institute of Forestry, CAF Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, SFA, Beijing 100091, China

Abstract: In this study, 115 Populus nigra L. collected from Europe were used as materials. They were detected for SNPs of genes linked with lignin and holocellulose (4CL, PAL and CesA2) by TaqMan technology and correlations between SNPs and wood properties (the wood speciely gravity, fiber length, fiber width, microfibre angle, lignin, holocellulose content and α-Cellulose content) were also studied. results showed that (1) 27 SNPs were obtained in the genes, such as 4CL, PAL and CesA2 associated with lignin synthesis. Among them, 17 SNPs were transition (A-G, C-T), 10 SNPs were transversion (A-C, G-C, G-T, and A-T). (2) Three of the SNPs were discriminated, a significant negative correlation between holocellulose content of four-year old P. nigra and SNP1 was detected, and contribution ratio was 11.11%. SNP2 and SNP3 had no significant correlation with wood properties. (3) Wood properties of various genotypes of SNP1 were significantly different. CC and CT genotype relative to TT genotype had larger holocellulose content. SNP1 would be an efficient marker to choose
收稿日期: 2007?11?23; 修回日期: 2008?01?23 基 金 项 目 : 国 家 “ 十 一 五 ” 科 技 支 撑 计 划 课 题 ( 编 号 : 2006BAD01A15) 和 国 家 高 技 术 研 究 发 展 “863” 计 划 课 题 ( 编 号 : 2006AA100109) 资 助 [Supported by National Eleventh 5 Science and Technology Support Program(No.2006BAD01A15) and the Hi-Tech Research and Development Program of China (863 Program) (No.2006AA100109)] 作者简介: 丁明明(1976?), 女, 博士, 研究方向:林木遗传育种学。Tel: 010-84238811; E-mail: dmmjoy@126.com 通讯作者: 苏晓华(1961?), 女, 研究员, 博士, 研究方向:林木遗传育种学。Tel: 010-62889627; E-mail: suxh@caf.ac.cn 致 谢: 感谢南京林业大学黄敏仁教授、张博博士在实验中给与的指导和帮助。

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P. nigra gene resources that have larger holocellulose content.
Keywords: Populus nigra L.; wood properties; single nucleotide polymorphisms

在杨树优良品种的定向培育中, 与造纸有关的 材性性状, 如木材密度、纤维长度和宽度、微纤丝 角, 以及纤维素、 木质素含量等, 是仅次于生长指标 的主要考虑因素。木材化学成分含量与纸浆得率、 纸浆性能密切相关。其中纤维素含量直接影响制浆 得率, 而木质素含量则决定了化学药品消耗和污染 负荷, 极小的木质素含量的改变, 都会引起很大的 经济效益的改变, 因此原材料的化学成分对化学浆 的工艺、经济效益和污染有决定性的影响 [1,2]。鉴于 木质素和纤维素在制浆造纸过程中的重要作用, 选 择在木质素和纤维素合成过程中的酶作为 SNPs 检 测分析的对象就有一定的现实意义。 单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphsims, SNP)是在人类疾病研究中首先应用的, 并逐 渐应用到植物中, 与 RFLP、AFLP、RAPD 和 SSR 等分子标记相比, 这种方法 对不同基因型之间的比较更直接 。在作物如 大豆 、玉米 [5]、水稻 [6,7]等中已经取得了一些进展, 但在林木上仍然应用甚少 [8]。目前, 将 SNPs 应用于 杨树基因资源的研究还未见报道。本研究以引进的 欧洲黑杨为材料, 研究了其材性关联基因的 SNPs, 为分子标记辅助选择、改良木材材质、缩短育种周 期奠定基础。
[4] [3]

京基因库, 每无性系取 3 株, 共取 85 个系号, 测定 物理性状(基本密度、 纤维长、 纤维宽和纤维长宽比); 4 年生无性系取自陕西, 每无性系取一株(平均木), 共取 65 个系号, 以胸径为中点上下各 25 cm, 即取 50 cm 长木段, 测定材性性状(物理性状: 基本密度、 纤维长、纤维宽、纤维长宽比和微纤丝角; 化学性 状: 水分、苯醇抽提物、综纤维素含量、纤维素含 量、木质素含量)。 1.2 1.2.1 方法 基因组 DNA 提取 以北京基因库欧洲黑杨无性系叶片为材料, 用 CTAB 法[9]提取其基因组 DNA, 每个无性系均取 0.2 g 叶片, 提取 DNA 后溶于 60 ?L TE 中, ?20℃保存备用。 1.2.2 SNPs 检测与分型方法 1.2.2.1 与木材木质素和纤维素合成相关基因的检索 在 NCBI 以及文献中查找与木质素和纤维素合 成相关的基因, 本文中已检测到 SNPs 位点的基因 分 别 为 在 NCBI 中 注 册 号 为 AF283553 的 4CL (4-Coumarate:coenzyme ligase, 4CL)基因、 注册号为 D43802 的 PAL(Phenylalanine ammonia-lyase, PAL)基 因和注册号为 AF417485 的 CesA2 (Cellulose synthases, CesA)基因。 1.2.2.2 引物设计和 PCR 扩增 考虑到 PCR 产物测序时的准确程度, 尽可能减 少 测 序 过 程 中 的 误 差 , 设 定 PCR 扩 增 产 物 长 度 400~600 bp, 对于较长的基因, 采取分区域扩增, 其 中, 4CL 基因分为 4 个区域, PAL 基因分为 9 个区域, CesA2 基因分为 3 个区域, 为保证基因的完整扩增, 在区域 间有 一定数 量的 重复碱 基。 引物设 计采 用 DNAstar 和 Primer 5.0 完成。随机选取 10 个样品进 行 PCR 扩增, 均为 40 个循环, PCR 产物纯化直接测 序或连接到 T 载体测序。 PCR 反应体系(25 ?L)包括: Buffer 2 ?L; dNTP 0.5 ?L; Taq 酶 1 U; 正向引物 1 ?L; 反向引物 1 ?L; DNA 2 ?L; ddH2O 17.8 ?L。 1.2.2.3 SNPs 分型方法 TaqMan 技术 [10]。

1
1.1

材料和方法
材料

从 2000 年起分别由欧洲黑杨广泛分布的 15 个 国家(其中南欧: 罗马尼亚、南斯拉夫、西班牙、意 大利、 保加利亚、 克罗地亚、 土耳其; 东欧: 俄罗斯; 西欧: 英国、 荷兰、 比利时; 中欧: 捷克、 斯洛伐克、 德国, 匈牙利)引入 150 份欧洲黑杨基因资源。在 2002 年将引入的欧洲黑杨无性系分别栽植于自然气 候明显不同的北京、内蒙古呼和浩特和陕西杨凌基 因库(101 个无性系栽种于北京, 110 个无性系栽种于 呼和浩特, 93 个无性系栽种于杨凌, 其中部分无性 系为三地所共有), 此外 14 个乡土欧洲黑杨无性系 栽种于北京。 本研究中木材性状测定时一年生无性系取自北

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1.2.2.4

用于 SNPs 分型的引物和探针

1.2.2.5

RT-PCR 反应体系和扩增程序

TaqMan 探针和引物的 Tm 值由软件 Express2.0 分析得出(表 1)。
表1 RT-PCR 扩增的引物和探针
Primer and probe for real time PCR amplification
引物和探针 Primer and probe 4CL-FAM(c) 4CL-VIC(t) 4CL-FP 4CL-RP P8-1-FAM(c) P8-1-VIC(t) P8-1-FP P8-1-RP P8-2-FAM(c) P8-2-VIC(g) P8-2-FP P8-2-RP
*: 小写字母代表目标序列。 *: Small letter represents target sequence.

反应体系为: 2×TaqMan Master Mix 5 ?L, Forward primers (20 pmol/?L)0.5 ?L, Reverse primers

Table 1

序列* Sequence(5′ ) →3′ FAM-CCATGAAAgCAACCAAAAACCGG-TAMRA VIC-CCATGAAAaCAACCAAAAACCGGAG-TAMRA GTTCTCTGGTGGGTCATCAATG CAGTCTCAACATGTGAACAAGCTAAG FAM- TCTTACTGcTCGGAGCTCCAATTCCTT-TAMRA VIC- TCTTACTGtTCGGAGCTCCAATTCCTTG-TAMRA TCAAAGGTGCCGAAATTGC GGCACTCTGGACATGATTGGT FAM-CTTCACCCTTCAgGATTCTGCGAAA-TAMRA VIC-CTTCACCCTTCAcGATTCTGCGAA-TAMRA GAGTCTTGACAATGGGCTTCAAT GGAAAAGACATGTTCTCTGTCAACA

Tm 值 Tm value 65.1 65.1 58.0 58.3 66.0 66.2 58.3 58.5 65.3 65.3 58.3 58.4

(20 pmol/?L) 0.5 ?L, TaqMan Fam probe (10 pmol/ ?L) 0.25 ?L, TaqMan Vic probe (10 pmol/?L) 0.25 ?L, DNA 1 ?L, ddH2O 2.5 ?L, 共计 10 ?L。 ABI 7500 荧光定量 PCR 仪上的反应条件为 50℃ 2 min, 95℃ 10 min, 继而 95℃ 15 s, 60℃ 1 min 进行 40 个循环。仪 器自动收集荧光信号, 软件分析给出 SNP 分型结果。

区域只有一个样品与其他 9 个样品有差异, 扩大样 品量(15 个)再检测时还是得到相同的结果, 认为该 位点的 SNP 中某一基因型频率非常低; 在 P3 区域 检测到 2 个, C/T 和 G/C; 在 P4 区域也检测到 2 个位 点, 分别为 C/T 和 A/G; 在 P6 区域检测到 1 个位点, 为 A/G; 在 P8 区域检测到 4 个位点, 其中 2 个为 C/G, 一个为 C/T, 一个为 A/C。 CesA2 基因在 A1 区域检测到 2 个位点, 分别为 A/G 和 C/G 突变; 在 A2 区域检测到 4 个位点, 1 个 A/T, 2 个 C/T, 1 个 G/T; 在 A3 区域检测到 7 个位点, 2 个 G/T, 3 个 A/G, 1 个 C/T, 1 个 G/C。此外在 A2 和 A3 区域还检测到 3 个碱基插入的位点。 在对以上 3 个基因进行检测时, 共发现 27 个 SNPs 位点, 其中转换(A-G, C-T)有 17 个位点, 颠换 (A-C, G-C, G-T, A-T 等)有 10 个位点。 1 列出的是 图 部分检测到的 SNP 位点及基因型。

2
2.1

结果与分析
SNPs 多态性 对 3 个基因进行 PCR 扩增、 测序、 比对, 结果(表

2): 4CL 基因除 4CL-4 区域未检测到 SNP 位点外, 其 他 3 个区域均检测到 SNP, 其中 4CL-1 区域 1 个, 为 T/C 突变; 4CL-2 区域 1 个, 为 A/G 突变; 4CL-3 区域 检测到 2 个, 均为 C/T 突变。 PAL 基因在 P1 和 P9 区域 PCR 扩增不理想, 故 未进行检测; 在 P2 和 P5 区域未检测到 SNP; 在 P7
表2 欧洲黑杨在各基因中 SNP 位点和基因型

Table 2

Genotype and site of SNPs in each gene for Populus nigra L.
4CL 4CL-1 4CL-2 1 A/G 4CL-3 2 C/T; C/T P8-3 2 C/T; G/C P8-4 2 PAL P8-6 1 P8-7 1 A/G P8-8 4 C/T; C/G; C/G; A/C A1 2 A/G; C/G A2 4 CesA2 A3 7

SNP 数量 SNP number 基因型 Genotype

1 T/C

C/T; A/G C/T

A/T; C/T; G/T; A/G; A/G; C/T; G/T A/G; C/T; G/C; G/T

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图1
Fig. 1

欧洲黑杨中检测到的 SNP 位点和基因型
Genotype and locus of SNPs for Populus nigra

2.2

SNPs 分型结果 选择测序结果好、序列中没有碱基插入的位点

的相关性达不到显著水平。 2.4 SNP1 标记不同基因型的综纤维素含量差异分析 对欧洲黑杨 4CL 基因的 SNP1 标记的不同基因 型所对应的材性性状进行方差分析(表 5)。 结果显示: CC 基因型综纤维素含量为 79.295%, 与 CT 基因型 的欧洲黑杨的综纤维素含量 79.077%差异不显著; TT 基因型的综纤维素含量为 78.026%与 CC 基因型 和 CT 基因型差异显著(P<0.05), 即基因型为 CC 和 CT 的欧洲黑杨相对于基因型为 TT 的欧洲黑杨具有 较高的纤维素含量; 综纤维素含量较高的欧洲黑杨 (CC 和 CT 基因型)有 27 个无性系, 基因型频率为 43.59%, 结合木材化学性状的测定结果, 综纤维素 含量排在前 10 位的欧洲黑杨中有 7 个为 CC 和 CT 基因型, 其中前 5 位的均为 CC 和 CT 基因型, 可见, 该 SNP 标记可作为初步判断欧洲黑杨基因资源综纤 维素含量的一个有效标记。
表3 欧洲黑杨在 3 个位点 SNP 标记基因型分布频率
Table 3 Distribution frequency of genotype at three locus of Populus nigra
SNP SNP1 基因型 Genotype CC CT TT CC CT TT CC GC GG 数量 Number 17 31 67 13 96 6 12 27 76 基因型分布频率 Distribution frequency of genotype(%) 14.78 26.96 58.26 11.30 83.48 5.22 10.43 23.48 66.09

应用 TaqMan 技术进行分型。本文中选择 4CL 基因 的 4CL-3 的 254 bp 处的 C/T 基因型和 PAL 基因的 P8 的 123 bp 处的 C/T 基因型和 403 bp 处的 C/G 基 因型, 分别记为 SNP1、SNP2 和 SNP3。 对 3 个位点进行分型的结果显示(表 3, 图 2): SNP1 标记基因型为 CC 的欧洲黑杨有 17 个, 基因型 频率 14.78%; CT 有 31 个, 基因型频率 26.96%, TT 为 58.26%; 在 SNP2 标记 CC 有 13 个, 基因型频率 11.30%, CT 有 96 个, 基因型频率为 83.48%, TT 有 6 个, 基因型频率 5.22%; 在 SNP3 标记 CC 有 12 个, 基因型频率 10.43%, GC 有 27 个, 基因型频率 23.48%, GG 有 76 个, 基因型频率 66.09%。 2.3 SNPs 标记与材性性状相关分析 将已经分型的 3 个 SNPs 标记分别与一年生欧 洲黑杨材性性状(物理性状:基本密度、纤维长、纤 维宽和纤维长宽比) 和 4 年生欧洲黑杨材性性状(物 理性状:基本密度、纤维长、纤维宽、纤维长宽比 和微纤丝角; 化学性状:水分、苯醇抽提物、综纤 维素含量、纤维素含量、木质素含量)进行单因素方 差分析, 获得与材性性状相关联的标记(材性测定结 果另文报道)。 结果显示: 3 个 SNPs 位点中只有 SNP1 与材性 性状具有相关关系(表 4), SNP2 和 SNP3 虽然与材性 性状也有相关关系, 但达不到显著水平。SNP1 与 4 年生欧洲黑杨苗木综纤维素含量显著相关(P<0.05), 表现为负效应, 贡献率为 11.11%, 与其他材性性状

SNP2

SNP3

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图2
Fig. 2

SNP1 标记 RT-PCR 分型图
Discrimination of SNP1 by real time PCR

表 4 方差分析检测欧洲黑杨与材性性状相关的 SNPs 标记
Table 4 Variance analysis on SNPs markers to wood property of Populus nigra
性状 标记 P值 Properties Markers P value 综纤维素 Cellulose SNP1 0.044* 贡献率 Contribution radio (%) 11.11 效应 Effect 负 Negative

TaqMan 技术操作相对简单, 敏感性较高, 将检测结 合 PCR 反应进行, 并减少了 PCR 污染的可能性。 本 研究中, 利用该技术取得较好的效果。但 TaqMan 技术需要昂贵的探针来结合变异区以辨别同源和异 源杂交, 而且只可以分析单个 SNP。若是利用此项 技术进行大量 SNP 检测, 则成本相对较高, 因此, 在选择 SNP 的检测方法时可根据不同目的以及经 费、实验设备情况进行合理的选择。 本研究中检测到的 SNP 位点中转换和颠换频率 之比为 1.7:1, 与人类基因组中转换和颠换频率之 比 2: [11,12]接近, 因为 CpG 二核苷酸的胞嘧啶 C 是 1 人类基因组中最易发生突变的位点, 其中大多数是 甲基化的, 可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶 T[13]。 Zhang 等 [14]的报道认为 SNPs 出现在氨基酸的第三 个密码子, 通常不会引起氨基酸的变化, 属于同义 突变; 出现在第一或第二个密码子时, 则会引起氨 基酸的变化, 属于非同义突变, 可能对表型变异有 影响。在本研究中, 4CL 基因共有 639 个氨基酸, SNP1 位于第 474 个氨基酸的第二个密码子, 导致氨 基酸发生改变, 从而产生蛋白质序列的改变, 可能 最终影响到蛋白质的功能, 属于非同义突变, 即 GTT(Val)?GCT(Ala), 因此可能会影响欧洲黑杨的

*: 表示 P<0.05 显著相关。 *: Indicates significant correlation (P<0.05).

表5

SNP1 标记不同基因型综纤维素含量差异

Table 5 Variation of cellulose of different genotype on SNP 1 marker
基因型 Genotype CC CT TT 平均值 Mean value(%) 79.295a 79.077a 78.026
b

标准差 Standard deviation 0.02959 0.01790 0.01380

最小值 Minimum value(%) 77.18 76.16 72.00

最大值 Maximum value(%) 83.60 85.28 80.17

注: 标注不同字母数值间差异显著(P<0.05)。

Note: The values with different letters are significant different(P<0.05).

3

讨 论
在对已知的单核苷酸多态性的检测方法中,

800

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表现型。 林木遗传改良是促进林木优质高产、提高森林 生态效应的一条有效途径。但由于林木遗传杂合性 高, 个体大, 生长周期长, 获得高世代群体成本高, 很难利用常规育种手段突破性地改变木材性状和培 育出不同材质的林木新品种。SNP 是多态性标记的 无尽的资源, 可用于高分辨率遗传图谱的构建, 建 立林木遗传图谱可以为在 DNA 水平上进行林木生 长、材性和抗性等重要性状的早期测定提供依据, 有效分析木材形成与控制的关键因子, 进一步分离 这些基因并阐明它们在木材形成中的重要作用, 同 时也可以提高早期测定的精确度和可靠性, 从而大 大缩短林木育种周期。本研究对欧洲黑杨基因资源 与材性性状相关的 SNPs 多态性进行了初步探索, 为进一步有效利用这些资源奠定基础。随着新 的 SNP 标记的发现和定位, 林木遗传作图的标记密度 将日益增高, 这将为林木育种提供前所未有的便利 工具。

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