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RNA干扰完整


RNA的干扰

RNA的干扰
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RNA

干扰

RNA干扰的作用机制 RNA干扰的应用 RNA干扰存在的问题

什么是RNA干扰?
? 英文:RNA interference,缩写RNAi 。 ? 概念:是指在进化过程中高度保守的、由 双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性 降解的现象,是正常生物体内抑制特定基 因表达的一种现象

RNA干扰的发现
2006年,安德鲁· 法厄与克雷格· 梅 洛(Craig C. Mello)由于在RNAi 机制研究中的贡献获得诺贝尔生理 及医学奖。

Napoli 等尝试在有颜色的矮牵牛( Petunia
hybrida ) 花翼瓣中通过介入CHS基因使查

1990
Fire 等把 RNA 注入新 秀杆线虫以控制基因的 表达

尔酮合成酶过量表达, 出人意料的是,

来加深花瓣的颜色。

花瓣颜色不仅未加深,而且

42%的介入 CHS 基因的植物的花全部变白 或有白色或灰白图案。

1991
罗马诺(Romano)和Macino

1992
Guo和Kemphues在线 虫中也发现了RNA干扰 现象。

也在粗糙链孢霉中发现了外源导 入基因可以抑制具有同源序列的 内源基因的表达

1995

美国华盛顿卡耐 基研究院 的 Fire等在研 究 RNA 干扰所需的结构和传递条件的试

1998
Hamilton等首次在PTGS植株中发现了长 度为25nt的RNA中间产物。2000年,

验中发现, 把 dsRNA 正义链和反义链的混 合物注入线虫体内, 比注入单独的任意一个 正义链或反义链的效果均要好。

Zamore和Hammond等使用体外培养的
果蝇细胞进行研究发现,外源性dsRNA 通过耗能过程降解成21-23nt的小干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA) 引发RNAi。

1999
Wianny和Svoboda等分别证实在小鼠胚胎 细胞和卵母细胞中dsRNA能引发RNAi效应。 2001年,Elbashir等证实21nt的siRNA可在 避免激活dsRNA依赖的蛋白激酶和2',5'-寡聚 腺苷酸合成酶信号转导途径的同时,有效抑 制人胚肾293细胞、Hela细胞等哺乳动物细 胞中目的基因的表达。

2000
Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子 构建了小发卡RNA(small hairpin RNA, shRNA)表达载体pSUPER,并证实转染该 载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内 目的基因的表达,为利用RNAi技术进行基 因治疗研究奠定了基础。

2002

RNAi的作用机制
RNAi的机制和过程大致分为以下几个阶段进行:

(1) siRNA的形成阶段; (2) RNA诱导的沉默复合物 ( RNA-induced silencing complex,RISC)形成阶段 ; (3) 效应阶段 ;
(4) 扩增阶段。

RNAi机制
外源
病毒

异常ssRNA

转座子

RdRP合成RNA

双链siRNA

激活的siRNA复合物

目标识别 内切酶切割目标 RdRP合成RNA 二级siRNA 外切酶降解RNA

(1) siRNA的形成阶段
目前,RNAi的作用机制主要是在线虫、果蝇和拟南 芥等生物体内阐明的。生物体由于RNA病毒入侵、转座子 转录、基因组中反向重复序列(inverted repeats)转录及外 源基因导入等原因,细胞中可出现dsRNA分子。 当各种原因产生的dsRNA在细胞中出现时,细胞中 一组特定蛋白复合物可识别dsRNA,此阶段需要Rde-1、 Rde-4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dicer等共同参与。 Rde-1,4编码的蛋白识别并引导dsRNA与Dicer结合,然后 Dicer将dsRNA解旋,再将其裂解为21~25nt大小的小干扰 RNA (small interfering RNA,siRNA)。

Dicer
核酸内切酶 核酸外切酶

同源搜索活性 解旋酶

Dicer contains two RNAse III domains
long dsRNA

siRNAs

Dicer定位于胞浆中,但核内mRNA剪切修饰后,向核
外运输过程中也存在RNAi现象,可能有其他类似功能的 酶发挥作用。现认为21~25nt大小在3’端带有2~3个碱基悬

端和5’端磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应最强。

siRNAs have a defined structure
19 nt duplex

2 nt 3’ overhangs

siRNA具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞 间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于 30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白 激酶(PKR)的激活而使其被降解,从而大大减少了其对 mRNA的抑制作用。 在RNAi启始过程中发挥酶切作用的Dicer酶属于 RNaseⅢ核糖核酸酶家族中的第三个家族,该家族的 RNase含有两个催化结构域,一个螺旋酶及PAZ模体 (motif),其功能是特异地将dsRNA降解成siRNA,因此, Dicer酶被认为是启动RNAi效应的关键。然而,令人费解 的是,为什么Dicer酶的降解产物是21nt~23nt的siRNA呢 ?最近对RNaseⅢ催化结构域的结构的研究使其真相大白 。

Dicer
一种核酸酶,负责将dsRNA 转化为siRNA : 它属于RNase Ⅲ家族,具有两个催化结构域、一个解 旋酶( helicase) 结构域和一个PAZ ( Piwi/ Argonaute/ Zwille ) 结构域, Dicer 在催化过程中以二聚体的形式 出现, 其催化结构域在dsRNA 上反平行排列, 形成四个活 性位点, 但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性, 这两 个位点在相距约22bp 的距离切断dsRNA , 各种生物体内

Dicer结构略有不同, 致使siRNA 长度存在微小差别。

Dicer

Models for Dicer cleavage

启始阶段
加工酶

加工成21-23核苷酸片段

Dicer

RISC

mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解



Dicer

siRNA的形成

siRNA



RISC

(2)RNA诱导的沉默复合物形成阶段
生成的siRNA和RNAi特异性酶,如AGO-2、MUT-7、 RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶结合形成RISC(RNAinduced silencing complex),具有序列特异性核酸内 、外切酶和解旋酶活性,能特异地降解与siRNA同源的靶 mRNA。

RNA诱导的沉默复合物 ( RNA-induced silencing complex,RISC)

(3)效应阶段
siRNA引导RISC与同源性的mRNA结合,在ATP及解 旋酶(如Rde-3、MUT-6、MUT-14)的作用下使siRNA链解离 ,并使RISC由250X103大小的前体形式变成约100X103左右 活性形式,同时解旋酶催化同源mRNA与siRNA的正义链互 换,核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5’起始端 下游7~10个核苷酸处切断mRNA,起到特异地抑制基因表达 的效果。

效应阶段
解旋酶 核酸外切酶

同源性检索活性

核酸内切酶 mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解

RISC
在这些机制中,RISC是一个很 灵活的平台,在不同的情况下结合 不同的调节分子从而具有不同的功 能。RISC复合物的核心负责接受从 Dicer加工来的小RNA,并用该小 RNA作为识别其同源底物的向导从 而介导RNAi的发生。

RISC
RNA-induced Silencing Complex
核酸内切酶 解旋酶

Argonaute protein
siRNA mRNA 100KD (active)

250KD (inactive)

ATP
6/14/2014

(4)扩增阶段
该反应以siRNA中的一条链为引物,以靶mRNA为模板 ,在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用下,扩增靶mRNA,产生新的二级 siRNA,而这些siRNA又能继续反作用于靶mRNA。 RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数,而且能将异常的单 链RNA转变为dsRNA。RdRP还是一个重要的“感应器”,它 能识别正常和异常的RNA。转基因RNA和病毒RNA都在RdRP 的识别下启动RNAi的反应过程。

RNAi扩大效应

目前,对这些现象的解释至少有 四种机制:
① Dicer酶将长dsRNA分子切成短的“初级siRNA”,再由后者降解 同源的mRNA,故dsRNA的长度决定了放大效应的水平; ② siRNA在酶作用中,可多次利用,能进一步提供放大的信号; ③ 移行RNAi (transitive RNAi)中,siRNA可作为靶mRNA的引物, 在RdRP和Dicer等的作用下产生“次级siRNA”,导致沉默信号的扩 增。 ④ “异常RNA”(aberrant RNA)无需引物,可在RdRP的作用下生成 dsRNA,并由Dicer酶切生成siRNA。 以上四种机制中,尤其是移行RNAi的发现为阐明沉默效应的扩增 及传递提供了重要线索。

移行RNAi
移行RNAi是指沉默信号沿特定基因的移动。即沉默信号沿特 定的mRNA由3’ 5’方向移动,这就是“移行RNAi”。在移行 RNAi中新生成的siRNA并非直接来自导入的dsRNA,而是在细胞中 RdRP的作用下,以初级siRNA的反义链为引物,以靶mRNA为模板, 生成dsRNA,随后在Dicer酶及ATP的作用下产生新的siRNA,称为次 级siRNA。除RdRP通过产生次级siRNA参与RNAi信号扩增外,其他与 RdRP具有同源序列的蛋白类似物也通过相同的方式产生次级siRNA 参与沉默信号的扩增。 此外,RNAi的扩增效应还可能存在另外两种机制: (1) Dicer将长 dsRNA切成初级siRNA,这一放大水平取决于dsRNA的长度;(2) siRNA在酶的作用下可以多次应用,产生进一步的放大效应。

应用:
RNAi主要通过在转录后 (post-transcriptional)水平阻断基因的表达, 导致蛋白无法合成,出现“基因沉默”。比如,我 们可以按拟定的方式来关闭(shutting off)非必 需或致病基因的功能。从理论上说,若能关闭致病 基因的表达则很多疾病将被治愈。动物实验已证明, 可以通过RNAi的方法使导致血胆固醇升高的基因 “沉默”;病毒性疾病,眼疾,心血管代谢性疾病 等方面的临床试验也正在进行中;这一方法为病毒 性肝炎、艾滋病和肿瘤等人类顽疾的治疗指了一条 新路 。

RNAi的应用领域

1

基因功能研究

2

病毒性疾病的治疗

3

肿瘤治疗

4
药物开发

1)基因功能研究

由于RNAi技术可以利用siRNA使目的基因
沉默,研究基因的功能。同时siRNA表达文库 构建方法的建立,使得利用RNAi技术进行高 通量筛选成为可能,对阐明信号转导通路、 发现新的药物作用靶点有重要意义。

2)病毒性疾病的治疗
RNAi 机制作为真核生物基因组免疫系统, 抑制外源和内源有害基因 表达。利用RNAi 技术把与病毒基因具同源性的siRNA 引入感染细胞将会 抑制病毒的增殖。利用RNAi 技术抑制过度表达的癌基因将会使癌症表型 逆转或病程得以控制。 研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个 研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA,激发RNAi抑制了HIV-1的 coreceptor(辅助受体)-CCR5进入人体外周T淋巴细胞,不影响另一种

HIV-1的coreceptor-CCR4,从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进
入细胞内产生了免疫应答,由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行 性大大增加。

? 。

?

?

Randall等证明了针对 HCV(丙型肝炎病毒) RNA的
siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的 HCV RNA降低80

倍;将siRNA 转染至已有HCV感染、复制的细胞,siRNA对
98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃的细胞有抑制作 用;siRNA干扰沉默 HCV RNA具有剂量依赖性和序列特异 性。Kapadia等也证明了siRNA特异抑制 HCV RNA复制、阻 止相关蛋白表达的作用。

Fig3.RNAi的抗病毒机制

3)肿瘤治疗
用RNAi特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的 过度表达,使这类基因保持在静默或休眠状态,从而有望用 这种新的手段治疗各种恶性肿瘤。

(1)RNAi可应用于敲除点突变激活的癌基因,
(2)RNAi可应用于抑制插入基因及融合基因的表达, (3)RNAi可应用于抑制基因扩增。

4)药物开发
? 。利用RNAi技术来研究药物作用的特异性和机制对于加快 药物开发的研制速度大有益处,因为基因组研究成果和高 通量的筛选技术,为更好更快发现药靶和候选药物提供了

重要基础。在药物开发过程中,用RNAi技术可以对靶基因
的功能进行分析,有助于搞清药物的作用机制以及与基因 编码产物,及与相应化合物的相互作用,从而更正确地发 现药靶,开发更有效的候选药物

RNA干扰存在的问题
? 目前siRNA导入胞内的效率低下,如何有效将siRNA转移入 体内成为RNAi应用的最大障碍; ? 如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为siRNA 的模板,从目前的研究来看,序列的选择原则尚不清楚; ? 目前RNAi 机制尚未完全阐明,尤其在哺乳动物细胞中的 研究报道不多。 ? siRNA的稳定性 ? 在多基因家族中的非特异性问题 ? 如何将RNAi技术运用到临床试验


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