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酶学与酶工程总结


Lecture 1 酶学与酶工程
酶的概念: 酶(enzyme enzyme)是一类由活细胞产生的,具有催化活性和高度专一性的特 具有催化活性和高度专一性的特 殊蛋白质,是一类生物催化剂 是一类生物催化剂。 酶的分类(6 类)、组成 组成、结构特点?和作用机制?

组成: 单体酶、 寡聚酶、 寡聚酶 多酶复合体 Note:一个酶蛋白可有多种催化活性 一个酶蛋白可有多种催化活性,相当于多个酶(关注原核和真核生物的差别 关注原核和真核生物的差别) 除水解酶和连接酶外,其他酶在反应时都需要特定的辅酶。 除水解酶和连接酶外 金属在酶催化中的作用:稳定酶构象、参与酶的催化作用(如激活底物 、电子传递 金属在酶催化中的作用 如激活底物) 体

酶作为催化剂的显著特点: 酶作为催化剂的显著特点 强大的催化能力:加快反应速度可高达 1017 倍; 加快反应速度可高达 没有副反应; 高度的专一性:各种酶都有专一性 但专一程度的严格性上有所差别; 各种酶都有专一性,但专一程度的严格性上有所差别 可调节性; 同工酶的概念: 同一种属中由不同基因或 同一种属中由不同基因或(复)等位基因编码的多肽链所组成的 等位基因编码的多肽链所组成的 同工酶的概念 单体、 纯聚体或杂交体, 纯聚体或杂交体 其理化及生物学性质不同而能催化相同反应的酶称 其理化及生物学性质不同而能催化相同反应的酶称同工酶。 同一基因生成的不同 mRNA 所翻译出来的酶蛋白也列入同工酶的范畴 所翻译出来的酶蛋白也列入同工酶的范畴。 酶蛋白合成后经不同类型的共价修饰(如糖基化等)而造成的多种酶分子形式 酶蛋白合成后经不同类型的共价修饰 而造成的多种酶分子形式,严 格来说不属于同工酶而称为 synzyme,但也有人称其为次生性同工酶 但也有人称其为次生性同工酶(secondary isozyme) 。 不同种属中催化相同反应的酶称为 xenozyme,也不属于同工酶。

酶的活性中心 指必需基团在空间结构上彼此靠近,组成具有特定空间结构的区域,能与底物特异 结合并将底物转化为产物 必需基团(essential group):酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中,一些与酶活性密 切相关的基团。 活性中心内的必需基团: 结合基团(与底物相结合)和催化基团(催化底物转变成 产物) 活性中心外的必需基团:维持酶活性中心应有的空间构象所必需; 构成酶活性中心的常见基团: 的咪唑基、 的-OH、 的-SH、 的 γ-COOH。 His Ser Cys Glu 酶的作用机制 酶活力的调节 酶的应用 食品加工方面:生物技术在食品工业中应用的代表就是酶的应用,目前已经有几十 食品加工方面 种酶成功用于食品工业。如葡萄糖、饴糖、果葡糖浆的生产、蛋白质制品加工、果 葡萄糖、 葡萄糖 饴糖、果葡糖浆的生产、蛋白质制品加工、 蔬加工、食品保鲜以及改善食品品质与风味等。 蔬加工、食品保鲜以及改善食品品质与风味等 常用的酶制剂主要有:淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、 纤维素酶葡萄糖氧化酶等。 酶在轻工业方面的应用: 酶在轻工业方面的应用:用酶进行原料处理(发酵原料、淀粉原料、纤维素原料、 含戊聚糖的植物原料的处理、纺织原料、造纸原料的制浆、生丝的脱胶处理、羊毛 的除垢) ,用酶生产各种产品(L-氨基酸、核苷酸、酱油或豆酱、制革) ,用酶增强 产品的使用效果 (加酶洗涤剂;加酶牙膏、牙粉和嗽口水) 酶在医学中的应用: 主要的医药用酶 、 用酶进行疾病的诊断 、 用酶治疗各种疾病 、 酶在医学中的应用: 用酶制造各种药物

酶与食品质量安全 酶制剂作为食品添加剂进入食品的潜在危害 酶催化有毒物质的产生 酶作用导致食品中营养组分的损失 潜在的产毒素性 潜在的致病性 对策:安全菌株,体外基因毒理学测试,酶制剂的安全评价,酶制剂来源安全性的 评估标准

Lecture 2 基因工程的酶学基础
核 酶(Ribozyme):概念:具有生物催化功能的 RNA。 概念: 概念 看课件 基因工程的酶学基础

基因克隆表达的过程 基因克隆常用的酶,有什么应用,注意事项( 基因克隆常用的酶,有什么应用,注意事项(补充后两者) )

Lecture 3 酶促反应
酶促反应的特点与机理:极高的效率(降低反应的活化能) 特异性 ,特异性 特异性和可调节性 特异性: 特异性:一种酶仅作用于一种或一类化合物,或一定的化学键,催化一定的化学反 应并生成一定的产物。酶的这种选择性称为酶的特异性或专一性。 绝对特异性(absolute specificity): 酶只作用于特定结构的底物, 进行一种专一的反应, 生成一种特定结构的产物 相对特异性(relative specificity):酶作用于一类化合物或一种化学键。 立体结构特异性(stereo specificity):酶仅作用于立体异构体中的一种。 机理:酶-底物复合物的形成与诱导契合假说(酶与底物相互接近时,其结构相互诱 导、相互变形和相互适应,进而相互结合) 可调节性: 可调节性:对酶生成与降解量的调节 酶催化效力的调节 通过改变底物浓度对酶进行调节等 两个假说:锁钥假说,诱导契合假说 酶促反应动力学:研究各种因素对酶促反应速度的影响 影响酶促反应的因素, 值的意义,测定(双倒数作图法) ① 影响酶促反应的因素,Km 值的意义,测定(双倒数作图法) 影响因素包括有: 影响因素包括有: 酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。 (具体见课件) Km 的意义和作用: 的意义和作用: 1. Km 值等于酶促反应的初速度为 Vmax 的一半时所需的底物浓度。 2. Km 值近似等于 ES 的解离常数,1/ Km 近似地表示酶对底物亲和力的大小。 3. Km 是酶的特征性常数,在一定程度上代表酶的催化效率。 4. 当、温度和离子强度恒定时, Km 只和酶及底物的性质有关,而与酶的浓度无关。 5. 一种酶能催化几种底物时就有不同的 Km,其中 Km 最小的底物一般认为是该酶的

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天然底物或最适底物。 当 Km 已知时,可求得任何底物浓度下酶活性部位被底物分子饱和的分数(FES) 。 分辨同工酶:测定几个同工酶对同一底物的 Km,可估计这组同工酶是原级同工酶 还是次生性同工酶,前者的 Km 常有差异,后者的则比较接近或相同。 探讨代谢规律:肌肉中的 A 型醛缩酶,对果糖-1,6-二磷酸的 Km 为 3?mol/L,对 3磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮的 Km 分别为 1mmol/L 和 2 mmol/L ,可知其在体内主 要催化糖酵解而难于参与糖异生。 有助于寻找代谢的限速步骤:如酶 1,2,3 分别催化 A B C D 三步 连续反应,三个酶的 Km 分别为 10 mmol/L, 1 mmol/L, 0.1 mmol/L ,而细胞内 A,B,C 的浓度相同,可推知酶 1 催化的 A B 为限速反应。 指导生化实验:利用工具酶来测定某一底物的浓度时,可根据米式公式的积分式来 计算工具酶的用量。工具酶的 Km 越大,所需加入的酶量也越大。 鉴别抑制类型

Vm 是酶完全被底物饱和时的反应速度,与酶浓度成正比。

有哪些抑制类型, ② 有哪些抑制类型,与 Km 之间的关系 不可逆性抑制: 不可逆性抑制:抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合,使酶失活,不能用透 析、超滤等方法予以除去。碘乙酸(ICH2COOH)是一种烷化剂,可使巯基烷化。有机磷 化合物(丝氨酸的-OH 磷酯化) 、重金属离子及砷化合物 可逆性抑制: 使酶的活性降低或丧失; 可逆性抑制 抑制剂以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合, 抑制剂可用透析、超滤等方法除去。 竞争性抑制: 抑制剂与底物的结构相似,能与底物竞争酶的活性中心,从而阻碍 竞争性抑制 酶底物复合物的形成,使酶的活性降低。(丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂/ 磺胺药对细菌 FH2 合成酶的抑制). 不变, 抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及[S] ;动力学特点:Vmax 不变,表观 Km↑。可通过增加底物浓度而使整个反应平衡向生成产物的方向移动,因而能削弱 或解除这种抑制作用。 非竞争性抑制: 抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合,底物与抑制剂之间无竞 非竞争性抑制 争关系。 抑制剂并非结合于活性中心的底物结合位点,而是此位点以外的基团,如催化基团 等。 抑制剂与活性中心结合后也不引起底物结合的立体障碍。 如别嘌呤醇竞争性抑制黄嘌呤氧化酶,其氧化产物别黄嘌呤非竞争性抑制黄嘌呤氧 化酶。 非竞争性抑制的特点 特点 S 和 E 或 ES 都能结合,两者结合的亲和力相等,I 也能和 E 或 ES 结合,两者的亲 和力相等。

S 和 I 与酶的结合既不互相排斥,也不互相促进,抑制程度取决于[I] ; 不变。 动力学特点: , 动力学特点:Vmax↓,表观 Km 不变。这种抑制作用不能用增加底物浓度的方法来消 除。 。 反竞争性抑制: 抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物结合,使 ES 的量下降。 反竞争性抑制 抑制剂只与 ES 结合;抑制程度取决与[I]及[S] 动力学特点:Vmax↓,表观 Km↓。 ;动力学特点 动力学特点: , 。 混合性抑制作用: 混合性抑制作用 S 和 E 或 EI 都能结合, I 也能和 E 或 ES 结合,但亲和力都不 相等。S 和 I 对 E 的结合互有影响。相当于纯非竞争性和部分竞争性抑制作用的混 合系统。

③ 酶的调剂:酶原调节,变构调节,共价调节 酶的调剂:酶原调节,变构调节, 酶原 (zymogen):有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体,此前体物质称为酶 原。例子:胰蛋白酶原、血液凝固的级联放大作用、胃蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原 酶原的激活:在一定条件下,酶原向有活性酶转化的过程。 酶原的激活

酶原激活的机理 变构调节: 变构调节:一些代谢物可与某些酶分子活性中心以外的部位可逆地结合,使酶构象改变,从 而改变酶的催化活性,此种调节方式称变构调节。 变构酶的特点: 变构酶的特点:1、通常具有四级结构,存在协同效应;2、含有催化亚基和调节亚基(或催 化部位和调节部位) 。3、[S]-v 关系曲线为 S 形。 一个效应物分子与变构酶的结合, 对第二个效应物分子的结合产生影响, 这种效应为协同效 协同效

天冬氨酸转氨甲酰酶,简称 ATCase 应。别构酶举例:天冬氨酸转氨甲酰酶

共价修饰:在其他酶的催化下 酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆 共价修饰 在其他酶的催化下,酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生 可逆 的共价结合,从而改变酶的活性 从而改变酶的活性,此过程称为共价修饰。磷酸化与脱磷酸化 磷酸化与脱磷酸化(最常见)/乙 酰化和脱乙酰化/甲基化和脱甲基化 甲基化和脱甲基化/腺苷化和脱腺苷化/-SH 与-S-S 互变 特点:受共价修饰的酶存在有(高)活性和无(低)活性两种形式;具有瀑布效应 具有瀑布效应(级联效 特点:受共价修饰的酶存在有 应) ;是体内经济、有效的快速调节方式 有效的快速调节方式。

Lecture 4 酶的分离纯化
发酵液的预处理 细胞的破碎方法 酶的提取分离方法 酶的浓缩结晶 纯化方案的设计与评价

Lecture 5 固定化酶与固定化细胞
为什么要固定化酶, 为什么要固定化酶,酶固定化的优缺点 固定化酶:指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶,能连续地进行反应 固定化酶:指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶 能连续地进行反应,反应后 的酶可以回收重复使用。 为什么要固定化酶: 酶的优点和缺点 优点:高催化效率 高催化效率;高专一性。缺点:对环境十分敏感;易失活 易失活;不能回收。 固定化生物催化剂的优点 底物产物分开;能回收,可反复使用;易于连续化、自动化 底物产物分开 酶固定化的优缺点 优点: 优点:

酶固定化的方法(详见课件) 酶固定化的方法(详见课件)

酶固定化的性质 大多数固定化酶活性下降;提高了稳定性;最适温度也随之提高,不变或下降;pH 和 pH-活性曲线常常发生偏移(微环境表面电荷性质的影响) m 变化(高级结构变 ;K 化及载体影响引起酶与底物亲和力变化,又受溶液中离子强度的影响) 固定化酶制备物的性质取决于所用的酶及载体材料的性质。 酶:生物化学性质;动力学参数 载体:化学特征;机械性质 固定 化酶:固定化方法;稳定性等 细胞的固定化 概念:将细胞约束或限制在一定的空间界限内,但细胞仍保留催化活性并具有能被 反复或连续使用的活力。固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞 称为固定化细胞。该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢。 优点:保持了细胞内酶系的原始状态与天然环境,因而更稳定;保持了细胞内原有 的多酶系统,适于多步催化的反应;无需辅酶再生;固定化增殖细胞发酵具有显著 优越性。 缺点:细胞内有多种酶,可能有副反应;细胞膜等存在扩散限制作用;载体形成的 孔隙大小影响高分子底物的通透性。 固定化细胞的分类,制备方法

1. 化学法(共价交联)2. 包埋法 3. 吸附法 固定化酶与固定化细胞的应用: 生物化学与分子生物学基础研究/亲和分离系统/药物 控释载体/在食品、制药等轻工、化工领域/生物传感器 生物传感器 : 又称生物活性物质修饰的传感器

Lecture 6 酶的修饰(1) 酶的修饰( )

酶反应器的概念, 酶反应器的概念,类型 概念: 概念 以酶或固定化酶作为催化剂进行酶促反应的装置

酶的稳定性和稳定化 酶(蛋白质)的稳定性是指酶抵抗各种因素的影响,保持其生物活力的能力。要保 持其生物活力,必须保持其空间结构。 稳定化指的是熵(Entropy)性质:由于交联即蛋白质中形成二硫键,伸展蛋白质的 熵急剧降低 酶的化学修饰: 详见课件从……开始) ……开始 酶的化学修饰:化学酶工程 (详见课件从……开始) 改变酶特性有两种主要的方法: 1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性(化学酶工程 。 化学酶工程) 化学酶工程 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的(生物酶工程 。 生物酶工程) 生物酶工程 化学修饰定义:对酶在分子水平 分子水平上用化学方法进行改造,即在体外 体外将酶分子通过人 分子水平 体外 人 工方法与一些化学基团,特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接 共价连接,从而改变 工方法 共价连接 改变 酶分子的酶学性质的技术。 酶分子的酶学性质 酶化学修饰的原理、酶化学修饰的基本要求和条件 酶化学修饰的原理 酶化学修饰的基本要求和条件 最常见大分子修饰剂) 修饰的类型 (最常见大分子修饰剂) 化学修饰分为可溶性大分子修饰酶 小分子修饰酶:可溶性大分子修饰酶:PEG 修 可溶性大分子修饰酶 小分子修饰酶: 可溶性大分子修饰酶和小分子修饰酶 饰的人血红蛋白 最常用的修饰剂——PEG 类修饰剂 聚乙二醇 (polyethyleneglycol, PEG)是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性,在 体内无毒性、无残留。其生物相容性已通过美国食品和药物管理局(FDA)认证。 通常没有免疫原性和毒性,不会破坏生物分子的活性,并可消除酶的抗原性,使其末 端活化后可以与酶产生交联,因而,它被广泛用于酶的修饰。 PEG 分子量范围很宽, 适合用作修饰剂或修饰剂出发原料的 PEG 的相对分子质量一 般为 500~20000。 PEG 既溶于水,又溶于绝大多数有机溶剂,但不溶于乙醚、脂肪烃。

Lecture 7 酶的修饰(2) 酶的修饰( )
? ? 酶的化学修饰: 酶的化学修饰:化学酶工程 学修饰 修饰的设计(见课件部分) 酶的分子修饰: 酶的分子修饰:生物酶工程 将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸,引起酶蛋白空间构象的改变,从而改

变酶的某些特性和功能的方法。 变酶的某些特性和功能的方法 生物酶工程主要包括: 生物酶工程主要包括 (1) 用基因工程技术大量生产酶 用基因工程技术大量生产酶(克隆酶) ; (2) 修饰酶基因产生遗传修饰酶 修饰酶基因产生遗传修饰酶(突变酶) ; (3) 从蛋白质或基因水平上设计 合成酶杂合体或自然界不曾有的酶(杂合酶) 从蛋白质或基因水平上设计,合成酶杂合体或自然界不曾有的酶 。 酶分子的改造: 酶分子的改造: 基于序列的合理化设计方案:化学修饰,定点突变。 合理化设计方案 合理化 利用基因的可操作性,模拟自然界的演化过程的非合理化设计方案,如定向进化。 利用基因的可操作性 非合理化设计方案 非合理化 ? ? 修饰的过程和原理 酶的定向进化(方法及原理 方法及原理) 定义:所谓酶的体外定向进化,又称实验分子进化,属于蛋白质的非合理设计 属于蛋白质的非合理设计,它 定义:所谓酶的体外定向进化 不需事先了解酶的空间结构和催化机制,通过人为地创造特殊的条件 不需事先了解酶的空间结构和催化机制 通过人为地创造特殊的条件,模拟自然进 化机制(随机突变、重组和自然选择 重组和自然选择),在体外改造酶基因,并定向选择出所需性质 并定向选择出所需性质 的突变酶。 原理:定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体” 。 原理:定向进化的基本规则是 定向进化=随机突变 随机突变+选择。前者是人为引发的,后者虽相当于环境 后者虽相当于环境,但只作用于突 变后的分子群,起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用 起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用,整个进化过 起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用 程完全是在人为控制下进行的 程完全是在人为控制 方法: 基因家族之间的同源重 方法:1、易错 PCR 技术为代表的无性进化 2、DNA 改组、基因家族之间的同源重 组 4、外显子改组 5 5、计算机辅助设计

Lecture 8
? 杂合酶 把来自不同酶分子的结构单元 (单个功能域、 二级结构、 三级结构或功能域) 三级结构或功能域 概念: 概念: 或酶分子进行组合或交换,可以产生具有所需性质的优化酶杂合体 或酶分子进行组合或交换 可以产生具有所需性质的优化酶杂合体。由两种以上酶 成分构成。 优化酶的结构,提高功能的手段。 优化酶的结构

?

构建方法: 抗体酶 例子是哪个? 例子是哪个? 概念和特点: – 一种具有催化功能的抗体分子 在其可变区赋予了酶的属性。 一种具有催化功能的抗体分子,在其可变区赋予了酶的属性 – 它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果, 它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果, 是抗体的高度选 择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。 择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物 特性: 特性:一种对酶促反应过渡态特异的抗体 1、能催化一些天然酶不能催化的反应 能催化一些天然酶不能催化的反应

2、有更强的专一性和稳定性

? 核酶? ? 极端酶 概念,特点,设计到的技术方法(详见课件) 概念,特点,设计到的技术方法(详见课件)

Lecture 9 酶的发酵生产
? 酶生物合成的调节 ? 酶的发酵生产 ? 微生物 常见的产酶微生物 酶发酵动力学定义 酶合成模式的四种类型 ? 动植物细胞发酵产酶:细胞的特点,获取,培养方式和条件。 ? 考试内容 ? 是非题(20 题,20 分) ? 填空题 (30 空,30 分) ? 简答题(5 题,每题 7 分,共 35 分)名词解释一题,简答三题,主观发挥题一题 ? 论述题(1 题,15 分)实验设计题:涉及基因工程酶学基础,酶的分离纯化,活力 鉴定等方面


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