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基因沉默原理



RNAi 及基因沉默原理 百奥迈科(Biomics)RNAi 产品与服务一览 1.siRNA 生物合成 1.1 全位点 siRNA 表达文库构建服务 1.2 RNAi 载体构建技术服务 1.3 Gene TargetTM siRNA Set 2.siRNA 化学合成 2.1 化学合成 siRNA 简介 2.2 siRNA 设计 2.3 百奥迈科(Biomics) siRNA 产品简介 2.4 普通 siRNA oligo 2.5 荧光标记 siRNA oligo 2.6 化学修饰 siRNA oligo 2.7 miRNA 的化学合成 2.8 RNAi 系列优惠套餐 2.9 siRNA 对照 3.RNAi 病毒包装 3.1 腺病毒载体包装 3.2 慢病毒载体包装 3.3 其他类型病毒载体包装 4.哺乳动物细胞 siRNA 转染 4.1 转染方法 4.2 转染步骤 4.3 转染优化及注意事项 5.mRNA 水平检测基因沉默 5.1 mRNA 的提取/制备 5.2. 实时定量荧光 PCR 6 蛋白质水平检测基因沉默 6.1 Western blot 6.2 ELISA 6.3 免疫荧光 7.其他相关服务 7.1 稳定细胞筛选服务 7.2 细胞增殖毒性检测服务 7.3 细胞凋亡检测服务 7.4 DNA 测序 8.RNAi 相关产品 8.1 RISOTM RNA 抽提试剂 8.2 其他



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RNAi 及基因沉默原理 RNA 干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链 RNA (double-strandedRNA,dsRNA) 引发的 转录后基因静默机制。其原理是:RNaseIII 核酶家族的 Dicer,与双链 RNA 结合,将其剪切 成 21 - 25nt 及 3'端突出的小干扰 RNA (small interfering RNA,siRNA),随后 siRNA 与 RNA 诱导沉默复合物 (RNA - induced silencing complex,RISC) 结合,解旋成单链,活化的 RISC 受已成单链的 siRNA 引导,序列特异性地结合在靶 mRNA 上并将其切断,引发靶 mRNA 的 特异性分解,从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。

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百奥迈科(Biomics)RNAi 产品与服务一览

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1. siRNA 生物合成 1.1 全位点 siRNA 表达文库构建服务 本公司拥有自主知识产权的全位点 siRNA 文库构建技术,能够从全长 cDNA 构建包含所 有有效结合位点,长度分布于 19 - 23bp 的靶基因的 siRNA 分子库,亦可以模仿体内 Dicer 酶 切割长度为 21 - 23bp 的分子库,适用于高通量功能基因及相关药物靶点筛选。 1.1.1 构建流程: 1)客户可选: 提供靶基因的 cDNA 克隆。 提供靶基因的相关信息 (基因的 mRNA 序列或 Genbank Accession Number)。 也可在本公司的 cDNA 产品目录中,挑选靶基因 cDNA 克隆。 2)进行 siRNA 文库构建,抽样测序验证。 3)根据客户要求提供相应的文库产品。 4)将其连同抽样报告、产品说明书一起寄送到客户手中。 A. HBV Polymerase Domain siRNA 表达文库位点分布(随机抽样测序) Polymerase Domain (984bp):

B. 构建的 Survivin 基因全位点 siRNA 表达文库,文库抽样基因沉默(qPCR)筛选结果: 该数据显示,本公司 siRNA 文库位点分布的随机性,可以更好地找到最优的靶点。

s1-s8: Randomly selected siRNA sequences from Biomics library s9/s10/s11: The published siRNA sequences target-off: Negative control un-transfect: Untreated normal control
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1.2 RNAi 载体构建技术服务 1.2.1 技术特点: 1)多种 siRNA 表达载体,可以在细胞内直接转录出 siRNA,行使其 RNAi 功能,包括: U6 启动子表达载体; H1 启动子表达载体; U6、H1 双启动子表达载体; CMV 启动子表达载体; 2)载体带有 GFP 标签可以监测转染效率。构建好的 siRNA 表达载体可直接用于转染细 胞进行 RNAi 实验; 3)本公司还可根据客户需要提供各种商业化表达载体; 4)本公司可以为客户构建线性 siRNA 表达载体,shRNA 表达载体,miRNA 表达载体以 及病毒型 RNAi 载体。 1.2.2 构建流程: 1)siRNA 靶点设计; 客户提供靶基因的 siRNA 序列,由本公司将其克隆到 siRNA 表达载体上。 客户提供靶基因的相关信息 (基因的 mRNA 序列或 Genbank Accession No.) 根 , 据客户要求,本公司设计高效特异性的 3-4 条针对靶基因的 siRNA。 2)合成设计好的 DNA 并退火形成双链 DNA,克隆到客户要求的载体上。 3)通过测序进行验证。 4)构建成功的 siRNA 质粒连同测序报告、产品说明书一起寄送到客户手中。 注:可根据客户要求提供 siRNA 的阳性及阴性对照质粒。 1.2.3 质量保证: 符合设计要求的 siRNA 序列测序结果。

基于载体的 RNAi 实验示意图

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1.2.4 各种商业化表达载体:
产品编号 BV0011 BV0012 BV0013 BV0014 BV0015 BV0016 BV0107 BV0108 载体 pRNAi-U6H1/Neo pRNAi-H1.1/Neo pRNAi-U6.1/Neo pRNAi-CMV3.1/Neo pRNAi-CMV3.2/Neo pRNAi-CMV4.1/Neo pRNAi-U6.1/Lenti pRNAi-H1.1/Retro 启动子 U6 和 H1 H1 U6 CMV CMV CMV U6 H1 筛选基因 Neomycin Neomycin Neomycin Neomycin Neomycin Neomycin Neomycin Neomycin 标记基因 GFP GFP GFP GFP GFP GFP GFP

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1.3. Gene TargetTM siRNA Set Gene Target? siRNA Set 是本公司的专利技术开发的基因沉默系列产品之一。产品由 4 个不同位点的 siRNA 克隆组成,可以降低在基因沉默中产生的脱靶现象,提高沉默效率。四 个克隆可以混合使用,也可以单独使用。产品均经基因测序证实,保证其 100%的同源性。 本产品有如下特点: 在 U6 和 H1 启动子的起始序列 AAAAA 和终止序列 TTTTT 之间的 siRNA 片段没有多余 的多克隆位点序列,提高沉默的特异性。 siRNA 表达框(U6-siRNA-H1)可以整体亚克隆到逆转录病毒载体 (Retrovirus)、腺 病毒载体(Adenovirus) 、慢病毒载体(Lentivirus) ,具有较好的适用性。 siRNA 没有二级结构(如发夹型结构),在上述病毒载体中较稳定。 构建的质粒载体转染到细胞内,在细胞内转录出双链 RNA,在细胞内具有中长期表达的 特性,能够较长期的发挥基因沉默的作用。 由于质粒可以复制扩增,较化学合成方法显著降低制备 siRNA 的成本。 载体法的 siRNA 可测序保证 100%序列同源性,而化学合成的 siRNA 分子的序列鉴定较 困难。

表达载体 pU6H1-GFP 图谱

产品性状形态:本产品具有可靠的稳定性,以质粒 DNA 与滤纸小圆片共干燥封装,可在 常温下运输和储存。 Gene TargetTM siRNA Set 产品包含: 1. 特定基因 4 个位点的 Gene TargetTM siRNA Clone。 2. 阳性对照 1 管(用于平行跟踪转染、RNA 提取等实验过程, 排除假阴性结果。 3. 阴性对照 1 管 (阴性对照的 siRNA 与目的基因以及靶细胞中其 ) 它基因 mRNA 没有同源性, 排除假阳性结果。 )

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Gene TargetTM siRNA Set 产品目录?
Cat.No. ACCN No. NM_145262 NM_145259 NM_153361 NM_153273 NM_152720 NM_030906 NM_020804 NM_172170 NM_152835 NM_015000 NM_174858 NM_173354 NM_033015 NM_032844 BC032542 NM_032028 NM_031414 NM_182691 NM_032409 NM_023018 NM_024876 NM_006153 NM_006293 Description Homo sapiens glycerate kinase (GLYCTK) Homo sapiens activin A receptor, type IC (ACVR1C) Homo sapiens hypothetical protein MGC42105 (MGC42105) Homo sapiens inositol hexaphosphate kinase 1 (IHPK1), transcript variant 1 Homo sapiens NIMA (never in mitosis gene a)-related kinase 3 (NEK3) Homo sapiens serine/threonine kinase 33 (STK33) Homo sapiens protein kinase C and casein kinase substrate in neurons 1 (PACSIN1) Homo sapiens calcium/calmodulin-dependent protein kinase (CaM kinase) II gamma (CAMK2G), transcript variant 3 Homo sapiens PDLIM1 interacting kinase 1 like (PDIK1L) Homo sapiens serine/threonine kinase 38 like (STK38L) Homo sapiens adenylate kinase 5 (AK5), transcript variant 1 Homo sapiens SNF1-like kinase (SNF1LK) Homo sapiens Fas-activated serine/threonine kinase (FASTK), transcript variant 4 Homo sapiens microtubule associated serine/threonine kinase-like (MASTL) Homo sapiens, L-fucose kinase, clone MGC:45494 IMAGE:5534376, complete cds Homo sapiens testis-specific serine kinase 1 (TSSK1) Homo sapiens serine/threonine kinase 31 (STK31), transcript variant 1 Homo sapiens SFRS protein kinase 2 (SRPK2), transcript variant 2 Homo sapiens PTEN induced putative kinase 1 (PINK1), nuclear gene encoding mitochondrial protein Homo sapiens NAD kinase (NADK) Homo sapiens aarF domain containing kinase 4 (ADCK4) Homo sapiens NCK adaptor protein 1 (NCK1) Homo sapiens TYRO3 protein tyrosine kinase (TYRO3)
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Kinase
K07002 K07003 K07004 K07005 K07007 K07008 K07009 K07012 K07016 K07021 K07026 K07027 K07029 K07030 K07033 K07035 K07041 K07046 K07054 K07055 K07056 K07057 K07059

K07060 K07061 K07066

NM_024761 NM_173515 NM_002497

Homo sapiens MOB1, Mps One Binder kinase activator-like 2B (yeast) (MOBKL2B) Homo sapiens CNKSR family member 3 (CNKSR3) Homo sapiens NIMA (never in mitosis gene a)-related kinase 2 (NEK2)

Gene TargetTM siRNA Set 产品目录?
Cat.No. K07067 K07069 K07071 K07076 K07079 K07080 K07082 K07085 K07087 K07089 K07090 K07091 K07092 K07093 K07096 K07100 K07102 K07105 K07108 K07109 K07110 ACCN No. NM_002350 NM_002731 NM_020421 NM_171825 NM_001798 NM_004936 NM_003992 NM_005233 NM_004103 NM_000801 NM_032999 NM_030952 NM_000221 NM_002498 NM_181839 NM_145160 NM_002822 NM_003583 NM_003668 NM_139078 NM_030662 Description Homo sapiens v-yes-1 Yamaguchi sarcoma viral related oncogene homolog (LYN) Homo sapiens protein kinase, cAMP-dependent, catalytic, beta (PRKACB), Homo sapiens aarF domain containing kinase 1 (ADCK1) Homo sapiens calcium/calmodulin-dependent protein kinase (CaM kinase) II alpha (CAMK2A), Homo sapiens cyclin-dependent kinase 2 (CDK2), transcript variant 1 Homo sapiens cyclin-dependent kinase inhibitor 2B (p15, inhibits CDK4) (CDKN2B), transcript variant 1 Homo sapiens CDC-like kinase 3 (CLK3), Homo sapiens EPH receptor A3 (EPHA3), transcript variant 1 Homo sapiens PTK2B protein tyrosine kinase 2 beta (PTK2B), transcript variant 2 Homo sapiens FK506 binding protein 1A, 12kDa (FKBP1A), transcript variant 12B Homo sapiens general transcription factor II, i (GTF2I), transcript variant 1 Homo sapiens NUAK family, SNF1-like kinase, 2 (NUAK2) Homo sapiens ketohexokinase (fructokinase) (KHK), transcript variant a Homo sapiens NIMA (never in mitosis gene a)-related kinase 3 (NEK3), Homo sapiens protein kinase (cAMP-dependent, catalytic) inhibitor alpha (PKIA), transcript variant 7 Homo sapiens mitogen-activated protein kinase kinase 5 (MAP2K5), transcript variant A Homo sapiens twinfilin, actin-binding protein, homolog 1 (Drosophila) (TWF1) Homo sapiens dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 2 (DYRK2), transcript variant 1 Homo sapiens mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 5 (MAPKAPK5), transcript variant 1 Homo sapiens mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 5 (MAPKAPK5), transcript variant 2 Homo sapiens mitogen-activated protein kinase kinase 2 (MAP2K2)
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K07111 K07112 K07116 K07118 K07121 K07122

NM_025233 NM_170693 NM_007194 NM_017593 NM_004336 NM_005308

Homo sapiens Coenzyme A synthase (COASY), transcript variant 1 Homo sapiens serum/glucocorticoid regulated kinase 2 (SGK2), transcript variant 1 Homo sapiens CHK2 checkpoint homolog (S. pombe) (CHEK2), transcript variant 1 Homo sapiens BMP2 inducible kinase (BMP2K), transcript variant 2 Homo sapiens BUB1 budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog (yeast) (BUB1) Homo sapiens G protein-coupled receptor kinase 5 (GRK5)

Gene TargetTM siRNA Set 产品目录?
Cat.No. K07125 K07126 K07128 K07130 K07131
K07132

ACCN No. NM_002648 NM_005030 NM_006374 NM_021643 NM_013254
NM_020247

Description Homo sapiens pim-1 oncogene (PIM1) Homo sapiens polo-like kinase 1 (Drosophila) (PLK1) Homo sapiens serine/threonine kinase 25 (STE20 homolog, yeast) (STK25) Homo sapiens tribbles homolog 2 (Drosophila) (TRIB2) Homo sapiens TANK-binding kinase 1 (TBK1) Homo sapiens chaperone, ABC1 activity of bc1 complex homolog (S. pombe) (CABC1), nuclear gene encoding mitochondrial protein Homo sapiens homeodomain interacting protein kinase 4 (HIPK4) Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 9 (MAPK9), transcript variant JNK2-a2 Homo sapiens CaM kinase-like vesicle-associated (CAMKV) Homo sapiens AXL receptor tyrosine kinase (AXL), transcript variant 1 Homo sapiens ribosomal protein S6 kinase, 90kDa, polypeptide 2 (RPS6KA2), transcript variant 1 Homo sapiens tribbles homolog 3 (Drosophila) (TRIB3) Homo sapiens cyclin-dependent kinase 4 (CDK4) Homo sapiens p21(CDKN1A)-activated kinase 6 (PAK6) Homo sapiens amyotrophic lateral sclerosis 2 (juvenile) chromosome region, candidate 2 (ALS2CR2) Homo sapiens PDZ binding kinase (PBK) Homo sapiens serine/threonine kinase 32B (STK32B)
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K07133 K07136 K07137 K07138 K07141 K07142 K07143 K07144 K07145 K07146 K07148

NM_144685 NM_002752 NM_024046 NM_021913 NM_021135 NM_021158 NM_000075 NM_020168 NM_018571 NM_018492 NM_018401

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K07150 K07151 K07152 K07154 K07155 K07158 K07160 K07161 K07162

NM_018343 NM_017988 NM_017719 NM_016281 NM_016123 NM_014683 NM_014413 NM_014365 NM_014264

Homo sapiens RIO kinase 2 (yeast) (RIOK2) Homo sapiens SCY1-like 2 (S. cerevisiae) (SCYL2) Homo sapiens SNF related kinase (SNRK) Homo sapiens TAO kinase 3 (TAOK3) Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 4 (IRAK4) Homo sapiens unc-51-like kinase 2 (C. elegans) (ULK2) Homo sapiens eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 1 (EIF2AK1) Homo sapiens heat shock 22kDa protein 8 (HSPB8) Homo sapiens polo-like kinase 4 (Drosophila) (PLK4)

Gene TargetTM siRNA Set 产品目录?
Cat.No. K07163 K07164 K07166 K07168 K07169 K07170 K07171 K07172 K07173 K07174 K07175 K07176 K07177 K07178 K07179 ACCN No. NM_013257 NM_007284 NM_007199 NM_006712 NM_006622 NM_006281 NM_006285 NM_006296 NM_006296 NM_006252 NM_212539 NM_006255 NM_006213 NM_006182 NM_005990 Description Homo sapiens serum/glucocorticoid regulated kinase family, member 3 (SGK3), transcript variant 1 Homo sapiens twinfilin, actin-binding protein, homolog 2 (Drosophila) (TWF2) Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 3 (IRAK3) Homo sapiens Fas-activated serine/threonine kinase (FASTK), transcript variant 1 Homo sapiens polo-like kinase 2 (Drosophila) (PLK2) Homo sapiens serine/threonine kinase 3 (STE20 homolog, yeast) (STK3) Homo sapiens testis-specific kinase 1 (TESK1) Homo sapiens vaccinia related kinase 2 (VRK2) VARIANT 1 of Homo sapiens vaccinia related kinase 2 (VRK2) Homo sapiens protein kinase, AMP-activated, alpha 2 catalytic subunit (PRKAA2) Homo sapiens protein kinase C, delta (PRKCD), transcript variant 2 Homo sapiens protein kinase C, eta (PRKCH) Homo sapiens phosphorylase kinase, gamma 1 (muscle) (PHKG1) Homo sapiens discoidin domain receptor family, member 2 (DDR2), transcript variant 2 Homo sapiens serine/threonine kinase 10 (STK10)
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K07180 K07181 K07182 K07183 K07185 K07186
K07188

NM_005923 NM_005881 NM_005762 NM_005627 NM_000020 NM_005433
NM_005211

K07190 K07192 K07194 K07195

NM_005044 NM_004760 NM_004517 NM_004443

Homo sapiens mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5 (MAP3K5) Homo sapiens branched chain ketoacid dehydrogenase kinase (BCKDK) Homo sapiens tripartite motif-containing 28 (TRIM28) Homo sapiens serum/glucocorticoid regulated kinase (SGK) Homo sapiens activin A receptor type II-like 1 (ACVRL1), transcript variant 1 Homo sapiens v-yes-1 Yamaguchi sarcoma viral oncogene homolog 1 (YES1) Homo sapiens colony stimulating factor 1 receptor, formerly McDonough feline sarcoma viral (v-fms) oncogene homolog (CSF1R) Homo sapiens protein kinase, X-linked (PRKX) Homo sapiens serine/threonine kinase 17a (apoptosis-inducing) (STK17A) Homo sapiens integrin-linked kinase (ILK), transcript variant 1 Homo sapiens EPH receptor B3 (EPHB3)

Gene TargetTM siRNA Set 产品目录?
Cat.No. K07197 K07198 K07200 K07201 K07202 K07203 K07204 K07208 K07210 K07211 K07212 K07214 ACCN No. NM_004409 NM_004226 NM_004071 NM_004073 NM_003952 NM_003954 NM_003821 NM_003318 NM_003177 NM_003188 NM_003137 NM_003010 Description Homo sapiens dystrophia myotonica-protein kinase (DMPK) Homo sapiens serine/threonine kinase 17b (apoptosis-inducing) (STK17B) Homo sapiens CDC-like kinase 1 (CLK1), transcript variant 1 Homo sapiens polo-like kinase 3 (Drosophila) (PLK3) Homo sapiens ribosomal protein S6 kinase, 70kDa, polypeptide 2 (RPS6KB2), Homo sapiens mitogen-activated protein kinase kinase kinase 14 (MAP3K14) Homo sapiens receptor-interacting serine-threonine kinase 2 (RIPK2) Homo sapiens TTK protein kinase (TTK) Homo sapiens spleen tyrosine kinase (SYK) Homo sapiens mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7 (MAP3K7), transcript variant A Homo sapiens SFRS protein kinase 1 (SRPK1) Homo sapiens mitogen-activated protein kinase kinase 4 (MAP2K4)
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K07219 K07221 K07223 K07225 K07226 K07229 K07232 K07233 K07234 K07235 K07236 K07237 K07239 K07240

NM_002969 NM_002880 NM_002821 NM_002758 NM_002732 NM_002741 NM_002744 NM_002748 NM_002751 NM_002610 NM_002610 NM_002611 NM_002613 NM_002613

Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 12 (MAPK12) Homo sapiens v-raf-1 murine leukemia viral oncogene homolog 1 (RAF1) Homo sapiens PTK7 protein tyrosine kinase 7 (PTK7), transcript variant PTK7-1 Homo sapiens mitogen-activated protein kinase kinase 6 (MAP2K6) Homo sapiens protein kinase, cAMP-dependent, catalytic, gamma (PRKACG) Homo sapiens protein kinase N1 (PKN1), transcript variant 2 Homo sapiens protein kinase C, zeta (PRKCZ), transcript variant 1 Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 6 (MAPK6) Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 11 (MAPK11) VARIANT 1 of Homo sapiens pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 1 (PDK1), nuclear gene encoding mitochondrial protein Homo sapiens pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 1 (PDK1), nuclear gene encoding mitochondrial protein Homo sapiens pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 2 (PDK2) VARIANT 1 of Homo sapiens 3-phosphoinositide dependent protein kinase-1 (PDPK1), Homo sapiens 3-phosphoinositide dependent protein kinase-1 (PDPK1), transcript variant 1

Gene TargetTM siRNA Set 产品目录?
Cat.No. K07241 K07242 K07243 K07245 K07246 K07248 K07249 K07251 K07252 ACCN No. NM_002376 NM_002376 NM_002093 NM_002093 NM_002005 NM_001892 NM_001799 NM_001715 NM_001721 Description VARIANT 1 of Homo sapiens MAP/microtubule affinity-regulating kinase 3 (MARK3) Homo sapiens MAP/microtubule affinity-regulating kinase 3 (MARK3) VARIANT 1 of Homo sapiens glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3B) Homo sapiens glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3B) Homo sapiens feline sarcoma oncogene (FES) Homo sapiens casein kinase 1, alpha 1 (CSNK1A1), transcript variant 2 Homo sapiens cyclin-dependent kinase 7 (MO15 homolog, Xenopus laevis, cdk-activating kinase) (CDK7) Homo sapiens B lymphoid tyrosine kinase (BLK) Homo sapiens BMX non-receptor tyrosine kinase (BMX)
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K07253 K07255 K07256 K07258 K07260 K07261 K07262 K07263 K07264 K07266 K07268 K07269 K07271 K07281 K07282 K07285 K07286 K07287

NM_001744 NM_001619 NM_001319 NM_001261 NM_001274 NM_001203 NM_001211 NM_001105 NM_000459 NM_000294 NM_000222 NM_052841 NM_139033 NM_005424 NM_000906 NM_002730 NM_001315 NM_172115

Homo sapiens calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV (CAMK4) Homo sapiens adrenergic, beta, receptor kinase 1 (ADRBK1) Homo sapiens casein kinase 1, gamma 2 (CSNK1G2) Homo sapiens cyclin-dependent kinase 9 (CDC2-related kinase) (CDK9) Homo sapiens CHK1 checkpoint homolog (S. pombe) (CHEK1) Homo sapiens bone morphogenetic protein receptor, type IB (BMPR1B) Homo sapiens BUB1 budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta (yeast) (BUB1B) Homo sapiens activin A receptor, type I (ACVR1) Homo sapiens TEK tyrosine kinase, endothelial (venous malformations, multiple cutaneous and mucosal) (TEK) Homo sapiens phosphorylase kinase, gamma 2 (testis) (PHKG2) Homo sapiens v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog (KIT) Homo sapiens testis-specific serine kinase 3 (TSSK3) Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 7 (MAPK7), transcript variant 1 Homo sapiens tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 1 (TIE1) Homo sapiens natriuretic peptide receptor A/guanylate cyclase A (atrionatriuretic peptide receptor A) (NPR1) Homo sapiens protein kinase, cAMP-dependent, catalytic, alpha (PRKACA), transcript variant 1 Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14), transcript variant 1 Homo sapiens calcium/calmodulin-dependent protein kinase (CaM kinase) II delta (CAMK2D), transcript variant 4

Gene TargetTM siRNA Set 产品目录?
Cat.No. K07290 K07294 K07295 K07296 K07297 K07298 ACCN No. NM_002595 NM_003331 NM_003993 NM_001954 NM_172127 NM_003215 Description Homo sapiens PCTAIRE protein kinase 2 (PCTK2) Homo sapiens tyrosine kinase 2 (TYK2) Homo sapiens CDC-like kinase 2 (CLK2), transcript variant 1 Homo sapiens discoidin domain receptor family, member 1 (DDR1), transcript variant 2 Homo sapiens calcium/calmodulin-dependent protein kinase (CaM kinase) II delta (CAMK2D), transcript variant 1 Homo sapiens tec protein tyrosine kinase (TEC)
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K07299

NM_139355

Homo sapiens megakaryocyte-associated tyrosine kinase (MATK),transcript variant 1

Virus
V07001 V07003 V07005 V07006 V07007 V07008 M38454 M38454 NC_001526 NC_001357 AY536759 AY676046 Hepatitis B virus , complete genome, CDS:1976..2656 Hepatitis B virus , complete genome, CDS:501..1058 Human papillomavirus - 16, complete genome Human papillomavirus - 18, complete genome SARS coronavirus BJ01 membrane protein mRNA, complete cds Influenza A virus strain (A/egret/Hong Kong/757.2/03(H5N1))membrane protein (M) gene, complete cds HIV-1 isolate 2931HA from Cameroon gag protein (gag) and pol protein (pol) genes, partial cds; and vif protein (vif), vpr protein (vpr), tat protein (tat), rev protein (rev), vpu protein (vpu), envelope glycoprotein (env), and nef protein (nef) genes, co West Nile virus, complete genome,Envelope protein West Nile virus, complete genome,RNA-dependent RNA polymerase West Nile virus, complete genome,non-structural protein

V07009 V07010 V07011 V07013

DQ826727 NC_001563 NC_001563 NC_001563

Others
M06022
M06061

NM_012131
BC013589

Homo sapiens claudin 17 (CLDN17) Homo sapiens myeloid differentiation primary response gene (88),mRNA (cDNA clone MGC:9601 IMAGE:3900951), complete cds

Gene TargetTM siRNA Set 产品目录?
Cat.No. M06063 M06085 M06103 ACCN No. Description NM_173394 Mus musculus TRIF-related adapter molecule TRAM (Tram) NM_001018055 Homo sapiens BRCA1/BRCA2-containing complex, subunit 3 (BRCC3),transcript variant 2 NM_006472 Homo sapiens thioredoxin interacting protein (TXNIP)
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M06119 M06235 M06236 M06237 M06239 M06245 M06246 M06278 M06310 BM07130
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BC000052 NM_199290 NM_032339 NM_005564 NM_001106 NM_005438 NM_005253 NM_005594 NM_004095 NM_138294

Homo sapiens peroxisome proliferator-activated receptor alpha Homo sapiens nascent polypeptide-associated complex alpha subunit 2 (NACA2) Homo sapiens chromosome 17 open reading frame 37 (C17orf37) Homo sapiens lipocalin 2 (oncogene 24p3) (LCN2) Homo sapiens activin A receptor, type IIB (ACVR2B) Homo sapiens FOS-like antigen 1 (FOSL1) Homo sapiens FOS-like antigen 2 (FOSL2) Homo sapiens nascent polypeptide-associated complex alpha subunit(NACA) Homo sapiens eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1 (EIF4EBP1) Homo sapiens expressed in prostate and testis (PATE)

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2. siRNA 化学合成 2.1 化学合成 siRNA 简介
化学合成 siRNA 是应用起来最方便的方法,客户只需提供 siRNA 序列或者 GeneID、Accession Number、基因名称等。 百奥迈科(Biomics)公司的 siRNA 使用国外最先进的仪器合成,同时配备了高容量的 HPLC 纯化仪。 单个靶点 siRNA 合成量一次性可放大到克(g)级,年产更达到公斤(Kg)级。产品经过严格质检,确保质量 并提供质量检查报告。 化学合成的 siRNA 与生物合成 siRNA 相比,有以下优点: 操作简便,研究人员得到合成好的 siRNA 后,进行简单的稀释处理即可实验。 转染效率高,相对于分子量较大的 DNA 质粒,其转染效率高。 对细胞的或者组织的毒副作用小。 可大规模制备,本公司的合成规模可达到克级 (一次合成量 1 - 100 g)。 特别适用于基因靶位点已确定,需要大量 siRNA 进行 siRNA 动物实验研究。 欢迎您使用 Biomics 的 siRNA 产品,我们始终为您提供优质热诚的服务!

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2.2 siRNA 设计 siRNA 序列的结构对 RNAi 实验的成功与否起着至关重要的作用。不同的 siRNA 序列,对基因的沉 默效率差异很大。因此,理性设计有效的 siRNA 就成为实验成功的关键因素之一。 本公司推荐考虑如下设计思想: 从起始密码子下游 50 - 100 个 nt 开始,避免 5'端或 3'端的 UTRs,搜索 AA (N19) 序列。因为这些区 域结合了大量的调控蛋白,可能会影响 siRNA 发挥作用。 分析 siRNA 两端能量分布 N19 序列 3'端垂悬两个 dTdT,该垂悬不与 mRNA 序列互补,使有义链 3’端更容易解链,从而增加 其沉默效率。 21 个碱基的 siRNA 单链序列如:5'-GGCCAGAGGUUGAAAGUGAdTdT-3' 对 mRNA 目标区域进行二级结构预测, 排除作用复杂的二级结构的 siRNA 序列。 因为二级结构越复 杂,siRNA 沉默效率越低。 下图表明设计的 siRNA 结构优势依次递增 a) < b) < c)

在 NCBI 数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行 Blast 对照,排除设计的序列和其他基 因的同源性,降低脱靶效应。 避免出现连续的多个 G 或 C,GC 含量最好在 30 – 55 %之间。 设计中,对 siRNA 两端的错配可以高度容忍,但中间的 5 - 11 位碱基的错配,对沉默效应会有较大 影响。 本公司专业技术人员免费帮您针对同一个基因设计 3 - 4 对 siRNA, 您只需提供基因的 Accession Number、 mRNA 序列或者 Gene ID 等信息即可,设计好后交您确认,如果抑制效率达不到 70 % (转染效率至少 90 %),我们免费重新设计和合成。

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2.3 百奥迈科(Biomics) siRNA 产品简介
● siRNA 合成: 本公司拥有 siRNA 合成所有核心技术和专业合成团队,合成规模达到克级 (一次合成量 1 - 100 g),不但能够满足细胞水平实验小试,更能满足动物实验中中试放大的要求。 ● 标记 可对 siRNA 两条链的 4 个末端进行多种标记物的标记, 包括 FAM、 Cy3、 Cy5、 胆固醇(cholesterol)、 Biotin 等,以便根据实验要求监测 siRNA 抑制特异性基因表达的效果。 ● 修饰: 提供 siRNA 的化学修饰,主要有 2’-羟基甲基化修饰,磷酸硫代修饰,氟代修饰等。 ● 纯化: HPLC 纯化。 ● 长度: 19-23nt,亦可根据设计要求合成相应长度的 siRNA。 ● 产品形式: 冻干粉 ● 储存和稳定性: 建议在- 20 °C 的环境中贮存,避免反复冻融,可保存 6 个月。荧光标记的 RNA 必须避光保存。 ● 技术数据表: 技术数据表与 siRNA oligo 一同交付,包括名称、序列、浓度、OD 和 nmols 的精确数量及纯化类 型。 ● 个性服务: 按照客户要求分装。 免费设计。 ● 运输: 1.5mL 冻存管,快递寄送。

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2.4 普通 siRNA oligo
Biomics 公司普通的 siRNA oligo 根据客户要求,采用脱盐、PAGE 或 HPLC 纯化的方法,有效 去除短、杂片段。客户只需用无 RNA 酶水稀释后即可使用。 我们为客户设计合成四个靶点的普通 siRNA,提高筛选出潜在的特异性抑制效率高的序列的机 会。
目录号 CS1004 CS1005 CS1010 CS1050 CS1100 CS1250 产品说明 普通 siRNA 普通 siRNA 普通 siRNA 普通 siRNA 普通 siRNA 普通 siRNA 规格 4 OD 5 OD 10 OD 50 OD 100 OD 250 OD 纯化方式 HPLC? HPLC? HPLC? HPLC? HPLC? HPLC? 价格

2.5 荧光标记 siRNA oligo
本公司可对 siRNA 两条链的 4 个末端进行多种标记物的标记,包括 FAM、Cy3、Cy5、胆固醇 (cholesterol)、Biotin。相对于未标记的 siRNA 具有转染情况可视的优点,通过流式细胞仪、荧光显 微镜、 激光共聚焦显微镜等可以观察到荧光标记的 siRNA, 方便优化转染条件、 siRNA 胞内定位等, 同时可根据对转染过程的全程追踪来分析转染和蛋白表达下调的关系。研究表明,反义链 5'端标记 会影响干扰效果,其他三个末端修饰后对沉默活性几乎没影响,目前公认最好的是将荧光修饰标记 在正义链的 5'端位点。5'-荧光标记的 siRNA 有助于直接观察 siRNA oligo 的转染效率。本公司提供 的 5'-荧光标记的 siRNA oligo 通常用 FAM 进行标记。
目录号 CS2004 CS2005 CS2010 CS2050 CS2100 CS2250 产品说明 Fluorescent dye labeled siRNA Fluorescent dye labeled siRNA Fluorescent dye labeled siRNA Fluorescent dye labeled siRNA Fluorescent dye labeled siRNA Fluorescent dye labeled siRNA 规格 5 OD 10 OD 25 OD 50 OD 100OD 250OD 纯化方式 HPLC? HPLC? HPLC? HPLC? HPLC? HPLC? 价格

2.6 化学修饰 siRNA oligo 根据客户的要求,Biomics 公司可提供 siRNA 的化学修饰,主要有 2’-羟基甲基化修饰,磷酸硫 代修饰,氟代修饰等。本公司拥有先进的 siRNA 化学合成的核心技术,特别是普通和修饰的 siRNA oligo 合成技术、 核酸荧光标记技术、 多种核酸化学修饰技术等。 合成的化学修饰 siRNA 解决了 siRNA 在转染实验中的稳定性问题,尽可能的使实验一次性获得最佳数据。

目录号 CS3004 CS3005 CS3010 CS3050 CS3100 CS3250
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产品说明 Chemically modified siRNA Chemically modified siRNA Chemically modified siRNA Chemically modified siRNA Chemically modified siRNA Chemically modified siRNA

规格 5 OD 10OD 25OD 50 OD 100 OD 250 OD

纯化方式 HPLC? HPLC? HPLC? HPLC? HPLC? HPLC?

价格

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2.7 miRNA 的化学合成 2.7.1 miRNA mimics 模拟生物体内源的 miRNAs,运用化学合成的方法合成,能增强内源性 miRNA 的功能。本公 司可以为客户提供不同长度、不同形式,由客户自行设计的 miRNA。我们公司也可以根据客户需 要,提供来自 sanger miRNA 数据库的 miRNA 序列(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences)。
目录号 CM1005 CM1020 CM2020 产品名 miRNA Molecule miRNA Molecule Customer - defined miRNA Molecule 规格 1OD 4OD 4OD 价格 修饰价格 询价 询价 询价

2.7.2 miRNA inhibitor 化学修饰的专门针对细胞中特异的靶 miRNA 的抑制剂。 应用该产品可检测 miRNAs 所调节的基 因表达和对信号通路的影响,对阐明 miRNA 在诸如细胞发育、增殖、分化和凋亡中的机理有重要意 义,加速 miRNA 基因沉默效应的研究。它可以特异的靶向和敲除单个的 miRNA 分子。使用 miRNA inhibitor 可以用筛选 miRNA 靶位点;筛选调控某一基因表达的 miRNA;筛选影响细胞发育过程的 miRNA。

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2.8 RNAi 系列优惠套餐 客户只需要提供基因序列、GeneID 或者 Accession Number,我们免费设计、选择合适的位点,保证 至少一对可以有效的抑制相应基因的表达,抑制效率在 70 %以上 (转染效率至少达 90 %)。若未筛选出 有效的 siRNA 片段,本公司为您免费再次设计和合成! Biomics silence siRNA Set I: (目录号:CT0001)
产品说明 相应基因的 siRNA oligos 阴性对照 siRNA oligos FAM 标记阴性对照 siRNA oligos RNAi 阳性对照 siRNA oligos 3 位点 1对 1对 1对 规格 2 OD 1 OD 1 OD 1 OD 纯化方式 HPLC? HPLC? HPLC? HPLC?

Biomics silence siRNA Set II: (目录号:CT0002)
产品说明 相应基因的 siRNA oligos 阴性对照 siRNA oligos FAM 标记阴性对照 siRNA oligos RNAi 阳性对照 siRNA oligos 规格 纯化方式 HPLC? HPLC? HPLC? HPLC?

4 位点
1对 1对 1对

4 OD 1 OD 1 OD 1 OD

Biomics silencer siRNA Set III: (目录号:CT0003)
产品说明 相应基因的 siRNA oligos 阴性对照 siRNA oligos FAM 标记阴性对照 siRNA oligos RNAi 阳性对照 siRNA oligos 转染试剂 引物 1对 3 位点 1对 1对 1对 规格 2 OD 1 OD 1 OD 1 OD 100 ?L 1 OD HPLC 纯化方式 HPLC? HPLC? HPLC? HPLC?

Biomics silencer siRNA Set IV: (目录号:CT0004)
产品说明 相应基因的 siRNA oligos 阴性对照 siRNA oligos FAM 标记阴性对照 siRNA oligos RNAi 阳性对照 siRNA oligos 转染试剂 引物 1对 4 位点 1对 1对 1对 规格 4 OD 1 OD 1 OD 1 OD 100 ?L 1 OD 纯化方式 HPLC? HPLC? HPLC? HPLC? HPLC? HPLC?

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2.9 siRNA 对照 一个完整的 siRNA 干扰实验必须使用阴、阳性对照以及转染试剂等来确定设计的 siRNA 序列对于 基因的特异性沉默。 2.9.1 阴性对照 阴性对照 siRNA,是不会引起任何基因的沉默。实验中使用阴性对照能够帮助我们确认基因表达水 平的降低是否是序列特异性的 RNAi 的结果。由于 siRNA 的合成方法、工艺以及转染试剂等因素可能导 致广泛的基因沉默现象。如果没有阴性对照,研究人员很可能错误地将广泛的、非特异性基因沉默当作 由 RNAi 引起的基因特异性沉默。 本公司提供 和哺乳动物基因序列无同源性的通用阴性对照。 和哺乳动物基因序列无同源性的末端荧光标记 (5' - FAM) 的通用阴性对照, 方便我们使用流式细胞 仪、 荧光显微镜、 激光共聚焦显微镜等观察 siRNA 的转染情况, 从而优化转染条件, 提高转染效率。 与靶点 siRNA 序列有相同碱基组成,但排序不同且和 mRNA 无同源性的阴性对照;根据客户要求 进行合成。
目录号 CN1001 CN2001 产品说明 universal negative control siRNA FAM negative control siRNA 规格 2.5 nmol 2.5 nmol 纯化方式 HPLC HPLC 价格 交货期 2 个工作日 2 个工作日

2.9.2 阳性对照 阳性对照是已知的可以高效沉默特定基因的 siRNA, 阳性对照作为一个实验的系统检查是很重要的。 当 siRNA 阳性对照达到预期实验结果时,就能说明转染、RNA 的提取和基因表达检测方法是可靠的。 本公司提供多种阳性对照,具体见下表:
目录号 CP0001 CP0002 CP0003 CP0004 CP0005 CP0006 CP0007 CP0008 目录号 CP0000 靶基因 Lamin A/C Beta-Actin GAPDH GFP - 22 Green fluorescent protein Luciferase GL2 Luciferase GL3 Mm / Hs _ MAPK1 rat Rn _ Mapk1 产品说明 Positive control siRNA 规格 2.5 nmol 纯化方式 HPLC 价格 物种 Human Human Human Not specified Not specified Not specified Human and mouse Rat 交货期 2 个工作日

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3.RNAi 病毒包装 3.1 腺病毒包装 3.1.1 特点: 1) 几乎可以感染所有类型的细胞。 2) 可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒。 3) 病毒滴度高,产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL,能有效的进行增殖。 4) 腺病毒载体感染宿主的范围比较广,制备容易,操作简单. 5) 感染细胞时,不整合到染色体中,不存在激活致癌基因或插入突变等危险,生物安全性高。 3.1.2 原理: 腺病毒 (Adenovirus,Ad) 是一种无包膜的线状双链 DNA 病毒,其复制不依赖于宿主细胞的分 裂。有近 50 个血清型,大多数 Ad 载体都是基于血清型 2 和 5,通过转基因的方式取代 E1 和 E3 基 因,降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达 E1 和 E3 基因的细胞中复制,因此是一种 适用于治疗的高效控制系统。 3.1.3 腺病毒包装简要流程 (以 Invitrogen 包装系统为例) 1) 构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体。 2) 采用 PacI 消化纯化的质粒。 3) 消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞,收获细胞以制备病毒粗提液。 4) 将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。 5) 分装,- 80 oC 保存。 6) 滴度测定目的基因检定,并出具检测报告。 3.1.4 本公司提供的最终产品包括: 1) 重组后的腺病毒载体质粒以及测序图谱。 2) 产品无菌检测结果。 3) 腺病毒储液及相应的病毒滴度。 我们保证:1) 制备的病毒颗粒携带片段的正确性 2) 病毒颗粒的总数和病毒滴度:如无特殊要求我们 提供 1mL 滴度为 1×1010 - 1×1012 个病毒基因组 / mL 的病毒储液。

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3.2 慢病毒载体包装服务 3.2.1 特点: 1) 直接包装成为假病毒颗粒,对分裂和非分裂细胞均有感染作用,适合 RNAi 研究和体内实验中 难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。? 2) 可以通过简单方式,在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3) 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。? 4) 无需任何转染试剂,操作简便。 5) 可以根据客户需要制备多种标记。 3.2.2 原理: 慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种。构建的 siRNA / miRNA 慢病毒载体,与化学合成的 siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比,一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用, 另一方面,Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后,可用于感染依靠传统转染试剂难于转 染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞 的基因组,进行长时间的稳定表达。 3.2.3 慢病毒包装简要流程: 1) 含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2) 慢病毒载体,包装系统共转染病毒包装细胞。 3) 培养 48hrs - 72hrs 左右,收集含有病毒的上清培养液。 4) 病毒的纯化和浓缩。 5) 分装、- 80 oC 保存。 6) 滴度测定目的基因检定,并出具检测报告。 3.2.4 本公司提供的最终产品包括: 1) 重组后的慢病毒载体质粒以及测序图谱。 2) 产品无菌检测结果。 3) 慢病毒储液及相应的病毒滴度。 我们保证:1) 制备的病毒颗粒携带片段的正确性 2) 病毒颗粒的总数和病毒滴度:如无特殊要求我 们提供 1mL 滴度为 1×107 - 1×108 / mL 的病毒储液。

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3.3 其他类型病毒载体包装? ? 病毒包装的 siRNA 基因能否对目的靶基因进行有效基因沉默,依赖于外源基因在受体中高效、稳定 的表达,而这在很大程度上取决所采用的载体系统。 本公司除了可以进行腺病毒包装和慢病毒包装,还可以进行其他类型病毒包装 (逆转录病毒载体的 包装、腺相关病毒包装等)。 3.3.1 逆转录病毒 逆转录病毒 (Retrovirus) 是一类已知的 RNA 病毒。需在逆转录酶的作用下首先将 RNA 转变为 cDNA,再在 DNA 复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。该载体系统有两部分组成,一是 带有外源基因的重组反转录病毒载体分子,二是能以反式提供病毒结构蛋白的包装细胞,其要求是能高 效产生感染靶细胞的重组病毒颗粒, 且无野生型的反转录病毒存在, 后者是基因治疗安全性的关键问题。 逆转录病毒载体最大优点是: (1) 转染范围广,可以感染各种细胞类型,如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等; (2) 转入的外源基因可完全整合; (3) 对细胞感染率高,达到 100 %; (4) 感染细胞不产生病变,可建立细胞系长期持续表达外源基因。 逆转录病毒载体的不足之处,如: (1) 只能整合至分裂期细胞; (2) 可插入外源基因片断小(<10kb) ,难以满足较大基因的插入; (3) 病毒滴度是限制临床应用的主要方面; (4) 有产生野生型病毒或辅助型病毒的可能,随机整合可能产生不良作用。 3.3.1 腺相关病毒 腺相关病毒因其能将外源基因定点整合至宿主细胞上,因而具有一般病毒载体所不具有的特性。腺 相关病毒(Adeno - associated virus,AAV)单链 DNA 病毒,是一种缺陷型病毒,只有与腺病毒、单纯 疱疹病毒等共感染时才能进行有效复制。 与其他载体病毒相比,腺相关病毒的特点: (1) AAV 无致病性,并且在受染体上不会引发免疫反应; (2) 宿主范围广,并可感染非分裂细胞; (3) AAV 载体可将外源基因定点整合到人类 19 号染色体长臂,基因表达稳定; (4) AAV 是一种无包膜病毒,对各种理化处理稳定,易于分离纯化。 腺相关病毒也有一些缺陷,如病毒滴度低,感染效率低,外源基因容量小及病毒对细胞毒性。

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4. 哺乳动物细胞 siRNA 转染
4.1 转染方法: 将制备好的 siRNA、 siRNA 表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以 下几种:磷酸钙共沉淀;电穿孔法;DEAE-葡聚糖和 polybrene;机械法;阳离子脂质体 试剂。目前用的最多的是阳离子脂质体法。 4.1.1 磷酸钙共沉淀 将氯化钙,RNA(或 DNA)和磷酸缓冲液混合,沉淀形成包含 DNA 且极小的不溶的 磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA 复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉 淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。 在实验中使用的每种试剂都必须小 心校准, 保证质量, 因为甚至偏离最优条件十分之一个 pH 都会导致磷酸钙转染的失败。 4.1.2 电穿孔法 电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。 将细胞悬浮液置于电场 中会诱导沿细胞膜的电压差异,据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和 场强的优化对于成功的转染非常重要, 因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地 伤害细胞膜而裂解细胞。一般,成功的电穿孔过程都伴随高水平(50%或更高)的毒性。 4.1.3 DEAE-葡聚糖和 polybrene 带正电的 DEAE-葡聚糖或 polybrene 多聚体复合物和带负电的 DNA 分子使得 DNA 可以结合在细胞表面。通过使用 DMSO 或甘油获得的渗透休克将 DNA 复合体导入。两 种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。 4.1.4 机械法 转染技术也包括使用机械的方法,比如显微注射和基因枪(biolistic particle) 。显微 注射使用一根细针头将 DNA,RNA 或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压 microprojectile 将大分子导入细胞。 4.1.5 阳离子脂质体试剂 在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时,其可以形成微小的(平均大小约 100-400nm)单层脂质体。这些脂质体带正电,可以靠静电作用结合到 DNA 的磷酸骨 架上以及带负电的细胞膜表面。 因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质 体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂,DNA 并没有预先包埋在脂质体中,而是 带负电的 DNA 自动结合到带正电的脂质体上,形成 DNA-阳离子脂质体复合物。据称, 一个约 5kb 的质粒会结合 2-4 个脂质体。被俘获的 DNA 就会被导入培养的细胞。现存 对 DNA 转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。

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4.2 转染步骤: 4.2.1. 转染的一般性指导 (以 Invitrogen 的 Lipofectamine? 2000 为例) 1) 为了获得最佳基因阻断结果, 每一种细胞系转染 siRNA 的量都需要经过实验 确定。如果您是首次转染您的细胞系,推荐尝试使用几个 Lipofectamine? 2000 的浓度, 并在 20-100nM 范围内改变 siRNA 的浓度,以确定达到最佳基 因阻断水平所需要的条件。高浓度的 siRNA 可能具有细胞系依赖性。 (注: 我们推荐开始时使用 40nM siRNA。 ) 2) 在 30-50%细胞汇合度时进行转染。 通常基因沉默分析至少要在转染后 24-72 小时进行。低密度转染细胞可以使转染和分析之间更长的间隙更长,从而使 由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。根据靶基因的特性,高 密度转染的细胞可能更加适合条件的优化。 3) 不要在转染时的培养基中加入抗生素,因为这将会降低细胞转染的效率和导 致细胞死亡。 4) 为了获得更好的结果,可以使用 Invitrogen 的 Opti-MEM 低血清培养基在形 成复合物前稀释 Lipofectamine? 2000 和 siRNA。 5) 可以使用荧光标记的 siRNA 帮助优化细胞系的转染条件*。一旦确定了用来 转染的最佳条件,可以在每一次实验都包括荧光标记 siRNA,作为转染效率 的指示剂。 *化学合成荧光标记 siRNA 的种类(对应的页码和目录号) 4.2.2 常规瞬时转染(以 24 孔板为例) 1) siRNA/shRNA 表达载体的转染 I.准备细胞: 贴壁细胞: 转染前 24 hrs, 500 ?L 无抗完全培养基中接种 0.5-2×105 个细胞, 在 转染时细胞融合度为 80 - 90%。 (注:铺板时要将细胞消化完全混匀,避免细胞堆 积生长。) 悬浮细胞:转染前 24 小时,在 500 ?L 无抗完全培养基中接种 0.5-2×105 个细 胞,转染时细胞数量应在 4 - 8×105/孔。 II.对于每个转染样品,按下面的方法准备: 用 50 ?L Opti-MEM 稀释 0.8 ?g 质粒 DNA,轻轻吹吸 3 - 5 次混匀。 轻轻颠倒混匀转染试剂,用 50 ?L Opti-MEM 稀释 2.0 ?L LipofectamineTM 2000,轻轻吹吸 3 - 5 次混匀,室温下静置 5 min。 混合转染试剂和质粒 DNA 稀释液,轻轻吹吸 3 - 5 次混匀,室温下静置 20 min。 转染复合物加入到 24 孔细胞板中,100 ?L/孔,前后轻摇细胞板混合均匀。 5% 转染 4 - 6 hrs 后可 将细胞板置于 37 oC、 CO2 培养箱中培养 18 - 48 hrs。 换新鲜培养基。

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A

B

? a:pRNAi-U6H1/Neo 质粒转染 BGC-823 细胞 48h 后 GFP 表达荧光图 b:PRNAI-CMV3.1/Neo 质粒转染 Hela 细胞 48h 后 GFP 表达荧光图

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2) siRNA 的转染(24 孔板为例) I.准备细胞: 贴壁细胞:转染前 24 hrs,在 500 ?L 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105 个细胞, 转染时细胞融合度为 30 - 50 %。 (注:铺板时要将细胞消化完全混匀,避免细胞堆 积生长。) 悬浮细胞:转染前 24 hrs,在 500 ?L 无抗培养基中接种 0.5 - 2×105 个细胞,转 染时细胞数量应在 4 - 8×105/孔。 II.对于每个转染样品,按下面的方法准备: 用 50 ?L Opti-MEM 稀释 siRNA (转染细胞的终浓度为 33 nM) ,轻轻吹吸 3 - 5 次混匀。 轻轻颠倒混匀转染试剂,用 50?L Opti-MEM 稀释 1.0 ?L LipofectamineTM 2000,轻轻吹吸 3 - 5 次混匀,室温下静置 5 min。 混合转染试剂和 siRNA 稀释液, 轻轻吹吸 3 - 5 次混匀, 室温下静置 20 min。 转染复合物加入到 24 孔细胞板中,100 ?L/孔,前后轻摇细胞板混合均匀。 细胞板置于 37 oC、5% CO2 培养箱中培养 18 - 48 hrs。转染 4 - 6 hrs 后可 换新鲜培养基。

转染示意图:
1 ○ 将 siRNA/DNA 和转染 试剂分别用 Opti-MEM 稀 释,5min 后混合,室温放 置 20min

2 ○将混合好的 siRNA Mix 加入培养液中转染

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附表:各种细胞培养板转染推荐用量
培养容器 96 孔板 24 孔板 12 孔板 6 孔板 60 mm 板 10 cm 板 培养 面积 0.3 cm2 2 cm 4 cm
2 2 2 2 2

共用试剂 铺板培养基 100 μL 500 μL 1 mL 2 mL 5 mL 15 mL 稀释培养基 2×25 μL 2×50 μL 2×100 μL 2×250 μL 2×0.50 mL 2×1.50 mL

DNA 转染 DNA 0.2 μg 0.8 μg 1.6 μg 4.0 μg 8.0 μg 24 μg 转染试剂 0.5 μL 2.0 μL 4.0 μL 10 μL 20 μL 60 μL

RNA 转染 RNA 5 pmol 20 pmol 40 pmol 100 pmol 200 pmol 600 pmol 转染试剂 0.25 μL 1.0 μL 2.0 μL 5.0 μL 10.0 μL 30.0 μL

10 cm 20 cm 60 cm

4.3 转染优化及注意事项: 为了达到高的转染效率,在转染实验过程中,需要注意以下几点: 1) 纯化 siRNA:在转染前要确认 siRNA 的大小和纯度。注意:化学合成的 siRNA 至少需要 PAGE 纯化,最好是 HPLC 纯化。 2) 避免 RNase 污染: 微量 RNase 就会导致 siRNA 实验失败。 由于实验环境中 RNase 普遍存在,如皮肤,头发,暴露在空气中的物品等。需要使用 DEPC 处理过的 耗材及试剂,保证实验每个步骤不受 RNase 污染非常重要 3) 健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性:生长状态良好的对数生长 期的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验稳定性。 4) 避免使用抗生素:推荐从细胞接种到转染后 72 小时期间避免使用抗生素。抗生 素会在穿透的细胞中积累毒素。 5) 选择合适的转染试剂:针对 siRNA 制备方法以及靶细胞类型的不同,选择好的 转染试剂和优化的操作对 siRNA 实验的成功至关重要。 6) 通过合适的阳性对照*优化转染和检测条件:对大多数细胞,看家基因(House Keeping Gene)是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的 siRNA 转入靶细 胞,转染 48 小时后统计对照蛋白或 mRNA 相对于未转染细胞的降低水平。 *我们公司的阳性对照的种类(目录及页码) 7) 通过标记 siRNA 来优化实验: 荧光标记的 siRNA 能用来分析 siRNA 稳定性和转 染效率。 A B

图:荧光标记的 siRNA 阴对照转染细胞转染效率图 A:Hochest 染色图 B:FAM-siRNA 转染结果图 30?
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5. mRNA 水平检测基因沉默
5.1 RNA 的提取 RNA 提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。 在有 EB 存在时, 完整未降解的 RNA 制品电泳图谱应可清晰看到 18S rRNA、 28S rRNA 两条带, 也应当能看到一条由 tRNA、 5.8S rRNA 和 5S rRNA 组成的、较模糊迁移较快的条带,且 28S rRNA 条带亮度应为 18S rRNA 的 1.5-2 倍。

附图:本公司 RISOTM RNA 抽提试 剂盒与其他公司产品的比较 Line 1、2、3:国内某 3 家公司 RNA 抽提试剂;Line 4:本公司 RISOTM RNA 抽提试剂;Line 5:国外某公司 RNA 抽提试剂

5.1.1 试剂耗材的准备: 1) 试剂: A. RNase-Free 水:配 0.01 % (v/v)的 Diethylpyrocarbonate(DEPC)溶液,室温保 持过夜,次日高压灭菌后,- 20 oC 保存。 B. 氯仿 (Chloroform),异丙醇(Isopropyl alcohol) ,分子生物学级别 C. 75% 乙醇 (用 DEPC-treated 水配制) 2) RNase 去除的耗材:用 0.01% (v/v) DEPC 溶液完全浸泡过夜,高压灭菌后烘干。 5.1.2 实验步骤: 1) 准备分离 RNA 的细胞: I. 悬浮细胞: 收集细胞,离心 200 g,5 min。吸出培养液。每 106 个细胞加入 1 mL Trizol 裂解 液,反复吹吸 3 - 5 次,室温下静置 10 min 后转移至干净的离心管中。 II. 贴壁细胞: 吸出培养液,每 10 cm2 生长面积的细胞加入 1 mL Trizol 裂解液,反复吹吸 3 - 5 次,室温下静置 10 min 后转移至干净的离心管中。 2) 加入 0.2 mL 氯仿(/ mL Trizol) ,振荡 15 sec 混匀后静置 2 min。 o 3) 在 4 C,12,000 g 离心 15 min,混合液分成三层。 (以下所有步骤用到耗材均需用 DEPC 处理并高压灭菌。 ) 4)小心吸取最上层的无色水层于干净的离心管中。 加入 0.5 mL 异丙醇 mL Trizol) (/ , 室温下静置 10 min。 ,振 5) 在 4 oC,12,000 g 离心 10 min,弃上清,加入 1 mL 75% 乙醇(/ mL Trizol) 荡混匀。 6) 在 4 oC,7,500 g 离心 5 min,弃上清。室温下完全干燥 5 - 10 min。 7)? 加入 RNase‐Free 水溶解 RNA 沉淀,分装后在? ‐?80?oC 保存。

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5.2 实时定量荧光 PCR 实时荧光定量 PCR(Real Time PCR,qRT-PCR)避免了传统 PCR 以终产物检测定量 产生的偏差,提高实验的重复性。与常规 PCR 相比,实时荧光定量 PCR 具有特异 性更强、有效解决 PCR 污染问题、自动化程度高等特点,已成为国际公认的核酸分 子定量的标准方法。该技术已被广泛用于检测细胞 mRNA 表达量的变化;比较不同 组织的 mRNA 表达差异;验证基因芯片,siRNA 干扰的实验结果。它涉及到 DNA 或 RNA 样品制备,反转录及 PCR 反应等一系列重要的分子生物学过程。

5.2.1 设计目的片段和内参基因的 qPCR 引物: 利用 Primer5.0 等软件设计 PCR 引物 及探针。我们公司免费为客户设计引物和探针。 5.2.2 SYBR Green 法:

1)建立以下反应体系 试剂(SYBR Green法) 总RNA qPCR mix(包含MLV、Hot-start Taq、dNTP等 ) SYBR Green I solution 上游引物,10μM 下游引物,10μM MgCl2 RNase-Free H2O 2) PCR 反应条件如下: 步骤 逆转录 失活 MLV,激活 Taq 实时荧光定量 PCR
*与引物的 Tm 相关

量 根据实验 终浓度为1× 终浓度为1× 终浓度:~200 nM 终浓度:~200 nM 根据实验 To 25.0 μl

循环数 1 1 40

步骤 1 1 1 2 3

温度 42 oC 95 oC 95 oC X oC* 72 oC

时间 30 min 10 min 15 sec 30 sec 30 sec

3) 取 5μl PCR 产物跑 1.5%琼脂糖凝胶电泳,或做溶解曲线,检测 PCR 产物的 特异性
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5.2.3

Taqman 法

1) 建立以下反应体系 试剂(Taqman法) 总RNA qPCR mix(包含MLV,Hot-start Taq、dNTP 等 ) Taqman Probe 上游引物,10μM 下游引物,10μM MgCl2 RNase-Free H2O 2) PCR 反应条件如下: 步骤 逆转录 失活 MLV,激活 Taq 实时荧光定量 PCR

量 根据实验 终浓度为1× 根据实验 终浓度:~200 nM 终浓度:~200 nM 根据实验 To 25.0 μl

循环数 1 1 40

步骤 1 1 1 2

温度 42 oC 95 oC 95 oC 60 oC*

时间 30 min 10 min 15 sec 1 min

5.2.4 实验完毕之后,将数据导入到 Excel 中进行数据分析。 5.2.5 结果分析: 利用 ΔΔCt 法,相对定量,将目的基因的表达与看家基因的表达对比,获得沉默 效果。如下图所示:

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6 蛋白质水平检测基因沉默 6.1 Western blot 6.1.1 Western blot 的介绍 1)原理 Western Blot 印迹法是把通过电泳分离的蛋白质组分从凝胶转移至一种固相支 持物,通过抗体与附着于固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生特异性反应进 行检测。Western Blot 既可以定性,又可以半定量,是初步鉴定靶蛋白表达的 最方便也是最通用的方法。

2)特点 ● 分辨率高,采用 SDS-PAGE 变性电泳 ● 灵敏度高,可检测到 pg 级 ● 准确性高,通过与内参蛋白比较对靶蛋白进行相对含量 3)实验流程(本公司采用湿转法)

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6.1.2 试剂耗材的准备: 1)转膜缓冲液(48 mM Tris-HCl,39 mM 甘氨酸,0.037% SDS,20%甲醇) : 甘氨酸 2.9 g Tris-HCl 5.8 g SDS 0.37 g 甲醇 200 mL 纯水 至 1000 mL 溶解后室温保存,溶液可重复使用 3 - 5 次 2)10 × 丽春红染液: 丽春红 S 三氯乙酸 磺基水杨酸 纯水 使用时将其稀释 10 倍。 3)TBS 缓冲液: 1 mol/ L Tris-HCl (pH 7.5) NaCl 纯水

2.0g 30.0 g 3.0 g 至 100 mL

10.0 mL 8.8 g 至 1000 mL

4)TBST 缓冲液(含 20%Tween20 的 TBS 缓冲液) : 20%Tween20 1.65 mL TBS 700 mL 混匀后即可使用,最好现用现配。 5)封闭液(含 5%脱脂奶粉的 TBST 缓冲液) : 脱脂奶粉 5.0 g TBST 100 mL 最好现用现配,用量以盖过膜面即可,一次性使用 6)一抗、二抗及抗体稀释液:参照说明书,以封闭液或 TBST 进行稀释。 7)底物显色液 ECL,4oC 避光保存,现用现配。 8)显影液和定影液 用水稀释 10 - 20 倍于铝盒中,可多次使用。室温避光存放。

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6.1.3 实验步骤: 1)蛋白样品制备:用细胞裂解液抽提蛋白,并测蛋白浓度。 2)取 1 mg 蛋白进行 SDS-PAGE。 。 3)转膜: (转膜缓冲液 4 oC 预冷备用,冷却装置于- 80 oC 冰箱冷冻备用) 4)将 2 张海绵垫、2 张滤纸、转膜夹子及玻棒浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。 5)戴上手套,剪一张与凝胶尺寸相近的 PVDF 膜(83 mm × 75 mm) ,左上角剪 一缺口作为标记,浸泡在盛有 20 mL 甲醇的平皿中约 15 sec,直到膜变半透 明。用纯水冲洗膜 2 次。浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。 6)SDS-PAGE 结束后,小心地剥下两块凝胶,一块用于考马斯亮兰染色观察电 泳情况,另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。海绵垫、滤纸、PVDF 膜及凝 胶的预平衡时间在 15 min - 1 hr 之间。 7)将转膜夹子打开,使黑的一面保持水平。按照海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤 纸和海绵垫的先后顺序铺垫,制备凝胶转移夹层。将膜与凝胶对齐。用玻璃 棒赶走气泡。 8)将夹子夹起来,扣紧,小心不要移动内层。放入电转槽中。使夹子的黑面对 槽的黑面,夹子的白面对槽的红面。 9)将电转槽放在冰水盒中。将预冻的冷却装置放入槽内。 缓慢倒入约 650 mL 转膜缓冲液。 10) 盖好盖子, 接上电源。 根据蛋白分子量来调节工作电流, 一般使用 100 V (350 mA) ,转移 60 - 90 min。 11)转膜结束后,断开电源,拆卸转膜夹子,逐一掀去各层。将膜用 1 × 丽春红 染色 5 min,用水冲洗 3 次,观察蛋白转印是否完全。同时也可将凝胶用考马 斯亮蓝染色,胶上无蓝色条带则说明蛋白转印完全。 12)免疫反应: I 封闭:用镊子将膜移至含有 25 mL 封闭液的平皿中,用脱色摇床室温缓慢 摇匀 2 hrs,或 4 oC 过夜。封闭完用 TBST 冲洗 5 sec。用吸水纸吸去残余 液。 II 一抗孵育:按照一抗说明书的推荐比例稀释一抗,使用 TBST 或封闭液稀 释。在一容器中,将 PVDF 膜浸没在抗体溶液里,室温下 2 hrs 或 4 oC 过 夜,摇床缓慢摇匀。 III 一抗孵育完后,用 TBST 室温下在摇床上洗 3 次,每次 10 min。 IV 二抗孵育: 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触, 室温下摇床缓慢摇匀 1 2 hrs。 V 二抗孵育完后,用 TBST 室温下在摇床上洗 3 次,每次 10 min。 13)显影和定影: I 将 ECL Plus 显色液的 A 液和 B 液在容器里体积混合, 根据膜的大小来确定 显色液的量,1 min 后,将膜与显色液充分接触。 II 反应 1 - 5 min 后,吸去膜上残余液,将膜转移至一干净保鲜膜上,包好, 放入压片夹中。 III 剪一张比膜尺寸稍大的 X 光片,打开压片夹,将 X 光片放在膜上,一旦 放上,便不能移动。关上压片夹,开始计时。 IV 根据信号强弱调整曝光时间,一般 1 - 5 min,也可选择不同时间多次压片 以达最佳效果。 V 曝光结束后,打开压片夹,将 X 光片迅速浸入备好的显影液中显影,待出
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现明显条带后,终止显影。一般 1 - 2 min(20 - 25 oC) 。 VI 显影结束后, 用水冲洗 X 光片, 放到定影液中, 定影时间一般为 5 - 10 min, 以胶片透明为止。 VII 用水冲洗去底片上残留的定影液,室温下晾干。

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附 1:细胞蛋白抽提 protocol 1 细胞裂解: 悬浮生长细胞:细胞冰水浴预冷,4 oC,200g 离心 10 min,用 1 倍培养基体积的预冷 PBS 离心洗细胞 1 次,加入 1/5 - 1/10 培养基体积的预冷细胞裂解液,根据需要加入 蛋白酶抑制剂。反复吹吸数次,冰上静置 10 min。 贴壁生长细胞:培养板 4 oC 预冷,用 1 倍培养基体积的预冷的 PBS 洗细胞 1 次,加 入 1/5 - 1/10 培养基体积的预冷细胞裂解液,根据需要加入蛋白酶抑制剂。用细胞刮 子将细胞刮下来,转移至干净的离心管,反复吹吸数次,冰上静置 10 min。 2 在 4 oC,14,000 g 离心 10 min。将离心管轻轻转移至冰上,转移上清至干净的离心管, 分装后保存于- 80 oC。 附 2:SDS-PAGE Protocol: 1 原理: SDS 是一种阴离子去污剂,破坏蛋白质分子间以及其它物质分子间的非共价键。蛋 白质分子与 SDS 充分结合形成带负电荷的复合物,其所带的负电荷大大超过了蛋白质 分子原有的电荷量, 消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异。 因此 SDS-PAGE 蛋白 质电泳迁移率主要取决于蛋白质及其亚基分子量的大小。 2 试剂: 2.1 考马斯亮兰染色液(1 L) : 考马斯亮兰 R- 250 1.0 g 甲醇 450 mL 冰醋酸 100 mL 纯水 450 mL 2.2 考马斯亮兰脱色液(1 L) : 甲醇 100 mL 冰醋酸 100 mL 纯水 800 mL 2.3 5× 蛋白上样缓冲液(10 ml)保存于 4 oC: Tris-HCl (1M,pH 8.0) 0.6 mL 50 %甘油 5.0 mL 10 % SDS 2.0 mL 2 - 巯基乙醇 0.5 mL 1 %溴酚蓝 1.0 mL 纯水 0.9 mL

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3 步骤: 3.1 根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度: 分离胶浓度 5% 7.5 % 10 % (X %) 分离范围 60 - 212 30 – 120 18 – 75 (KDa) KDa KDa KDa 3.2 配 X %分离胶 (10 mL) : A液 B液 D-H2O 10 % AP TEMED

12.5 % 15 – 60 KDa

15 % 15 – 45 KDa

X/3 mL 2.5 mL (7.5-X/3) mL 50 ?L

5 ?L(10 ?L,若 X % < 8 %)

3.3 配 5 %堆积胶(4 mL) : A液 C液 D-H2O 10 % AP TEMED

0.67 mL 1 mL 2.3 mL 30 ?L 5 ?L

3.4 蛋白样品的准备:取 20 ?L 蛋白样品于干净的 1.5 mL 离心管,加 5 ?L 蛋白上样缓 冲液后混匀,封口膜包裹离心管,沸水煮沸 10 分钟。 3.5 上样:吸取蛋白样品 10 ?L 于电泳孔中,静置 10 min。 3.6 电泳: 3.6.1 堆积胶:80 V 恒压电泳,至溴酚蓝染料跑出堆积胶。 3.6.2 分离胶:180 V 恒压电泳,至溴酚蓝跑出胶即可停止电泳。

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6.2 ELISA 6.2.1 原理: ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 结合在固相载体表 面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活 性,又保留酶的活性。受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的 方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。加入酶标记 的抗原或抗体,通过反应也结合在固相载体上。加入酶反应的底物后,底物被酶 催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,根据呈色的深浅 进行定性或定量分析。酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测 定方法达到很高的敏感度。 6.2.2 特点: 某些分泌型蛋白,用 siRNA 干扰后可以用 ELISA 进行检测。 6.2.3 ELISA 实验流程示图(以双抗体夹心法为例) :

6.2.4 试剂与耗材: 1) 包被缓冲液 (pH 9.6 Na2CO3 NaHCO3 dd H2O

0.05 M 碳酸盐缓冲液): 1.59 g 2.93 g 至 1000 mL

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2)洗涤缓冲液 (pH 7.4 0.15 M PBS): KH2PO4 Na2HPO4?12H2O NaCl KCl Tween - 20 dd H2O 3)稀释液: 牛血清白蛋白(BSA) 洗涤液 或 羊血清、兔血清等血清 洗涤液

0.20 g 2.90 g 8.00 g 0.20 g 0.50 mL 至 1000 mL

0.10 g 至 100 mL 10 mL 至 100 mL

: 4)终止液(2 MH2SO4) 178.3 mL dd H2O 浓硫酸 至 200 mL 在水中逐滴沿壁加入浓硫酸,边加边搅拌 5)底物缓冲液 (pH 5.0): 0.2 M Na2HPO4(28.4 g/L) 0.1 M 柠檬酸 (19.2 g/L) ddH2O 6)四甲基联苯胺(TMB)使用液: TMB (10 mg/5ml 无水乙醇) 底物缓冲液 0.75% H2O2

25.7 mL 24.3 mL 至 50 mL

0.5 mL 10.0 mL 32.0 μL

7)2,2’-连氮基-双-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺(ABTS)使用液: ABTS 0.5 mg 底物缓冲液 1.0 mL 3% H2O2 2 .0 μL 8)抗原、抗体和酶标记抗体:按说明书处理。 9)标准品:用稀释液稀释成梯度浓度溶液。 10)96 孔聚苯乙烯塑料板 (酶标板)。

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6.2.5 实验步骤(双抗体夹心法): 1)包被:用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为 1-10 μg/mL。在酶标板反应孔中 加 0.1 mL,4oC 过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗板 3 次,每 次 3 min。 2)加样:加一定浓度稀释的待检样品(同时做空白对照,阴性对照孔及阳性对照) 0.1 mL 于上述已包被的反应孔中,置湿盒中,37oC, 1 hr。用洗涤缓冲液 洗板 3 次,每次 3 min。 3) 加酶标抗体: 于各反应孔中, 加入新鲜稀释的酶标抗体 (经滴定后的稀释度) 0.1ml。 o 37 C,0.5 - 1 hr,用洗涤缓冲液洗板 3 次,每次 3 min。 4)加底物液显色:于各反应孔中加入现配的 TMB 底物溶液 0.1 mL,37 oC,10 - 30 min。 5)终止反应:于各反应孔中加入终止液 0.05 mL。 6)结果判定:将酶标板在酶标仪上,于 450 nm (若 ABTS 显色,读 410 nm),读数, 输出到 Excel 中。 7)以标准品浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,生成标准曲线和直线回归方程式,根 据公式计算未知样品的浓度,并记录。

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6.3? 免疫荧光

6.3.1 原理: 免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧 光素制成荧光标记物,再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组 织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光 素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿 色或桔红色),可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质、 定位,以及利用定量技术测定含量。
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6.3.2 特点: 直观便捷的观察到目的蛋白的原位表达情况,定位 siRNA 干扰的沉默效果。 可以结合图像分析软件对沉默效果进行定量。 6.3.3 试剂及耗材: 一抗:针对待检测的抗原;封闭血清,与二抗同源。标记二抗:针对一抗的荧光的 标记二抗 IgG。 6.3.4 实验步骤: 1)用 4 %多聚甲醛固定细胞,0.5 %Triton X-100 洗涤 3 次,每次 3 - 5 min。 2)用封闭血清封闭细胞 1 - 2 hrs ,0.5 % Triton X-100 洗涤 3 次,每次 3 - 5 min。 3) 稀释一抗 (根据说明书进行稀释), 滴加一抗, oC 40 min 或室温 2 hr s 或 4 oC 37 过夜。0.5 %Triton X-100 洗涤 3 次,每次 3 - 5 min。(或直接孵育带有荧光标 记的一抗) 4)稀释二抗 (根据说明书进行稀释),滴加二抗,37 oC 40 min 或室温 2 hrs。 0.5 %Triton X-100 洗涤 3 次,每次 3 - 5 min。 (对于直接带有荧光标记的一抗, 此步骤省略) 5)Hoechst 染色。 6)荧光显微镜下观察,拍照。 A: B:

图:Hela 细胞中 Lamin?A/C 的表达? A:Hoechst 染色? B、TRITC 标记的二抗? ? ? ?

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A:

B:?

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HCT‐8 细胞 48h 后 net‐1 的表达情况? A:Hoechst 染色? B、TRITC 标记的二抗?

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7.其他相关服务 7.1? ? 稳定细胞筛选服务:? ?

通过各种基因转染技术,靶基因导入哺乳动物细胞后,一般在转染后 48h,靶基因 即可在胞内表达。根据实验需要,可对靶细胞进行筛选,建立长期稳定表达靶基因的稳 定细胞系。根据真核表达载体中所带有的抗性标志,最常用的标志物有潮霉素 (Hygromycin)和新霉素(Neomycin) ,选用相应的药物筛选,得到稳定表达外源基因 的细胞系。 I 服务流程 A 筛选浓度测定:以 5 天左右,细胞大部分死亡,10~14 天细胞全部死亡时,最 低抗生素浓度为最佳筛选浓度。 B 细胞接种:转染前 24h 接种细胞,确保转染时细胞汇合度在 70%左右。 C 细胞转染:用阳性脂质体转染细胞。 D 抗生素筛选:用上述最佳筛选浓度筛选单克隆,并扩大构建稳定细胞系。 E 鉴定筛选结果:RT-PCR 或 Western Blot 检测。 II 客户提供以下材料 A 具有筛选标记的真核表达载体(可为客户构建) 。 B 待转染的细胞系及培养条件的说明(生长状态良好,可为客户代购) 。

小知识:

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G418 是一种氨基糖苷类抗生素,这种氨基糖类抗生素的结构和新霉素、庆大霉素、 卡那霉素相似,在分子遗传试验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。它通过抑制转座 子 Tn601,Tn5 的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞产生毒素 , 包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。当 neo 基因被整合进真 核细胞 DNA 后, 则能启动 neo 基因编码的序列转录为 mRNA, 从而获得抗性产物氨基糖苷 G418 结 构 磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有 G418 的选择性培养基中生长。

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7.2? ? 细胞增殖毒性检测服务:? ? 根据客户不同要求我们可以提供多种技术进行细胞增殖检测,包括 MTT,XTT,WST‐1, CCK‐8 等。? 服务流程 接种细胞,96 孔板,每孔 103 个~104 个细胞。? ? 处理:药物或其他处理。? ? 呈色:根据实验及细胞不同,继续培养几天,加入 1/10 培养液体积的检测试剂,继 续孵育 0.5~4h,终止培养。? 比色:选择对应的检测波长和参考波长,测吸光度。? ? 图:3 种试剂测细胞增殖的比较?

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表:3 种常用的细胞增殖毒性检测方法的比较
检测方法 价格

MTT
便宜

WST-1
较高

CCK-8


原理

主要用途 Formazan 水溶性 Formazan 颜色 检测波长 参考波长 检测灵敏度 检测时间 细胞毒性 试剂稳定性 大批量样品检测 便捷程度

细胞增殖及细胞毒性检测 差 深紫色 560-600nm >650nm 高 较长 高,细胞形态完全消失 一般 可以 一般

细胞增殖及细胞毒性检测 好 橙黄色 420-480nm >600nm 很高 较短 很低,细胞形态不变 较好 非常适合 比较便捷

细胞增殖及细胞毒性检测 好 橙黄色 420-480nm >600nm 最高 较短 很低,细胞形态不变 很好 非常适合 非常便捷

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7.3? ? 细胞凋亡检测服务? ?

细胞凋亡(Apoptosis):多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定,由基因控制的细胞 主动性死亡过程。多细胞生物体内,某些细胞的死亡是个体发育中一个预定的,并受到严格 程序控制的正常组成部分。不同于一般的细胞坏死(cell?necrosis)。? ? 生物学意义:凋亡是一个系统的并普遍地程序性过程,是机体清除无用的或不想要的细胞 的手段,凋亡与增殖对保持机体的动态平衡具有重要意义? ? 凋亡涉及到多种疾病的发病机制,对预防和治疗这些疾病具有重要意义? ? 过度凋亡:退化性疾病(老年性痴呆,帕金森综合症)病毒性疾病(艾滋病)等? ? 凋亡不足:肿瘤自身免疫紊乱(类风湿性关节炎),红斑狼疮等? ? ? ? 表:细胞凋亡与细胞坏死的比较? 细胞凋亡? 细胞坏死? 细胞膜出芽,冒泡但完整性好,活组织 细胞完整性破坏,成片细胞死亡,破坏 细胞形态? 中个别细胞死亡? 组织结构? 细胞肿胀,核淡染,凝固性坏死,无膜 过? ? ? ? 程? 固缩核,浓染胞浆,脱离。凋亡小体? 性小体? 细胞器? 细胞器未遭破坏,胞浆浓缩? 细胞器肿胀溶解? 染色质? 染色质致密,凝集或边集浓染? 染色质疏松变性粗糙? 染料排斥试验? 开始被排斥? 染料掺入(膜破坏或通透性↑)? 核酸内切酶作用 DNA 裂解为 200bp 或其 随机降解弥漫 ATP 膜损伤,? 氧自由基 DNA 破坏机制? 倍数片断(核孔裂开)? 损伤? 凋亡小体可被同种或异种细胞识别吞 吞噬细胞吞噬细胞碎片,溶解? 结局? 噬? 不引起炎症反应,迅速退化,无整个组 引起炎症反应,继发性组织损伤,诱发 组织反应? 织瓦解,不诱发组织的再生与修复,细 组织再生与修复,形成疤痕,坏死→补 胞生长增殖→凋亡? 偿性增生→细胞增殖? ? ? ? 正常细胞? ? ? ? ? ? ? ? ? 凋亡细胞? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
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凋亡具有生物复杂性,是多因素、多通路参与的过程,不能根据单一指标来判断细胞凋 亡,为了提高检测的“准确性”“特异性”和“灵敏度” 、 ,必须综合各种方法的优点,发 展多参数检测方法,多指标同时检测;? 凋亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同;而每个指征维持有一个时间段,所以需要在不 同的时间点进行采样,把握好应用中的关键环节,并注意各种影响因子,以保证检测结 果的准确性;? 凋亡检测一般先定性分析,再做进一步的量化测定。鉴定方法涉及细胞体系、死亡类型、 诱导剂、检测技术、手段和条件等,选择与之相关的检测方法,以提高检测的准确性和 精确性;? 为检测凋亡提供更加全面、准确、客观的实验依据,需充分了解各种方法的原理和特点, 对检测结果做出合理的判断和分析。? ? 细胞凋亡的检测方法主要有:? (1) 细胞形态学检测? (2) 核 DNA 片段检测? a) DNA?Ladder? b) Tunel 法? (3) 凋亡酶学检测:Caspase 活性检测? (4) 细胞膜改变检测:Annexin?V‐FITC 结合膜表 PS 实验? (5) 凋亡相关信号分子(mRNA? 和蛋白)检测:TNF-α,P53,BCl‐2 和 TFAR19 等? (6) 其他? a) 线粒体膜势能(ΔΨmt)的检测? b) 端粒酶活性检测等? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
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7.4? ? DNA 测序服务?

服务特色 ? 价廉:30 元/反应,样本量多可提供优惠价。 ? 高质:可读碱基数一般约 800 bp 或更长 (视样品质量而异),碱基准确率>99.9%。 ? 快速:本公司承诺 2-4 个工作日出结果。 送样需知 1. 质粒 DNA 的测序 a. 质粒溶于适量体积双蒸水中(不含 TE) ,电泳检测浓度在 200 ng/?l 左右, 10-20 μl。 b. 如有可能,同时提供 1 ml 含有相应质粒的菌液备用。 c. 大质粒必需注明载体长度。 d. 如提供质粒偏少需要公司转化时,收取质粒转化费用。 2. 菌液 a. 说明载体名称、抗生素类型、插入片段的长度及酶切位点情况,我们提供 Amp, Kan 及 Chl 四种抗生素。 b. 提供 1 ml 左右的菌液,于 Eppendorf 管中封口保存,防止交叉污染或渗漏。 c. 大量样品测序,建议尽量提供在固体培养基上穿刺培养的菌种。 d. 如果提供的菌体需特殊培养,或拷贝数较低,需转化等特殊处理的,将收取 一部分费用。 3. PCR 产物 (1) 未纯化的 PCR 产物 a. 注明 PCR 产物的长度,片段须大于 150 bp。 b. 取 2 μl 样品,电泳检测应为明亮的单一条带。 c. 提供 50 μl-100 μl PCR 扩增产物。 d. 同时请提供浓度大于 5 μmole 的 PCR 引物 10-20 μl,及其引物序列等信息。 (2) 纯化后的 PCR 产物 a. 建议用相关试剂盒纯化。最后的 PCR 产物须溶于去离子水中(不含 TE) 。 b. 浓度 30 ng/μl 左右,体积大于 10 μl。 c. 提供浓度大于 5 μmole 的 PCR 引物 10-20 μl,及其引物序列等信息。 注意事项 1.随机引物、简并引物等不适宜做测序引物使用。引物浓度要求不低于 5 pmole/μl(或 5 μ mole),体积大于 20 μl。尽可能提供引物全序列、 PCR 退火温度,以供参考。 2.PCR 扩增时,条带较弱的产物测序成功率较低。另外,小于 150 bp 的 PCR 产物不能直接 测序。建议克隆后测序。 3.长片段 DNA 的测序 (如粘粒等大于 20 kb 的 DNA 片段等),请提供纯化后的 DNA 大于 5 μg。此时每个反应的收费标准与普通测序不同,具体请咨询。

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8. RNAi 相关产品? 8.1 RISOTM RNA ISOlation ReagentRISOTM RNA 提取试剂 8.1.1 RISO 试剂包装规格 产品名称
TM

产品编号

规格 50 mL 100 mL

RISO RNA ISOlation BR0008 Reagent BR0009 (RISOTM RNA 提取试剂) 注意: 2-8 °C 避光保存 12 个月;可在常温下运输。

8.1.2 产品简介 RISO 是一种快捷方便的 RNA 提取试剂,可从细胞、组织等材料中提取 RNA。在样品处 理过程中,RISO 可完全充分裂解样品,同时保持 RNA 的完整性。加入氯仿离心后,溶液形 成上清层水相、中间层和下层有机相。取上清层,籍异丙醇沉淀回收 RNA;中间层用乙醇沉 淀可同时回收 DNA;有机相可用异丙醇沉淀回收蛋白。 RISO 试剂可用于少量样品 (如活检标本) RNA 提取, 也可用于大量样品 (如大组织器官) RNA 提取。 提取 RNA 整个过程方便快速, 可在一个小时内完成, 提取的 RNA 无蛋白和 DNA 的污染,纯度髙,可直接用于 Northern Blotting (RNA 印迹分析)、斑点杂交、进一步 Poly(A)+ (mRNA) 纯化、体外翻译、RNase 保护分析、RT-PCR、构建 cDNA 文库等各种分子生物学实 验。 8.1.3 主要特点: 1. 抗降解能力强:RNA 酶 (RNase) 在 RISO 中快速失活,确保 RNA 抽提高质、高量, 重复性好。 2. 细胞、组织均适用:适用于各种细胞和标本,对少量组织标本 (如活检标本) 尤其适 用。 3. 操作简捷、省时,即使对初次操作者亦适用。

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8.2 其他产 品: 8.2.1 Full-length cDNA clone (Including 5'UTR and 3'UTR) 拥有人类全长 cDNA 克隆共 600 多种,主要包括蛋白激酶家族基因,原癌基因等。 8.2.2 GenePools? cDNA 文库 本公司推出多种组织 (包括正常成人组织、 肿瘤组织、 大鼠正常组织、 小鼠正常组织) cDNA 的 文库产品。使用该文库进行特异性扩增能够高效获得目标基因。 8.2.3 动物组织及细胞株总 RNA 提供各种 mouse、rat、rabbit、hen 等主要组织器官(包括,如脑、心、肝、肺、肾等)的总 RNA 和常用人体细胞株的总 RNA 同时还可以为客户提供不同动植物组织的高质量 RNA 的 提取服务。 8.2.4 琼脂糖凝胶电泳 DNA 回收试剂盒 本试剂盒采用高效、DNA 特异性专一结合的硅胶膜吸附材料作为离心吸附柱。首先使含 有 DNA 片段的凝胶融化,随后在溶胶液存在的条件下,使用吸附柱特异性的吸附 DNA,去 除其他杂质。可回收 70bp - 10kb 片段。 产品名称 产品编号 规格 琼脂糖凝胶电泳 DNA 回 收试剂盒 BK0011 BK0012 50 次 200 次

8.2.5 质粒小抽试剂盒 本试剂盒采用碱裂解法裂解菌体,再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的 DNA。 离心吸附柱中采用的硅基质材料, 能高效、 专一吸附 DNA。 本试剂盒适用于从 1 - 5 mL 过夜培养的大肠杆菌 LB (Luria-Bertani) 培养液中,快速提取多至 20 μg 纯净的高拷贝质粒 DNA。使用本试剂盒提取的质粒 DNA 可适用于各种常规生物技术操作,包括酶切、PCR、 测序、连接、转化、文库筛选等。 产品名称 产品编号 规格 质粒小抽试剂盒 BK0121 BK0122 50 次 200 次

8.2.6 Taq 酶(Taq DNA Polymerase) 本公司生产的 Taq DNA 聚合酶是从克隆有重组 Thermus aquaticus DNA Polymerase 基因 的大肠杆菌经诱导表达后,经柱层析纯化获得的超纯高效率耐热 DNA 聚合酶,其分子量 为 94KD。 DNA Polymerase 具有 5’→3’DNA 聚合酶活性和 5’→3’外切酶活性, 3’→5’ Taq 无 外切酶活性。在 PCR 反应中,Taq DNA Polymerase 延伸速度为 1-2kb/分钟,能在 PCR 产 物的 3’端添加单个 dA。 产品名称 产品编号 规格   Taq 酶 (Taq DNA Polymerase) BP0601 BP0601 250U 1000U

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8.2.7 Pfu 酶(Pfu DNA Polymerase) Pfu DNA 聚合酶是一种高保真性的耐高温 DNA 聚合酶。 在模板及引物存在的条件下, Pfu 催化沿 5’- 3’方向 DNA 的合成。同时本酶还具有 3’ - 5’外切核酸酶活性(高保真) ,能纠正 DNA 扩增 (PCR) 过程中产生的错误。 是目前已发现的在所有耐高温 DNA 聚合酶中 PCR Pfu 反应时出错率最低的一种。错配率比 Taq DNA Polymerase 及其变体低 10 倍。其它高温 DNA 聚合酶与 Pfu 混合使用,可以部分降低产品的错误率,但是效果达不到单独使用 Pfu 的高保 真率。Pfu 被公认为是您首选的高保真性耐高温 DNA 聚合酶。 产品名称 产品编号 规格   Pfu 酶 (Pfu DNA Polymerase) BP0602 BP0602 250U 1000U

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