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RNAi+与基因沉默


基因沉默与RNA干扰技术

RNA interference (RNAi)

2006:Silence is golden. Andrew Fire (left) and Craig Mello learned that they'd won the Nobel Prize for their groundbreaking discovery of RNAi's gene-quelling power.

一、RNA interference 的发现
1995年,康奈尔大学的研究生Su Guo(郭苏)用 反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现, 反义和正义RNA都阻断了基因的表达。结果 出乎意料。 1998年,卡耐基研究院 Andrew Fire的研究证明, 在正义RNA也阻断了基因表达的试验中,真 正起作用的是微量双链RNA(污染)。是体 外转录正义RNA时生成的。这种双链RNA对 基因表达的阻断作用被称为RNA干扰(RNA interference,RNAi)

Discovery of RNAi
Nature 1998 391:806-811

Double-stranded RNA
sense antisense

Neg. control inject

Uninjected

C. elegans

Antisense RNA dsRNA Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization

早在1990年,Jorgensen等在研究如何增加 矮牵牛花的颜色时,观察到一种无法解释的现 象:通过添加过量色素基因拷贝来增加植物花 的着色,结果事与愿违,不但花未着色,反而 部分花变为白色。进一步的试验表明,这些导 入的基因不仅不表达,反而使植物本身的基因 表达也受到了抑制,即所谓的共抑制 (cosuppression)。

Phenomena first observed in petunia
Attempted to overexpress chalone synthase (anthrocyanin pigment gene) in petunia. (trying to darken flower color) Caused the loss of pigment.

An Unexpected Result
Late 1980s, Rich Jorgenson and group chalone synthase for deeper purple petunias Got white and variegated Co-suppression: both endogenous and introduced genes silenced [Napoli et al., 1990] PTGS – but what is the causative factor? Similar effects seen in N. crassa “Quelling” [Cogoni et al., 1996]

From: Gura,2000.

RNAi现象广泛存在于线虫,果蝇,斑马鱼,真菌以及植 物等生物体内,这些生物体利用RNAi来抵御病毒的感 染,阻断转座子的作用。

秀丽新小杆线 虫(C. elegans)

Par-1基因的功能

RNA i 发现的意义
小RNA(small RNA)发挥着基因调控的作用。能高效特 异的关闭基因的表达,或改变基因表达的水平。在发 育过程中通过关闭或开放基因的表达,小RNA可能指 导着细胞的定向分化。对PTGS、Knock-down、Knockout等新认识。效果更好,特异性更高。 被《Science》杂志评为2001年的十大科学成就之一。 2002年RNAi的研究又有了新的突破,发现它在基因表 达调控中发挥重要作用,它也名列2002年《Science》 杂志评的十大科学成就之首。

二、RNAi的机理

(一).参与RNAi反应的酶
Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一个成员。 RNA酶Ⅲ是一种 能切割双链RNA的酶。 Dicer酶参与RNAi反应,广泛存 在于蠕虫,果蝇,真菌,植物及哺乳动物。 结构中包括一个螺旋酶结构域,两个RNA酶Ⅲ结构 域,一个双链RNA结合位点。Dicer酶的作用下, 双链RNA被裂解成21到23个核苷酸的片断,称为 siRNA(short interference RNA),它启动了细胞 内的RNAi反应。 细胞内存在RNAi效应的扩增系统。能以RNA为模板指导 RNA合成的聚合酶(RNA-directed RNA polymerase, RdRP)。在RdRP的作用下,进入细胞内的双链RNA通过 类似于PCR的反应过程,呈指数级的数量扩增。

Dicer

? 2 RNA binding proteins ? RNA/DNA Helicase ? Translation Initiation Factor ? RNA-Dependent RNA Polymerase (RdRP) ? Transmembrane Protein

RISC

(二)、RNAi的反应过程
1.双链RNA进入细胞后,Dicer酶的作用下被裂解成siRNA; 2.在RdRP的作用下自身扩增后,再被Dicer酶裂解成 siRNA; 3.SiRNA的双链解开变成单链,并和某些蛋白形成复合物, 同与siRNA互补的mRNA结合,一方面使mRNA被RNA酶降解, 另一方面以SiRNA作为引物,以mRNA为模板,在RdRP作用下 合成出mRNA的互补链。 4.结果mRNA也变成了双链RNA,它在Dicer酶的作用下也被 裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作 用,通过这个聚合酶链式反应,细胞内的siRNA大大增加, 显著增加了对基因表达的抑制。 从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链 RNA都能诱发RNAi,长的双链RNA阻断基因表达的效果明 显强于短的双链RNA。

RNA interference – Mechanism
DICER - RNAse III, ds spec. endonuclease - Dimer, 2 catal. domains, helicase and PAZ motif - produce 2-3nt 3?overhangs - ATP-dependent ribonuclease



RISC

- RNA-induced silencing complex - RISC contains siRNA - precurser activated by ATP - find and destroy mRNA of complementary sequence - contains endo- and exonuclease, cleaves the hybrid in the middle imm. followed by degradation - ARO: PAZ domain (assembly)

复合物

Mechanism of dsRNA Gene Silencing
Dicer endonuclease enzyme dimer cleaves RNAi (RNAse III family) Small ~ 22 nucleotide RNAs assoc. w/ RISC (guide RNAs) Effector Nuclease = RISC (RNA-induced silencing complex) Latent RISC w/ ds siRNAs +ATP Active RISC w/ ss siRNAs – destroys target mRNAs
Fig. 2. Hannon Review

三、双链RNA的构建
双链RNA可先在体外构建好,然后转染细胞。
在体外构建双链RNA时,分别在体外转录出正义和 反义RNA,再将两者退火,形成双链RNA。体外合 成的双链RNA可以用脂质体,微注射,电击等转入 细胞中。但有些细胞脂质体转移效果差,转移到 细胞内的双链RNA半衰期短。

在体外构建能表达双链RNA的载体,再将载体 导入细胞内在细胞内合成出双链RNA。
能增加有效转染细胞的种类,而且在长期稳定表 达载体的细胞株中,双链RNA能够长期发挥阻断基 因的作用。

三、双链RNA的构建
用RNA聚合酶Ⅲ来指导RNA的合成。它有明确的启始和终止序列, 合成出的RNA不带polyA尾。遇到连续5个胸腺嘧啶时,转录就会 终止,转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来。U6启动子能被RNA 多聚酶Ⅲ识别, 合成RNA。 ShiYang等人用Bluescript作为载体,U6作为启动子,从绿色荧 光蛋白(GFP)的基因上选择了一个21个核苷酸的片断,插入到 Bluescript载体中。然后合成出该片断的反向重复序列,在其后 加了5个胸腺嘧啶,接到Bluescript载体中片断1的后面,将载体 转移到细胞中后,转录出的RNA由于具有回文序列,会形成一个 发卡样结构,从而得到了双链RNA。片断后面加了5个胸腺嘧啶, RNA转录到这个位置时就会终止。而且转录出的RNA形成发卡样结 构后,会在3’端形成2个突出的尿嘧啶,这类似于天然的siRNA, 因而有利于双链RNA诱发RNAi。

三、双链RNA的构建
RNA聚合酶Ⅲ还能识别H1-RNA 启动子。在H1-RNA 启动子后面接 上能形成发卡样结构的反向互补序列,将此载体转入细胞后也 能在细胞内合成dsRNA。 T7也可作为启动子合成dsRNA。将PCR产物用NotI酶切后自身连 结,回收正向片断和反向片断连结形成的具有反转重复序列的 片断,接到pGEM Teasy载体上,就构建成了可以表达dsRNA的载 体。
可先在体外合成dsRNA, 也可以将其转入到细胞内合成dsRNA。但须将能表达T7RNA聚合酶的载体 也一起转入到细胞中,以提供能识别T7启动子的RNA聚合酶。

腺病毒是体内转基因的常用载体。用腺病毒做载体,在体内和 体外表达dsRNA, 阻断了基因的表达,从而实现了成体动物的基 因敲除

RNAi – manufacturing

Vectors expressing siRNAs
U6

siRNA

H1

Vectors expressing siRNAs
U6

Sense sequence

Sense sequence

Anti-sense Anti-sense sequence sequence

Hair-pin loop

lentiviral construct for siRNAs

Rubinson et al Nature Genetics, 2003

Vectors expressing siRNAs
Plasmid-based vectors
Transient nature Low and variable transfection efficiency

Viral-based vectors
Highly efficient Better than plasmid-based

Pol II promoter-based plasmid vectors
Tissue specific

构建表达shRNA的质粒载体

编码多个shRNAs质粒表达载体

有公司近期又推出专利产品:一个载体编码6个 shRNA的构建服务,可以同时封闭2个以上的目标基 因了。 晶赛公司同时推出编码shRNA(1-6个)并表达La 蛋白的载体构建服务(根据已发表文献,La蛋白与 siRNA干扰目标基因效果密切相关。如果La蛋白低 下,siRNA效果低下甚至无效。)。

Mechanism of siRNA RNAi
2 step mechanistic model:
1.

Initiation step


Generation of siRNAs

2.

Effector step


Degradation of target mRNA

Initiation Step
ATP ADP + ppi DICER

ATP ADP + ppi

KINASE

RdRP

Effector Step
? siRNA binding ? siRNA unwinding ? RISC activation

siRNA
5’ 3’

3’

5’

RNAi and PTGS

RNAi = RNA i  nterference PTGS = Post Transcriptional Gene Silencing siRNA = small interfering RNA

Figure 2 Zamore,P.D. (2001) Nat. Struc. Biol. 9:746

四、RNA介导的基因沉默

RNA-Mediated Gene Silencing
Post-transcriptional Gene Silencing (PTGS) or RNA Interference (RNAi) Transcriptional Gene Silencing (TGS) (RNA-dependent DNA Methylation) Gene Silencing By MicroRNAs

Mechanism of RNAi: Gene Silencing directed by ~22nt RNAs
dsRNA processing ~22nt siRNAs recognition target mRNA degradation amplification spreading

copying + processing secondary siRNAs

Gene Silencing Factors
RDE-4 DICER DCR-1 CAF processing

AGO2 VIG recognition RDE-1 CG1800 AGO1 Fmr1 degradation

RISC

spreading

amplification RRF-1 SDE-1/SGS-2 copying + processing

SID-1

Drosophila

C. elegans

Arabidopsis

Different needs for different breeds
Prokaryotic cells and plants
dsRNA injection or transfection is fine for invoking RNAi

Eukaryotic cells
Not so fine

五、RNAi的应用
1.高通量的研究基因的功能 2.基因敲除 3.基因表达调控 4.病毒性疾病的治疗 5.遗传性疾病的治疗 6.肿瘤病的治疗
目前RNAi在非脊椎动物如线虫,果蝇,以及植物中的应用已 经取得了很多重要的成果,但在哺乳动物中的应用还处于起步阶 段。其中,RNAi不能完全阻断基因的表达,特别是表达异常高的 基因。运载体系一直是体内基因治疗的瓶颈,如何将双链RNA高 效特异的转入体内仍是一个难题。已能用腺病毒作为载体在体内 实现RNAi,但仍需要寻找更为安全有效的载体。

六、RNAi实践设计
(一)、Si RNA制备
RNAi的应用包括功能基因组学,药物靶筛选,细 胞信号传导通路分析等等。 制备siRNAs的方法目前为止较为常用的5种。 1. 化学合成 2. 体外转录 3. 长片断dsRNAs经RNase III 类降解 4. siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs 5. PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达 1.2.3.制备后,用合适的方法导入细胞。

六、RNAi实践设计
(一)、Si RNA制备
1.化学合成 化学合成是最贵的方法,却是最方便的。公司可 以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点 价格高,定制周期长,特别是有特殊需求的。 一个基因合成3—4对siRNAs ,可以用其他方法筛选出 最有效的序列再进行化学合成。降低成本。

六、RNAi实践设计
(一)、Si RNA制备
2.体外转录 得到DNA Oligo模版,RNA聚合酶体外转录,很快,一次体 外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,体外转录 得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs 较高浓度得到的效果(0.5-20 nM vs. 50-100 nM per transfection)

六、RNAi实践设计
(一)、Si RNA制备
3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA 其他制备siRNA的方法需要设计和检验多个siRNA序列以便 找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各 种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择200— 1000碱基的靶mRNA模版,用体外转录的方法制备长片断双链 dsRNA ,然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化,得到一 种siRNAs“混合鸡尾酒”。这个siRNA混合物就可以直接转染细 胞,方法和单一的siRNA转染一样。混合物中有许多不同的 siRNAs,通常能够保证目的基因被有效地抑制。

六、RNAi实践设计
(一)、Si RNA制备
4. siRNA表达载体 依赖3种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段 小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。人源和鼠源的U6启 需要2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载 体的pol III 启动子下游。 siRNA表达载体的优点带有抗生 素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达,

动子和人H1启动子。通过添加一串(3到6个)U来终止转录的。

六、RNAi实践设计
(一)、Si RNA制备
5. siRNA表达框架 siRNA expression cassettes,SECs 是一种由PCR得到的siRNA 表达模版,能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体 中。包括一个RNA pol III启动子,一段发夹结构siRNA,一个 RNA pol III终止位点。和siRNA表达载体不同的是,SECs不需 要载体克隆、测序等的步骤,可以直接由PCR得到。因此,SECs 成为筛选siRNA的最有效工具,如果在PCR两端添加酶切位点, 那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到载体 中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA 和长效抑制的研究。

Chemical synthesis of siRNAs
Sequence
50-100 bp downstream from start codon About 21 nucleotides: AA(N19)TT

GC content: 30-70% 5’ phosphate, 3’ hydroxyl

NATURE 2000 407: 21

(二)、 干扰作用的靶序列的选择
选择原则: mRNA 开放阅读框(ORF)区域作为设计双链siRNA 的作用靶 点; 从ORF 起始密码下游75~100 碱基位置开始,寻找“AA”二 连序列后的19 个碱基序列。最理想模式是:AA-N19-TT;为了 避免mRNA 调控蛋白的影响,3ˊ端和5ˊ端非编码区域不应作为 作用靶点;分析获得的序列,其中GC 含量比值为45~55%之间 的序列为优选;最后,在GenBank中经BLAST 全基因组扫描及序 列同源性分析,以确保所选靶序列与其他基因序列没有同源 性;通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA,经筛选找到最 有效的siRNA 序列。 还需设立阴性对照,同靶序列mRNA 无同源性,但同设计好的 siRNA 有相同的碱基组成。

(三)、选择转染方式
在植物中目前常用的转化方法都可以使用。
如何将制备好的siRNA 或siRNA 表达载体高效转导至哺乳动物 细胞和动物模型中去,是RNA干扰实验成功的关键性步骤。 1 磷酸钙共沉淀法:在pH 7.1 环境中,核酸分子带负电 荷,在静电引力的作用下,带正点荷的PO43- 与之结合。 当在溶液中加入CaCl2时, PO43-与Ca2+形成磷酸钙,并与 核酸分子共沉淀。磷酸钙-核酸复合物黏附到细胞膜并通过 胞饮进入目的细胞的细胞质。Shlomal在抗HBV的RNA干扰实 验中,就是采用CaPi方式将siRNA表达载体pSUPER或HBV表 达载体pHBV有效导入60%融合的Huh73细胞中,进而发挥特 异性的抑制作用的。 2 阳离子脂质体:在适宜条件下将阳离子脂质体试剂加入 水中,其可形成微小的单层脂质体,这些脂质体带正电, 可以靠静电作用结合到核酸分子的磷酸骨架上以及带负电 的细胞膜面,被俘获的核酸分子就会被导入培养的细胞。

(三)、选择转染方式
3 电穿孔法将待转染siRNA 或siRNA 表达载体与培养的哺乳动 物细胞混合,在高压脉冲电场作用下,细胞膜出现瞬时可 逆性穿孔,将外源siRNA 或表达载体导入细胞。电穿孔法 所需DNA量较少,转染效率也比较高。 4 显微注射法:用微吸管吸取siRNA 溶液,在显微镜下准确的 插入哺乳动物细胞核中,将siRNA 注射进去。最初针对果 蝇的RNAi 实验大多采用这种方式导入。 5 其它对构建成功的动物模型进行在体内RNA干扰实验时,一 些研究者采用将合成的siRNA表达载体经小鼠尾静脉大剂量 注射,这一方法的应用是把体外研究转入体内研究及实现 全身“投药”的重要转折,是加快进入临床药物研究的创新。

在哺乳动物中应用存在的问题
由美国科学家Sledz和瑞士科学家Bridge分别组 织进行的两项研究(Nature Cell Biol.20 03,5:834-839;Nature Genet.2 003,34:263-264)发现,RNAi技术中用 来阻断特定基因表达的双链RNA或短发夹RNA(shR NA),能够激活体内干扰素反应基因。 干扰素反应途径,是体内的一种抗病毒防御体系,当它被 激活后,就能够非特异性地全面抑制内源性mRNA的翻 译,并最终导致细胞凋亡。

The Problem in Mammals

RNaseL eIF2

Key: use 21-23 nt ds RNAs

Figure 1 Bass, B.L (2001) Nature 411:428

在哺乳动物中应用存在的问题
直到近几年,RNAi技术在大多数哺乳动物系统 中还是很不成功,主要是因为长双链RNA导入 抑制基因表达被哺乳动物的抗病毒系统包括 pKR和干扰素所影响。 最近Elbashir等研究者利用21-23bp双链RNA 绕过通常的阻碍的特殊的基因沉默技术。 这 种双链RNA由于其小于30bp将不会引起PKR系统 的活化。

RNAi in Mammalian Cells
? Long dsRNA triggers global (non-specific) gene-silencing (i.e. interferon response) ? Breakthrough: Short dsRNA (~22 nt) induces RNAi

Silencing of lamin proteins in human cells by dsRNA transfection
Nature 2001 411: 494-498

(四)、RNA 干扰作用的结果检测
siRNA 是否发挥了抑制作用以及抑制作用的大小,有赖于对实验 结果的精确检测。 1 靶基因表达水平的检测对转染细胞上清液或动物血清中靶基因 表达产物的检测多采用Western 印迹分析和ELISA检测试剂 盒;对转染细胞和组织中靶基因表达水平的检测可以采用免 疫组织化学方法;通过流式细胞术对siRNA作用之后靶基因的 蛋白表达水平定性和定量分析。 2 靶基因mRNA 水平的检测多采用Northern 印迹分析法及斑点杂 交技术检测RNA 改变情况,或者通过RT-PCR 方法进行定量分 析。 3 靶基因DNA 水平的检测多采用Sourthern 印迹分析法及斑点杂 交技术,或者通过PCR荧光定量进行分析。

RNAi 技术是近几年兴起的一项更有效、更特异、 更彻底的转录后基因沉默技术,应用RNAi在抗病 毒、抗肿瘤等领域的实验研究被不断开展,尤其 在抗HIV、抗HBV、抗HCV、抗鼠疱疹病毒和人乳头 瘤病毒等方面都已经取得了显著成果。但是, RNAi 毕竟是一新技术,实验过程中的每个环节都 需要进一步完善和成熟,只有这样,我们才能够 在前人实验的基础上,正确的分析问题和解决问 题,更加顺利的完成各个阶段的实验研究,使这 项技术早日成为研究有效工具。

“Cosuppression” (RNAi of an endogenous gene induced by a transgene insertion) was originally described in a transgenic petunia system that was intended to overexpress the chalcone synthase (CHS) purple pigment biosynthesis gene (Jorgensen and co-workers, Plant Cell 1990 2:279).

35S CHS cDNA promoter

Adding a Chalcone synthase gene from Petunia fused to a strong viral promoter to transgenic Petunia interfered with expression of the native homologous’ gene. Gene Silencing


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