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同源重组的细胞与分子机制 (1)


同源重组的细胞与分子机制
主讲人:陈峻松

content
结论与展望
02 01 03

文献分析

补充内容

同源重组的分子机制
A
DNA剪切的模型及具体过程;

B
C

各个复合物及其功能;

对5'端特异性剪切的验证

D

Dna2和Sgs1的剪切作用分析

E

MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析

F

RPA的作用分析

Model for the reconstituted DNA motor-driven end resection pathway
0. Spo11蛋白引发DNA双链断裂,产生无

端粒保护的末端;
1. MRX利用它对DNA末端高亲和性的特点, 与末端相连,启动剪切机制; 2. STR复合物驱动DNA双链分离; 3. Dna2蛋白与RPA结合,一同切割5'端的 单链; 4. RPA同时与暴露的3'链结合,防止DNA 双链重新结合,也防止3'端被降解。

①MRX与断裂处3'单链结合;
②STR在MRX的作用聚集在末 端; ③Sgs1从3'端向5'端运动,解旋 DNA; ④Dna2从5'端向3'端运动,逐渐 剪切5'端单链DNA;

⑤RPA在另一侧暴露的3'单链上 结合。

同源重组的分子机制
A
DNA剪切的模型及具体过程;

B
C

各个复合物及其功能;

对5'端特异性剪切的验证

D

Dna2和Sgs1的剪切作用分析

E

MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析

F

RPA的作用分析

各个复合物及其功能
?1.MRX:Mre11–Rad50–Xrs2 complex;
?2.STR: Sgs1–Top3–Rmi1 complex;
Sgs1解旋酶促进DNA链的分离,而Top3–Rmi1复合物和MRX一同起到促

进的效果。

?3.RPA:The ssDNA-binding protein replication protein-A;
保护3'末端不被降解,加强Dna2对5'的特异性剪切。

?4.Dna2:具有处理冈崎片段的功能,Dna2 核酸酶对剪切是必要的,而
Mre11 核酸酶并不必要。

对不同酶的作用分析
① 当Dna2, Sgs1或者RPA中的一个被 去掉时,DNA链几乎不被剪切;
② 在缺少Dna2的时候,底物任然能完 全解旋产生ssDNA,但在缺少Sgs1时 则不行;

③ DNA解旋一定程度上也依赖于RPA;
④ 缺少MRX或者Top3–Rmi1时DNA的 剪切效果被减弱。

同源重组的分子机制
A
DNA剪切的模型及具体过程;

B
C

各个复合物及其功能;

对5'端特异性剪切的验证

D

Dna2和Sgs1的剪切作用分析

E

MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析

F

RPA的作用分析

Reconstitution and 5' polarity of DNA end resection.
? B图:(a)对3'端标记的剪切效果与反应时 间的关系;(b)对5'端标记的剪切效果与 反应时间的关系;(c)三次平行实验的平均 值和标准差;

? C图:对5'端剪切产物的分析;

? D图:(a)未断裂和断裂的DNA双链及其一端 被生物素标记的分子;(b)这些底物在与A 中相同的酶切体系下反应五分钟并分析产物;

对5'端的剪切特异性分析
通过对比试验可以看出,酶切体系对于 5'端的剪切效率远高于3’端: ① 相同反应时间,5'端剪切更快; ② 如果在双链一端加上保护结构生物素链霉素亲和物,那么被保 护的5'端就不会被剪切,而另一端在反应5min后几乎完全被剪切;

③ 加保护物后最终产物含有5'端被保护的一条DNA单链;

其它验证剪切具有特异性的实验内容

1

超螺旋化的DNA不能被用 同样的酶组合剪切,这再 次证明了DNA剪切具有末 端特异性。

对5'端产物的分析

分别经过2min和5min后的5'端产 物:

①产物的大小从四到八个核苷酸。
②五核苷酸产物占绝对优势。

同源重组的分子机制
A
DNA剪切的模型及具体过程;

B
C

各个复合物及其功能;

对5'端特异性剪切的验证

D

Dna2和Sgs1的剪切作用分析

E

MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析

F

RPA的作用分析

DNA解旋对ATP的依赖性

DNA解螺旋需要ATP,而且不能 ATP-γ-S或者AMP–PNP代替。

1.DNA剪切对ATP水解具有依赖性。

Dna2和Sgs1解旋酶对DNA剪切的必要性

2.DNA马达Sgs1和Dna2中的任一者或两者的功能可能是必 需的。

3.利用两种酶的失活突变体dna2-K1080E和sgs1-K706A来判 断哪种酶是解螺旋所必需的。

4.用sgs1-K706A替换Sgs1导致剪切失效, 但dna2-K1080E代替Dna2正常剪切。

5.结论:Sgs1解旋酶活性而不是Dna2解旋酶活性 对于DSB解螺旋是必需的

负责剪切工作的具体蛋白是Dna2核酸内切酶
1 Dna2蛋白具有剪切3'或5'核酸内切酶的 活 性 , 而 M r e - 11 蛋 白 具 有 从 3 ' 到 5 ' 核 酸 内 切酶以及DNA结构特异性内切酶的活性。

2

用 失 活 的 D n a 2 - D 6 5 7 A 蛋 白 与 M r e 11 - 3 蛋白和3'端进行反应,我们发现是Dna2 核酸酶介导了剪切
即 使 加 入 锰 离 子 活 化 M r e 11 核 酸 酶 , 5 ' 端 的剪切依旧完全依靠Dna2。

3

Sae2蛋白与初始剪切相关联,但它的添 4 加不影响剪切的效率或产品尺寸

参与剪切的蛋白质分子特异性
1.用Srs2解旋酶(在DNA损伤中起修复作用)代替Sgs1, 用Fen1(参与冈崎片段处理的5'FLAP内切核酸酶, RAD27基因的产物)代替Dna2。

2. Srs2和Fen1无法进行正常的剪切。

3. Srs2的缺失对DSB剪切的发生率和程度没有影响,并 且RAD27基因不能弥补pif1-m2 dna2Δ细胞的远程剪切缺 失。RAD27过表达(YEp24)也不能弥补dna2Δ细胞的 剪切缺失。

同源重组的分子机制
A
DNA剪切的模型及具体过程;

B
C

各个复合物及其功能;

对5'端特异性剪切的验证

D

Dna2和Sgs1的剪切作用分析

E

MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析

F

RPA的作用分析

MRX和Top3–Rmi1的促进作用
1. MRX和Top3–Rmi1对剪切的影响被定 义为一定用量的Dna2和Sgs1对均匀标 记的DNA的剪切效率。 2. 尽管Sgs1 / Dna2 / RPA的组合能够介 导剪切,但MRX或Top3-Rmi1的添加 分别刺激反应大约四倍或八倍。 3. 最有效的剪切体系是MRX和Top3Rmi1两者均加入。
4. 单独的MRX或Top3-Rmi1可以刺激 Sgs1介导的3-kb底物的解旋(图C), 并且具有加和效应。

促进作用的具体机制
1. 通过His6标签(Nickel)或FLAG标签(a-FLAG) 下拉与FLAG-His6标记的Dna2或Sgs1,以测试它 们与MRX(a)或Top3-Rmi1复合物(b)的 结合程度。 2. MRX与Sgs1结合较强,也与Dna2结合。 3. 因为MRX会与DNA末端结合,所以它可能与 Sgs1和Dna2在DNA末端的聚集有关。这个理论 得到了实验的支持,因为已经预处理生成3'ssDNA末端的DNA可以被Sgs1–Dna2–RPA体系 高效地剪切,不论有无MRX。 4. Top3-Rmi1也与Sgs1结合,同时与Dna2之间有 较弱的相互作用。

Top3的作用
1. Top3-Rmi1和Sgs1共同作用可以 抑制有丝分裂交叉形成,这可能 是通过降解霍利迪连接体来实现。 2. 催化无效的top3-Y356F突变体不 影响剪切的效率。 与野生型 Top3对比可以证明top3-Y356F 突变体在剪切上没有缺陷。

3. 体外体系中,Sgs1,Rmi1和Top3均存在时 可以分解霍利迪连接体,但top3-Y356F突 变 体无法则无法做到。 4. top3-Y356F等位基因不能抑制top3Δ细胞中 较高水平的有丝分裂交叉。

5. 结论:Top3的催化活性对于控制交叉互换是 必要的,但对于DSB剪切是不必要的。

同源重组的分子机制
A
DNA剪切的模型及具体过程;

B
C

各个复合物及其功能;

对5'端特异性剪切的验证

D

Dna2和Sgs1的剪切作用分析

E

MRX和Top3–Rmi1的促进作用分析

F

RPA的作用分析

RPA的作用
1. 我们已经证实了DNA剪切对RPA的依赖,同时推测RPA通过分离由Sgs1产生 的ssDNA来促进DNA解旋。

2. 在没有Dna2的情况下,我们发现DNA解旋强烈依赖于RPA。同时,hRPA (human RPA)或大肠杆菌的SSB也能够促进DNA解旋,但是却没有剪切的 效果。

3. yRPA(yeast RPA)在剪切中也有独特的作用。 yRPA能够和Dna2发生结合 作用,但是hRPA和SSB都不具备这一能力。

作者提出猜测:hRPA和SSB可能抑制了酵母Dna2的核酸酶活性。

4. 为了验证yRPA在剪切中的特异性,我们使用了 带有标记的3'-或5'- ssDNA末端的部分双链 DNA底物来检查yRPA,hRPA和SSB如何影响 Dna2的核酸酶活性。

5. 结果发现,yRPA通过Dna2增强了对5'-DNA剪 切,同时抑制了对3'-DNA剪切。 6. 重要的是,hRPA和SSB对Dna2核酸酶功能确实具 有很强的抑制作用。

7. 部分缺陷的dna2-Δ405N突变蛋白与RPA的相互作用 较弱,受到yRPA的促进作用较弱,因此剪切效果明 显低于正常的Dna2。

总结:RPA促进了Dna2对5'端的特异性剪切, 同时通过与3'端单链相结合保护了3'端。

结论与展望
LOREM IPSUM DOLOR

1 2

剪切具有蛋白质特异性,特定的剪切酶不能被其它组合替代 DNA的解旋依赖于Sgs1蛋白 MRX利用它与DNA末端较高的亲和性,将Sgs1和Dna2聚集在 末端,从而高效地剪切。 To p 3 的 催 化 活 性 对 于 控 制 交 叉 互 换 是 必 要 的 , 但 对 于 D S B 剪 切 是 不必要的。

3
4 5

M R X 或 To p 3 - R m i 1 都 可 以 刺 激 S g s 1 介 导 的 解 旋 , 两 者 共 同 参 与 具 有 加 和 效 果 。

( 1 ) R PA 具 有 促 进 解 螺 旋 , 增 强 D n a 2 的 5 ' 核 酸 内 切 酶 活 性 , 保 护 3 ' - D N A , 强 化 对5'-DNA特异性剪切的能力。 6 ( 2 ) R PA 可 能 通 过 促 进 剪 切 起 到 更 早 激 活 对 重 组 区 域 检 测 的 作 用 。 这 样 , R PA 就 提供了一种将DSB末端处理与检测点激活相结合的手段。

7

重建系统有助于了解人类DSB切除的机制,因为有证据表明在易发生癌症 的Bloom综合征中,突变的Sgs1同源物BLM以类似方式参与DSB处理。

8

同时,检测在线粒体和细胞核中发现的人类Dna2蛋白是否也是以类似于酵母 Dna2的方式介导染色体末端剪切是有很大意义的。

其它补充内容

酿酒酵母中的两种剪切途径

1

需要核酸梅/解旋酶Dna2 ,和3'至5'解旋酶 Sgs1
2

由5'至3'双链DNA(dsDNA)外切核酸酶Exo1催化

MRX's different function in free end and blocked end
(1)free end ①The MRX complex is rapidly recruited to DNA ends upon break formation. ②The nuclease activity of Mre11 is not required for resection, but the MRX complex has a role to recruit components of the processive pathways that include either Sgs1-Dna2 or Exo1. ③In some cases, the structural role of the MRX complex can be bypassed.

(2)blocked end ①The MRX complex is rapidly recruited to DNA ends, which is followed by Sae2. ②The nuclease activity of Mre11 is required, and it cleaves endonucleolytically the 5’-terminated DNA strand away from the end in a reaction stimulated by phosphorylated (P) Sae2. ③Furthermore, MRX also likely recruits Sgs1-Dna2 or Exo1 to the endonuclease cut site. The endonuclease cut site provides an entry point for the Sgs1-Dna2 or Exo1 nucleases, which carry out long-range resection. ④The exonuclease of Mre11 then might degrade DNA in a 3’~5’direction back toward the DNA break.

LOREM IPSUM DOLOR
A B
MRX-Sae2复合物(MRXS)介导短程切除。 在敲除RAD50或MRE11基因的细胞中, Dna2 / Sgs1或Exo1介导的远程剪切以相同的速率发生,但是在起始剪切时存在延迟。

HO内切核酸酶产生断裂时,MRXS(Mre11-Rad50-Xrs2-Sae2)的作用可以被替代,再次证明 MRX的主要作用是产生3'-ssDNA,如果能够通过HO产生断裂,那么MRX的作用就可以被绕过。

C
D

Mre11-Rad50-Xrs2复合物(MRX)引发5'降解,而Sgs1和Dna2降解5'链,暴露长 3'链。敲除Sgs1和Dna2后,剪切减弱,但任然能够依赖Exo1进行远端剪切。

RPA不能被大肠杆菌中的SSB替代,这是因为RPA与Sgs1的结合具有物种特异性,虽 然Sgs1解旋DNA并不具有物种特异性。

1.Dna2和Sgs1之间也有相互作用, 所 以 由 D n a 2 - S g s 1 - R PA 催 化 的 切 除可能是协调一致的过程,Sgs1介 导的解旋和Dna2介导的剪切同时发 生; 2.Sae2蛋白可以与MRX一起完成初 始位置大约几百个bp的剪切,但是 更远处的剪切依赖于Dna2和Sgs1 或者Exo1; 3.正常的剪切体系是可以剪切到28kb距离 的,所以文献中将Sgs1和Dna2替换成 Srs2和Fen1后无法剪切Fen2(28kb),说 明远距离剪切失效了,而近距离剪切MAT (0kb)本身由MRX和Sae2就可以实现; 4.过表达RAD27可以起到抑制Dna2-1突 变体对于处理冈崎片段的缺少作用,但是 对于处理Dna2Δ造成的剪切失效并没有用。

参考文献
A
B C
Petr Cejka, Elda Cannavo, Piotr Polaczek,等. DNA end resection by Dna2-Sgs1-RPA and its stimulation by Top3-Rmi1 and Mre11-Rad50-Xrs2[J]. Nature, 2010, 467(7311):112.
Zhu Z, Chung W H, Shim E Y, et al. Sgs1 helicase and two nucleases Dna2 and Exo1 resect DNA double-strand break ends[J]. Cell, 2008, 134(6):981. Budd M E, Campbell J L. A yeast replicative helicase, Dna2 helicase, interacts with yeast FEN-1 nuclease in carrying out its essential function.[J]. Molecular & Cellular Biology, 1997, 17(4):2136-2142. Cejka P. DNA End Resection: Nucleases Team Up with the Right Partners to Initiate Homologous Recombination[J]. Journal of Biological Chemistry, 2015, 290(38):22931-8. 查向东. 冈崎片段与DNA半不连续复制[J]. 重庆理工大学学报, 2012, 26(5):20-23.

D
E

THANKS
谢 谢 聆 听

欢迎大家积极提问交流!

研究已经阐明了Sgs1解旋酶和Dna2核酸酶 活性以及MRX和Top3-Rmi1复合物在重建 体系中DSB切除术中的作用。 发现RPA是 SGS1 / Dna2切除途径的重要组成部分,通 过支持DNA展开步骤和增强Dna2的5'核酸 内切酶活性。 重要的是,RPA减弱Dna2的 3'-DNA切割,这可能用于强化切割机械的5 链特异性。

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