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引起基因沉默的原因


引起基因沉默的原因

研究表明,引起基因沉默的原因很多,转基因的拷贝数和构 型、在植物上的整合位点、转基因的转录水平等都与沉默有关, 外界环境如过高的温度、 过强的光照也会增加基因沉默发生的几 率和产生时间,此外,外源基因的表达还受植物发育因子(如亲本 年龄)的影响。 因此,植物转基因沉默的作用机制可能不是单一的, 而是各种机制共同作用的结果,是植物本身的防御系统和外界环 境因素协同作用的产物。转基因沉默可以发生在染色体 DNA 水 平、转录水平和转录后水平三种不同的层次上。 1.染色体 DNA 水平的转基因沉默 发 生 在 染 色 体 DNA 水 平 的 转 基 因 沉 默 叫 做 位 置 效 应 (positioneffect)。 当导入的外源基因随机地插入到宿主基因组 时,如果被导入到转录活跃区,就有可能进行高水平的转录,如果 外源基因插入转录不活跃区,则只能进行低水平的转录或不能转 录。 按照染色质高级结构组织的环状结构模型,核基质结合区 (matrixattachmentregions,MARs)作为边界元件与核基质结合, 使两个 MAR 之间的基因片段被界定成一个独立的染色质环 (1oop),并作为隔离子(insulator)阻挡邻近染色质区的顺式调 控元件对环内基因的影响,使位于染色体环内的基因可作为一独 立的表达调控单位而存在。MAR 可能使转基因在受体基因组整合

后形成独立的环状结构,从而提高转基因的表达水平并减少转基 因在不同株系表达差异 2.转录水平的基因沉默 发生在转录水平上的转基因沉默叫做转录失活。 反向重复的 基因或转基因可以进行异位配对,配对的 DNA 作为信号,使 DNA 异 染色质化或从头甲基化,这样转录过程就会受到抑制。此 外,DNA-RNA 协同(association)也是造成转录水平基因沉默的原 因之一。 (1)转移基因及其启动子甲基化 甲基化是活细胞中最常见 的一种 DNA 其价修饰形式,它通常发生在 DNA 的 GC 和 CN G 序列 的 C 碱基上,C 甲基化的频率在哺乳动物及高等植物中部比较高。 甲基化修饰在基因表达、 植物细胞分化以及系统发育中起着重要 的调节作用。 然而,从所报道的转基因沉默的例子来看,几乎所有 的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关。 而发生 在 DNA 的 CG 和 CNG 序列上的甲基化并不是植物中转基因转录水 平沉默起始的前提,但 C 碱基甲基化对维持基因沉默是必需的。 (2) 多拷贝重复基因 多拷贝重复基因序列整合进基因组后, 无论正、反都容易形成异位配对,引起基因组防御系统的识别而 被甲基化或异染色质化失活。 (3) 染色体包装 转导基因在染色体上的遗传位点相同,但受 染色体包装的影响,产生沉默。当转导基因由染色体区域的正常 位点包装到另一区域的位点时,其与转录因子的接触机会就会发

生改变,从而影响其表达水平。 因此,包装于不同染色体区域的转 基因的表达活性不同的水平,导致基因的镶嵌性失活,表现为细 胞有丝分裂的不稳定性。 3.转录后水平基因沉默 转录后水平的基因沉默是 RNA 水平基因调控的结果,比转录 水平的基因沉默更普遍,共抑制(co-suppression)现象是其研究 的热点。 共抑制是指在外源基因沉默的同时,与其同源的内源 DNA 的表达也受到抑制。 转录后水平的基因沉默的特点是外源基因能 够转录成 mRNA,但正常的 mRNA 不能积累,也就是说 mRNA 一经合 成就被降解或被相应的反义 RNA 或蛋白质封闭,从而失去功能。 其中 RNA-RNA 作用又称 RNA 干扰,涉及 RNA 的降解机制。此外, 过量的 RNA 也可能和同源的 DNA 相互作用导致重甲基化,使基因 失活。 (1)转录后基因沉默模型 RNA 阈值模型认为:细胞只能容纳 和处理一个特定阈值以下的转基因转录物,一旦细胞内的转基因 转录物超过这个阈值后,就引发了细胞内的一种 RNA 监视机制用 以排除过量的 RNA,内源 RNA 依赖下的 RNA 聚合酶以过多的转基 因 mRNA 为模板,通过反转录合成拷贝 RNA,这些拷贝 RNA 能与转 基因和内源基因的 mRNA 杂交,而配对的双链 RNA 可被细胞内 RNA 酶识别,成为降解的靶同源转录物。 异位配对模型认为:异位配对的 DNA 转录出正常 RNA 与异常 RNA,正常 RNA 与异常 RNA 相互作用,共同降低了正常 RNA 的加工

和翻译。 由于多拷贝的存在,引起 DNA 的反向连接,从正链转录的 反义 RNA 与从负链转录的 RNA 形成双链 RNA,干扰 mRNA 的正常加 工和翻译。减数分裂后,细胞内 mRNA 水平下降,RNA-RNA 相互减 弱,然后转录因 mRNA 水平开始上升。一定时间后,RNA-RNA 作用 加强,转基因又发生转录后沉默。 异常 RNA 模型:由 Kooter 等提出,认为转基因 mRNA 异常结构 或异常 RNA 可以激活 PTGS。 分子间和分子内配对模型:Metzlag 等认为,外源基因的导入 干扰了前体 mRNA 加工的正常进行,引起 mRNA 的大量降解,造成 内、外源基因的沉默。 (2)反义 RNA 引起的基因沉默 在植物体内有同源基因的外 源基因的表达或使用强启动子都会造成转录本过量,形成反义 RNA;具有同源性的 DNA 序列在载体上如果呈反式排列也会产生 反义 RNA。反义 RNA 会与特异的 mRNA 形成双链或三链结构,引起 特异性的 Rnase 的降解,使细胞内完整的 mRNA 含量降低,引起内 外源基因的失活。 (3)后成修饰作用(epigeneticeffect) 后成修饰作用是指 转基因的序列和碱基组成不发生改变,但是其功能却在个体发育 的某一阶段受到细胞内因子的修饰作用后而关闭。 后成修饰作用 导致的转基因沉默与受体植物的染色体组型结构有关。 (4)环境作用 环境因素对外源基因表达的影响环境在植物 生长和发育中起重要作用,与动物相比,植物的基因表达与调控

对环境有高度依赖性。其中,光、温度和水等是重要的环境因素。 在一定环境条件下,导入植物的外源基因可能由于环境因素诱导 而沉默。现在只知道环境因素对植物基因表达的影响是光控因 子、热休克元件、种子特异发育因子等顺式作用元件和反式作用 因子以及其他因子共同作用的结果。 需要注意的是,上述三种机制并不是独立的,而是相互关联 的。dsRNA 介导的植物 RNAi 引发的基因沉默可发生在转录水平, 也可发生在转录后水平。对于部分转基因植物来说,基因沉默可 能是因为特异基因的甲基化而引起。如:Kumpatla 等在将 bar 基 因导入水稻的实验中,发现 bar 基因在转录水平上发生了沉默。 Kohli 等和 Fu 等在用基因枪法获得转基因水稻中也发现了类似 的现象,同时发现沉默原因是由于外源基因本身及其启动子 Ubil 发生甲基化引起的。此外,Fu 等的研究还表明部分植物中 dsRNA 介导的基因沉默亦可在转录后发生。 马中良等通过农杆菌介导转 化水稻,结果亦表明 dsRNA 在转基因水稻中能高效诱导转录后基 因沉默的发生。 转录水平的基因沉默是发生在核内的时间,而转录后的基因 沉默是发生在细胞质中。两者都与甲基化有关,转录水平上的基 因沉默主要发生在启动子区域,基因的转录受抑制;而在转录后 的基因沉默中,甲基化主要发生在基因的编码区,基因能够转录, 产生 mRNA,但 mRNA 在细胞质中被特异性地降解,不能正常翻译成 蛋白质造成的,转录后基因沉默发生在细胞质中,转录物能在细

胞核中积累但在细胞质中 mRNA 迅速降解或不能正常地加工。二 者在时间上并非简单的前后关系,在空间上也不因为核膜的存在 而相互隔离。


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