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中国科技大学-遗传学实验


遗传学实验
张文锐 黄丽华 高永翔 编

中国科学技术大学 生命科学学院实验教学中心

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实验一 实验二


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有丝分裂(Feulgen 染色)制片技术 减数分裂制片技术 附:临时制片与永久制片技术

实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十

果蝇的形态、生活周期及饲养 果蝇的伴性遗传 果蝇的唾腺染色体制片技术 粗糙链孢霉的杂交 染色体数目变异 染色体结构变异 诱变物质的微核测定 基因分离的验证

11 16 20 23 27 29 33 34 37 40 42 45 48 51 54 57 61 65 70 75

实验十一 自由组合规律的验证 实验十二 人类 ABO 血型检查 实验十三 人类 X 染色质的观察 实验十四 小白鼠骨髓细胞染色体制片技术 实验十五 小白鼠骨髓细胞染色体显带(C带)技术 实验十六 人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片 实验十七 人类染色体核型分析 实验十八 实验十九 实验二十 植物染色体组型分析 植物染色体显带技术和带型分析 同功酶遗传标记分析 荧光原位杂交实验

实验二十一

附录一:X2 测验表

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实验一

有丝分裂(Feulgen 染色)制片技术

一、实验目的 1、通过本实验的学习,初步掌握植物染色体制片,奠定细胞遗传学研究的 基本技术; 2、通过对植物根尖细胞的观察,掌握有丝分裂过程中染色体的形态特征和 动态变化; 3、掌握 Feulgen 染色方法。

二、基本原理 有丝分裂(mitosis)是植物细胞分裂的主要方式,细胞分裂过程中,核内 染色体准确地复制,并有规律地、均匀地分配到两个子细胞中去,保证了植物细 胞的遗传性状的一致。各种生长旺盛的植物组织中,如根尖组织、茎尖组织、居 间分生组织、愈伤组织等,每天都有分裂高锋时间,此时经预处理,固定、解离、 染色和涂抹压片等方法, 在显微镜下可以观察到处于有丝分裂各时期的细胞和染 色体。 孚尔根染色法是鉴别细胞中 DNA 反应的组织化学方法。细胞内的 DNA(通常 位于核及染色体上)在 1N HCl 60℃水解时部分地破坏了脱氧核糖与嘌呤碱之间 的糖苷键而使嘌呤碱脱掉, 从而使脱氧核糖的第一个碳原子上潜在的醛基获得了 自由状态。而无色的亚硫酸品红是由偏重亚硫酸钠、盐酸和碱性品红配制成的。 偏重亚硫酸钠与盐酸能产生亚硫酸根, 当具有醌式结构的碱性品红分子与亚硫酸 根结合后,醌式结构的共轭双键被打开,碱性品红变为无色。当用这种无色的亚 硫酸品红去染经酸解的细胞时,就会与染色体 DNA 上游离的醛基结合,又出现了 呈现红色的醌式结构,从而使 DNA 分子着色。这一反应是 1924 年由 Feulgen 和 Rossonbek 所发现和确定的,已广泛用作鉴别 DNA 的一种特异性检查方法。 三、材料和器材 1、实验材料: 蚕豆 Vicia faba, 2n=12) ( (或其它植物) 干种子; (Allium cepa, 2n=16) 洋葱 根尖。

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2、实验仪器及用具: 水浴锅(60℃水浴)、显微镜、培养箱、电子天平、酒精灯、100℃温度计、 具塞试管、吸管、滤纸条等。 3、药品和试剂: 卡诺氏固定液(冰醋酸:无水酒精=1:3) 、秋水仙碱(或 8-羟基喹啉) 、无 水乙醇、1N HCl、 45?醋酸、0.2?秋水仙素、碱性品红、偏重亚硫酸钠(钾) Schiff 试剂的配制 Schiff 试剂:即脱色亚硫酸品红。溶解 1g 碱性品红于 200ml 煮沸的重蒸 馏水中,轻加摇动。继续煮 5 分钟使之完全溶解,冷却至 50-55℃时过滤到棕色 试剂瓶中,冷却至 25℃时,加入 20ml 1N HCl 和 1-3g 偏重亚硫酸钾(K2S2O5)或偏 亚 硫 酸钠(Na2S2O3)。 摇动使溶 解,密 闭瓶 口置黑暗 低温处 或冰 箱内 (4℃左 右)18-24h 后检查。溶液呈无色透明或淡黄色即可。如有不同程度的红色,可加 入 0.5-1g 活性炭,激烈震荡 1 分钟,仍在低温下静止 1 小时或过夜。然后用粗 滤纸迅速过滤后使用。密封瓶口,包以黑纸,在 0-5℃可以保存 5-6 个月。 偏重亚硫酸钾(K2S2O5)或偏亚硫酸钠(Na2S2O3)与 1N HCl 反应,放出 SO2、 SO2 与碱性品红反应生成碱性品红 —— 亚硫酸溶液,呈无色。 漂染液的配制 取 10%亚硫酸钠 10 ml,加 200 ml 蒸馏水,再加 10 ml1N HCl 即可。

四、实验方法和步骤 1、材料准备 (1) 、蚕豆根尖:选取新鲜无病斑的蚕豆干种子,经日晒后,放在烧杯内,室温 下清水浸泡一昼夜。种子吸水膨胀后, 20℃左右保湿培养(双层纱布覆盖) ,待 根长 1-2cm 时,于上午 9:00-10:30 或下午 14:00-16:00 剪下根尖备用。 (2) 、洋葱根尖:通过休眠的洋葱鳞茎,经日晒后,置于盛有清水的小烧杯上, 根部与水接触,20-25℃光照条件下培养 2-3 天,待根长 1-2cm 时,于上午 9:00-11:00 剪下根尖备用。 2、预处理 为获得较多中期分裂相的细胞,且使染色体缩短和分散,可对根尖进行预处

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理,方法如下(取其一即可) : (1) 、0.05%-0.2%的秋水仙碱水溶液处理 2-4 小时; (2) 、0.002M 的 8-羟基喹啉溶液处理 3-4 小时; (3)、根尖浸在蒸馏水中于在 1-4℃低温下处理 24 小时。 3、固定 用蒸馏水洗净材料,再用卡诺氏固定液(冰醋酸:无水酒精=1:3) (用量应为 材料体积的 15 倍以上)室温下固定 30-60 分钟。固定的材料如暂不制片,可经 90%酒精→80%酒精→70%酒精(各半小时)浸泡进行转换,最后置于 70%酒 精内放入 0-4℃冰箱,约可保存半年。如保存时间太长,需重新固定后再用。 4、Feulgen 染色法 (1)、取经预处理并固定好的洋葱根尖,用水洗 2-3 分钟,放入室温条件下的 1N Hcl 处理根尖材料 2-3 分钟。 (2) 、将根尖换入 60℃预热的 HCl,置于恒温水浴中,在 60?0.5℃的条件下水 解 8-10 分钟。 (3) 、吸出热 HCl,换入室温 1N HCl 再处理 1-2 分钟,然后水洗 2-3 次。 (4) 吸净水分, 、 加入 Schiff 试剂, 盖上盖子, 在黑暗条件下染色至少 30 分钟, 也可过夜。 (5) 、漂染液冲洗三次,每次至少 5 分钟去、去掉细胞中残存的品红分子。 (6)流水冲洗 10-15 分钟,再用蒸馏水冲洗并放于蒸馏水中待用。 (6) 、取根尖(紫红色部分)置载玻片上,用镊子夹碎后,加一滴 45?醋酸,盖 上盖片、压片。 (每组另做未经 HCl 处理的为对照) 5、显微观察: 制备好的细胞学片子,置于显微镜上,先用低倍镜(10×10)寻找具有分裂 相的细胞,再转换到高倍镜(10×40)下观察。

6、影响孚尔根(Feulgen)反应的主要因素 (1)水解时间和温度: 这是实验的主要关键。水解适当时,染色体着色较深 而细胞质不显颜色,水解不足,染色体着色浅淡,细胞质中可能有其他醛基存在 而显示扩散的红色。水解过度,则染色体着色不匀,这是由于 DNA 解聚而产生的
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游离核酸分子从染色体扩散到细胞质中,使细胞普遍着色。随着时间的过度,会 使水解液中的反应增强,而细胞不能着色。 (2)固定液的成分: 不同成分的固定液常出现不同的颜色反应。含铬酸的固 定液产生红色,酒精-醋酸固定液产生红色、紫红色,只用酒精的呈现紫色,用 含甲醛的固定液则呈现强烈的紫红色。当需要对染色体中的 DNA 定量测量时, 一般只能用不含金属离子和甲醛的固定液,如酒精-醋酸固定液等。 (3)SO2 含量: Schiff 试剂中的 SO2 含量也影响孚尔根反应的颜色表现。SO2 含量低时呈红色,含量高时则偏向蓝色。 (4)染色质中 DNA 的含量: 供试材料的染色质中 DNA 含量的不同是影响显

色反应强度的根本因素。不同生物和不同的组织、细胞中 DNA 含量不同,显色强 度也各异,并且二者之间是正相关的。实践证明,具有大、中型染色体的材料, 如百合科及部分禾本科植物材料,适于用孚尔根反应,小型染色体的材料特别是 玉米、水稻等不适于用孚尔根法染色。

五、实验报告 1、绘制你所观察到的图象,并说明是有丝分裂的哪一个时期。 2、直接固定和经过预处理后固定的材料,其分裂相有何不同? 3、经温 HCl 处理和不经处理的制片有何区别,为什么?

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实验二

减数分裂制片技术

一、实验目的 1、了解植物生殖细胞的形成过程; 2、熟悉减数分裂各时期的特点,加深对减数分裂的认识; 3、掌握植物花粉母细胞的压片技术和方法。

二、基本原理 减数分裂(meiosis),又称成熟分裂(maturation division)是在性母细 胞成熟时,配子形成过程中所发生的一种特殊方式的有丝分裂。性母细胞(2n) 连续进行两次核分裂(第一次分裂和第二次分裂) ,形成四个染色体数目减半的 配子(n)。 经过受精, 雌雄配子 (n) 融合为合子, 又恢复了体细胞染色体数目 (2n) 。 确保了亲代与子代间染色体数目的恒定性,从而保证了物种相对的遗传稳定性。 在适当的时候采集植物的花蕾制备染色体标本就可在显微镜下观察到植物 细胞的减数分裂。整个减数分裂可分为下列各个时期: 第一次分裂 前期Ⅰ 减数分裂的特点之一就是前期Ⅰ特别长,而且又较复杂。通常根据 细胞核内结构变化特征又将这一期分成五个时期,即细线期、偶线期、粗线期、 双线期和终变期。 细线期(leptotene) :这是减数分裂的开始时期,染色质开始浓缩为细而长 的丝状,首尾不分,且细线局部可见到念珠状颗粒,即染色粒。此时,虽然染色 体已经复制为二个染色单体,但在显微镜下还看不出结构上的双重性。 偶线期(zygotene):各同源染色体开始配对(pairing) ,出现联会现象。2n 个染色体联会为 n 对染色体。染色体形态与细线期差别不大。在显微镜下不易与 细线期分开, 但可根据染色体分散状态及粗细变化判断其是靠近细线期还是趋于 偶线期。 粗线期(pachytene) :二价体逐渐缩短变粗,同源染色体配对完毕,这种二 价体包含了四条染色单体,又称四合体(tetrad)。此时,非姊妹染色单体间出现 交换(crossing over),造成遗传物质的重组。

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双线期(diplotene):配对的同源染色体进一步缩短变粗,由于同源染色体 间发生过互换,开始分离而出现交叉(chiasmata)现象。此时染色体呈现扭花 状。 终变期(diakinesis):由于交叉端化(terminalization) ,染色体显著收缩 变粗,并向核周边移动,在核内较均匀地分散,二价体往往呈 X、O、V 形态,核 膜、核仁才开始消失。此时有利于染色体计数。 另外,玉米花粉母细胞在整个前期Ⅰ都具有较明显的核仁,这是前期的一个 显著标志,进入中期,核膜、核仁才开始消失。 中期Ⅰ 核膜、核仁才消失,各个二价体排列在赤道面上,纺锤体形成。双价 体开始分离。此时也是鉴定染色体数目和形态的最好时期。 后期Ⅰ 由于纺锤丝的牵引,各个二价体分开,移向两极,每一极得到 n 条 染色体,每一染色体含有两个染色单体。实现了染色体数减半(2n → n) 。 末期Ⅰ 移到二极的染色体,解旋、松散变细,逐渐形成两个子核,核膜重 新形成,胞质分裂,成为两个子细胞,称为二分体(dyad) 。 中间期(interkinesis) 在第二次分裂开始之前,两个子细胞进入间期。 但有的植物和大多数动物不经过间期,直接进入第二次分裂。间期的时间短,无 DNA 复制,故 DNA 含量没有变化。 第二次分裂 前期Ⅱ 染色体缩短变粗,开始清晰起来。每个染色体含有一个着丝粒和纵 向排列的两条染色单体。前期快结束,染色体变得短粗、清晰可见,核膜消失。 中期Ⅱ 染色体排列在赤道面上,两条染色单体开始分裂。此时细胞的染色 体数为 n,每一染色体有两条染色单体。 后期Ⅱ 着丝点分裂为二,两条染色单体由纺锤丝分别拉向两极,每极含有 n 条染色体。 末期Ⅱ 染色体逐渐解旋,核膜重建,核仁重新形成,同时细胞质又分为两 部分,各成为两个子细胞。 这样,一个花粉母细胞经过两次连续分裂形成四个子细胞,称四分体 (tetrad)或四分孢子(tetraspore)。各细胞的核里的染色体只有最初细胞染色 体的一半,即从 2n 减数为 n。

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三、材料和器材 1、实验材料: 玉米雄花序(2n = 20) 2、实验仪器及用具: 显微镜、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片等。 3、药品和试剂: Carnoy 固定液(甲醇∶冰醋酸 = 3∶1) 、醋酸洋红、45%醋酸等。

四、实验方法和步骤 1、采集玉米不同花期的雄花序用新配制的 Carnoy 固定液(甲醇∶冰醋酸 = 3∶ 1)固定 18—24 小时,经 80%和 70%酒精各半小时,保存于 70%酒精中备用。 这样处理的材料可保存使用 2—3 年。 2、取经过固定的雄花序,选取长 0.5cm 左右的小花,用解剖针或镊子挑出花药 (每一朵小花有 3 个花药) ,置于载玻片上。 3、在花药上滴一滴醋酸洋红,然后用解剖针把每个花药截成几段,尽可能挤出 花药中的花粉母细胞。 4、去除花药残渣,适当涂匀玻片,盖上盖玻片,垫一张滤纸,以大拇指均匀按 压,注意,不要滑动盖玻片!吸去多余染液即可镜检。若高倍镜观察颜色太 深,可在酒精灯火焰上过几遍,微烫,使细胞质透明,增大反差,注意不要 拷过度! 5、显微镜下观察,寻找减数分裂各期图象,熟悉各时期特点。

五、实验报告 1.绘制观察到的典型的减数分裂各期分裂相。 2.为什么说减数分裂是经典遗传学的根本? 3.简述减数分裂各个时期染色体的特征。

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附:临时制片与永久制片 将做好的比较理想的片子,可以临时封片以保存一段时间,也可制成永久制 片,以长期保存。 Ⅰ、临时制片:暂时封固良好的片子,可以用解剖针烧熔石蜡密封盖玻片四周, 置低温下一般可保存数星期。 Ⅱ、永久制片: 1、将制好的片子有盖玻片的一面向下浸入 95%酒精 1:冰醋酸 1 的混合液中,从 盖玻片脱落载玻片时算起 1-2 分钟。 2、轻取载、盖玻片,不使材料丢失并注意其位置,放入 95%酒精 2:正丁醇 1 的 混合液中 1-2 分钟。 3,移入 95%酒精 1:正丁醇 2 的混合液中 1-2 分钟。 4,移入正丁醇中 1-2 分钟(至少两次) 。 5,加拿大树胶(或中性树胶)封存。

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实验三

果蝇的形态、生活周期及饲养

一、实验目的 1、了解果蝇生活史中各个不同阶段的形态特点; 2、区别雌雄果蝇以及几种常见突变类型的主要性状特征; 3、掌握实验果蝇的饲养、管理及实验处理方法和技术。

二、基本原理 1、果蝇的生活史 果蝇属于昆虫纲,双翅目,果蝇属,与家蝇是不同的种。 果蝇的生活周期长短与温度关系很密切。 30℃以上的温度能使果蝇不育和死 亡,低温则使它的生活周期延长,同时生活力也降低,果蝇培养的最适温度为 20-25℃。
10℃ 卵?幼虫 幼虫?成虫 57 天 18 天 15℃ 20℃ 8天 6.3 天 25℃ 5天 4.2 天

从表中可以看出,25℃时,从卵到成虫约 10 天;在 25℃时成虫约活 15 天。 卵: 羽化后的雌蝇一般在 12 小时后开始交配, 两天后才能产卵。 卵长 0.5mm, 为椭圆形,腹面稍扁平,在背面的前断伸出一对触丝,它能使卵附着在食物(或 瓶壁)上,不致深陷到食物中去。 幼虫:从卵孵化出来后,经过两次蜕皮,发育成三龄幼虫,此时体长可达 4-5mm。肉眼可见其前端稍尖部分为头部,上有一黑色斑点即为口器。口器后面 有一对透明的唾液腺,透过体壁可见到一对生殖腺位于躯体后半部上方的两侧, 精巢较大,外观上是一明显的黑点,而卵巢则较小,可以此作为鉴别。幼虫活动 力强而贪食,它们在培养基上爬行时,留下很多条沟,沟多而且宽时,表明幼虫 生长良好。 蛹:幼虫生活 7-8 天准备化蛹,化蛹前从培养基上爬出,附着在瓶壁上,逐 渐形成一梭形的蛹.在蛹前部有两个呼吸孔,后部有尾芽,起初蛹壳颜色淡黄而
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柔软,以后逐渐硬化,变为深褐色,表明即将羽化了。 成虫:幼虫在蛹壳内完成成虫体型和器官的分化,最后从蛹壳前端爬出。刚 从蛹壳里羽化出来的果蝇虫体比较长,翅膀尚未展开,体表尚未完全几丁质化, 故呈半透明的乳白色。透过腹部体壁,可以看到黑色的消化系统。不久,变为短 粗圆形,双翅展开。体色加深。如野生型初为浅灰色,然后呈灰褐色。 2、形态构造 头部有一对复眼,三个单眼和一对触角;胸部有三对足,一对翅和一对平衡 棒;腹部背面有黑色环纹,腹面有腹片,外生殖器在腹部末端,全身有许多体毛 和刚毛。

雄果蝇

雌果蝇

3、成虫雌雄的鉴别 性 状 体 型 第一对足跗节 腹末端 腹 片 腹背面条纹 外生殖器 雌果蝇 较大 无性梳 钝而圆 6个 5条 简单 雄果蝇 较小 有性梳 稍尖 4个 3条 复杂

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4、果蝇常见的几种突变形状特征
突变形状名称 白眼 棒眼 檀黑体 黑体 黄身 残翅 焦刚毛 小翅 基 因 符 号 w B e b y vg sn m 复眼白色 复眼横条形 体呈乌木色,黑亮 体呈深色 体呈浅橙黄色 翅退化,部分残留不能飞 刚毛卷曲如烧焦状 翅较短 形 状 特 征 所在染色体 X X IIIR IIL X IIR X X

5、果蝇的性别决定 (1)染色体组成 果蝇为二倍体 2n=8。核内有丝分裂:不涉及细胞分裂和核分裂的染色体分 裂方式。体联会:一些特殊的体细胞中(如果蝇唾腺细胞)的染色体经多次复制 却不分开,依旧紧密地排列在一起就象减数分裂中的联会现象一样。染色体组: 来自二倍体生物的正常配子的所有染色体。连锁群:来自配子中的每条染色体及 其携带的基因。 雌雄基因平衡理论:对果蝇而言,X 染色体上有决定雌性的基因, 常染色体上有决定雄性的基因存在,其比值决定果蝇的雌或雄,Y 染色体只与育 性有关,而与性别无关。 (2)果蝇的性别决定 果蝇的性别决定为 XY 型,Y 染色体在性别决定上不起作用,只与育性有关。 含有 Y 染色体,可产生正常的配子,不含 Y 染色体,则配子不育。性别决定与性 比值(性指数)有关。 X/A=1 则为雌性;X/A=0.5 则为雄性。

X/A>1,为超雌;X/A<0.5,则为超雄;0.5<X/A<1 则为中间性。 雌雄基因平衡理论:果蝇 X 染色体上有很多雌性基因,常染色体上有很多雄 性基因,Y 染色体上很少或没有与性别决定有关的基因,因此性别决定于基因的 平衡。

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(3)果蝇的连锁群 X 染色体上有 141 个基因; 2 染色体上有 228 个基因; 3 染色体上有 156 第 第 个基因;第 4 染色体上有 12 个基因。 (4)同源染色体:来源相同、结构相似、控制的形状相同,在减数分裂中配对 的一对染色体。

三、材料和器材 1、实验材料: 黑腹果蝇。 2、实验仪器及用具: 双目解剖镜、放大镜、小镊子、麻醉瓶、白瓷板、新毛笔等。 3、药品和试剂: 果蝇培养基、乙醚等。

四、实验方法和步骤 1、培养基的配制 果蝇培养基的配置(1000ml 用量)
玉米面 85g
红糖 (或蔗糖)

琼脂 8.5g

干酵母 7g

丙酸 5ml

65g

水溶琼脂→加红糖(或蔗糖)→加搅好的玉米面→煮沸→加水到 1000ml→ 冷却→50℃左右加入酵母粉→加入丙酸(防腐剂) 。 配制好的培养基进行高压灭菌,121℃,20min,待用。 2、果蝇培养 将每 3-5 对雌雄果蝇转入待用培养基中,进行培养,隔天观察其生长情况, 视其生长周期。 3、果蝇的性状观察 对果蝇进行检查时,可用乙醚麻醉,使它保持静止状态。因为果蝇对乙醚很
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敏感,易麻醉,麻醉的深度看实验的要求而定(作种蝇以轻度麻醉为宜,做观察 可深度麻醉,致死也无妨。果蝇翅膀外展 45 度角表示已死亡) 。 麻醉的方法是将果蝇转移到干净的三角瓶中, 迅速加入滴有适量乙醚的滤纸 条,盖上瓶塞,稍等片刻果蝇便麻醉。 4、记录观察结果 将麻醉后的果蝇倒在白瓷板上检查,分辨雌雄蝇,观察各种突变形状特征。 观察完毕,将全部果蝇倒入煤油或酒精瓶中(死蝇盛留器) ,统一处理。

五、实验报告 将观察到的果蝇常见突变形状特征填在下表中。
+ 体 色 眼色形 翅 形 刚 毛 e y w B wy vg 勺翅 缺刻 三隐性

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实验四

果蝇的伴性遗传

一、实验目的 1、正确认识伴性遗传的正、反交的差别,进一步认识伴性遗传的特点。 2、记录杂交结果,掌握统计处理方法。

二、基本原理 位于性染色体上的基因叫作伴性基因, 其遗传方式与位于常染色体上的基因 有一定差别,它在亲代与子代之间的传递方式与雌雄性别有关,伴性基因的这种 遗传方式称为伴性遗传(sex-linked inheritance) 。 果蝇的染色体有 X 和 Y 两种,雌性是 XX,为同配性别;雄性是 XY,为异配 性别。伴性基因主要位于 X 染色体上,而 Y 染色体上没有相应的等位基因,所以 这类遗传也叫 X—连锁遗传。 果蝇的红眼与白眼是一对相对性状,由单基因控制,位于 X 染色体上,基因 之间的关系为红眼对白眼完全显性。当红眼果蝇(♀)和白眼果蝇(♂)杂交, F1 代中的果蝇均为红眼,F2 代中红眼果蝇∶白眼果蝇=3∶1,但在雌果蝇中全为 红眼,在雄果蝇中红眼果蝇∶白眼果蝇=1∶1。当反交时,F1 代中的雌果蝇为红 眼,雄果蝇却为白眼。F2 代中红眼果蝇∶白眼果蝇=1∶1,在雌果蝇或雄果蝇中 红眼果蝇与白眼果蝇的比例均为 1∶1。

交配方式如下所示,其中设 A 为正交,则 B 是 A 的反交 A: 红眼雌[♀]×白眼雄[♂] P: X X ×X Y ↓ F1: X X ×X Y ↓ F2: XX
+ + + w + + + w

B: P:

白眼雌[♀]×红眼雄[♂] X X ×X Y ↓
w w +

F1:

X X ×X Y ↓

+ w

w

XX

+ w

XY XY

+

w

F2: 表型:

XX

+ w

XX

w w

XY

+

XY

w

表型:♀[+] ♀[+] ♂[+] ♂[w]

♀[+] ♀[w] ♂[+] ♂[w]

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注意: 1、常染色体性状遗传的正、反交所得子代♀、♂性状相同,而伴性遗传则不同。 2、在进行伴性遗传实验时,也有例外个体产生,这是由于两条 X 不分离造成的 (B 杂交组合) 1 中出现了不应该出现的♀性白眼,但这种情况极为罕见,约几 ,F 千个体中有一个。不分离现象如下图所示:

三、材料和器材 1、实验材料: 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)品系: 野生型(红眼) X ,X Y :X 突变型(白眼) X ,X Y :X 2、实验仪器及用具: 大试管、麻醉瓶、瓷板、毛笔等。 3、药品和试剂: 乙醚、果蝇培养基等。
w w w + + +

四、实验方法和步骤 1、收集处女蝇:由于雌蝇生殖器官中有贮精囊,一次交配可保留大量精子,供 多次排卵受精用,因此做杂交实验前必须收集未交配过的处女蝇。由于孵化

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出的幼蝇在 12 小时内(更可靠是 8 小时)不交尾,因此必须在这段时间内把 ♀、♂蝇分开培养,所得的♀蝇即为处女蝇。 2、准备好培养基,按正、反交组合,把已麻醉的红眼♀、白眼♂和红眼♂、白 眼♀分别放入不同试管内进行杂交, 每管 3—5 对。 贴上标签, 注明杂交组合、 杂交日期、操作者姓名。 3、6—7 天后,见到有 F1 幼虫出现,即除去亲本果蝇(一定要除干净!。 ) 4、再过 3—4 天,观察 F1 成蝇的性状(正、反交有什么不同?眼色与性别的关系 如何?) 。 5、将所出现的 F1 代♀、♂果蝇麻醉后,挑 3—5 对换入新的培养基继续饲养(此 处无需处女蝇) 。两组合后代不能混合,应分别培养。 6、6—7 天后又需除干净 F1 代亲本果蝇。 7、再过 3—4 天,F2 代成蝇出现,麻醉后倒出观察眼色和性别,进行统计。 8、每隔 1—2 天统计一次,累积 6—7 天数据,填入下列表中:

F1 代 类型

正交 红眼♀×白眼♂ 红眼♀ 红眼♂

反交 白眼♀×红眼♂ 红眼♀ 白眼♂

观察日期

合 比

计 例

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F2 代 类 型 观察 日期 红眼 ♂

正交组合 F2 白眼 ♂ 红眼 ♀ 白眼 ♀ 红眼 ♂

反交组合 F2 白眼 ♂ 红眼 ♀ 白眼 ♀

合 计 比 例

χ 2 测定: χ 2 =∑(观察值 – 理论值)2 / 理论值 根据χ 2 测定,查χ 2 表,n=4-1=3,P0.05=7.815;n=2-1, P0.05=3.841。若所得的 χ 2﹤P0.05,可以认为观察值是符合假设的。具体对这个实验来说,所得到的实验 结果应该是符合伴性遗传的假设,也就是说眼色的这对性状是由位于性染色体 X 上的一对等位基因控制的。若所得的χ 2﹥P0.05 ,则说明所得到的结果不符合伴性 遗传的结果。

五、实验报告 1、完成上面的统计表格,并做χ 2 测验,解释实验结果。 2、在杂交过程中,当见到有 F1 幼虫出现时为什么一定要将亲本果蝇去除干净? 3、在挑取 F1 代果蝇进行继续杂交时为什么不需要处女蝇?

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实验五

果蝇唾腺染色体制片技术

一、实验目的 1、练习分离果蝇幼虫唾腺的技术,学习唾腺染色体的制片方法; 2、观察果蝇唾腺的形态学及遗传学特征; 3、了解体细胞染色体配对现象;

二、基本原理 本世纪初,D.Kostoff 用压片法首先在 D.melanogaster 果蝇幼虫的唾液腺 细 胞 核 中 发 现 了 特 别 巨 大 的 染 色 体 — 唾 液 腺 染 色 体 ( salivary gland chromosome) 。事实上,双翅目昆虫(如摇蚊、果蝇等)的幼虫期都具有很大的 唾腺细胞, 其中的染色体就是巨大的唾液腺染色体。 相当于普通染色体的 100-150 倍,这些巨大的唾液腺染色体具有许多重要特征,为遗传学研究的许多方面,如 染色体结构、化学组成、基因差别表达等提供了独特的研究材料。 双翅目昆虫的整个消化道细胞发育到一定阶段后就不再进行有丝分裂, 而停 止在分裂间期。但随着幼虫整体器官以及这些细胞本身体积的增大,细胞核中的 染色体,尤其是唾液腺染色体仍不断地进行自我复制而不分开,经过许多次的复 制形成约 1000—4000 拷贝的染色体丝,合起来达 5μ m 宽,400μ m 长,比普通 中期相染色体大得多(约 100—150 倍) ,所以又称多线染色体( polytene chromosome)和巨大染色体(giant chromosome) 。 唾腺染色体形成的最初,其同源染色体即处于紧密配对状态,这种状态称为 “体细胞联会” 。在以后不断的复制中仍不分开,由此成千上万条核蛋白纤维丝 合在一起,紧密盘绕。所以配对的染色体只呈现单倍数。黑腹果蝇的染色体数为 2n=2×4,其中第Ⅱ、第Ⅲ染色体为中部着丝粒,第Ⅳ和第Ⅰ(X 染色体)染色 体为端着丝粒。而唾腺染色体形成时,染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚 于一起形成一染色中心(chromocenter),所以在光学显微镜下可见从染色中心 伸出 6 条配对的染色体臂, 其中 5 条为长臂, 一条为紧靠染色中心的很短的臂 (如 图示) 。 由于唾腺细胞在果蝇幼虫时期一直处于细胞分裂的间期状态, 所以每条核蛋 白纤维丝都处于伸展状态,因而不同于一般有丝分裂中期高度螺旋化的染色体。
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唾腺染色体经染色后,呈现深浅不同,疏密各异的横纹(band) 。这些横纹的数 目、位置、宽窄及排列顺序都具有种的特异性。研究认为这些横纹与染色体的基 因是有一定关系的。从其横纹分布特征可对物种的进化特征进行比较分析,而一 旦染色体上发生了缺失、重复、倒位、易位等,也可较容易地在唾腺染色体上观 察识别出来。可见唾腺染色体技术是遗传学研究中一项基本的技术。

果蝇巨大染色体

三、材料和器材 1、实验材料: 黑腹果蝇三龄幼虫。 2、实验仪器及用具: 显微镜、解剖针、载玻片等。 3、药品和试剂: 1%醋酸洋红等。

四、实验方法和步骤 1、从培养果蝇的大试管中挑取一发育充足、肥大的三龄幼虫置于事先滴有一滴 蒸馏水或生理盐水的载玻片上,如幼虫带有饲料,可先用蒸馏水将其洗净。 2、取两根解剖针,一根压住幼虫的头部,压点尽可能靠近口器处,当头部固定 后,用另一根针压住尾短,平稳快速一拉,使口器处断开,体内各器官也从 切口挤出,一对唾腺随之而出。唾腺是一对透明的香蕉状腺体,仔细观察可 发现是由一个个较大的唾腺细胞组成。

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3、在显微镜的低倍镜下找到唾腺,其周围可能伴有消化道和脂肪体。确定腺体 后,仔细剔除杂物,仅让腺体留下。 4、用滤纸将多余的蒸馏水吸去,注意不要碰着腺体,以防被吸走。然后滴上一 滴醋酸洋红染液,覆盖染色 10 分钟。 5、染色后,盖上盖玻片,用滤纸吸去多余染液,然后放平在桌面,用大拇指向 下冲压盖玻片,注意要有一定的力度,且盖玻片与载玻片之间不能滑动。多 练习几次,可望获得分散较好的制片。 6、将制好的片子放到显微镜下进行观察。先用低倍镜找到好的染色体图象,再 换用高倍镜观察之。

五、实验报告 1、绘制形态良好、分散适中的果蝇唾腺染色体图象。 2、本次实验对实验材料有何要求?为什么? 3、通过反复实践,你认为该实验的关键步骤是什么?为什么?你对本次实验有 何改进设想?

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实验六

粗糙链孢霉的杂交

一、实验目的 通过对链孢霉杂交所产生的子囊孢子的观察,了解分离和交换现象,并进行 统计,计算交换值。

二、基本原理 粗糙链孢霉(Neurospore crassa )属于真菌类,子囊菌纲,球壳目,脉孢菌 属,又称为红色面包霉。 粗糙面包霉的营养体是由单倍性(n=7)的多核菌丝组成的。生殖方式有无性 生殖和有性生殖两种。 无性生殖是菌丝片段或分生孢子经有丝分裂直接发育成菌 丝体。 有性生殖是不同接合型的菌丝产生有性孢子的过程, 主要有两种方式: (1) 未受精的营养体菌丝上产生灰白色的原子囊果, 可以接受另一不同接合型的分生 孢子,通过杂交形成合子。(2)不同接合型的菌丝靠在一起,通过核融合产生异 核体。两种有性生殖方式形成的二倍性合子都可以经减数分裂形成四个子细胞, 每个子细胞又经一次有丝分裂形成 8 个子细胞,进一步发育形成 8 个子囊孢子, 并以一定顺序排列在子囊中,许多子囊又被包在黑色的子囊果中。若两个亲代菌 株有某一遗传性状的差异, 那么经杂交所形成的子囊必定有四个子囊孢子属于一 种类型,其它四个子囊孢子属于另一类型。成熟的子囊孢子在适当条件下可发育 成菌丝,形成新的一代。它们的子囊孢子的性状的分离比例是严格的 1:1,而 且有一定的顺序。不同接合型的子囊孢子具有黑色、白色两种类型,在子囊中 8 个子囊孢子常呈 4 黑 4 白的排列方式, 因此可在显微镜下直接观察基因的分离现 象。当基因发生了互换时,8 个子囊孢子又会排列成 2 黑 2 白 2 黑 2 白或排列成 2 黑 4 白 2 黑或 2 白 4 黑 2 白, 因此在显微镜下也可以观察基因的连锁互换现象。 粗糙链孢霉的优点: 1、野生型的子囊孢子成熟较早,在一定时期呈现黑色,赖氨酸缺陷型的子囊孢 子成熟较晚,在一定时期呈现灰白色。以上两种接合型的粗糙链孢霉杂交在适当 时期可以观察到六种子囊类型。
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2、子囊孢子排列的顺序固定,可直接观察到基因的交换。 3、可以计算基因与着丝粒的距离。 4、如果出现 A6、a2、A5、a3 则表示基因转变。 粗糙链孢霉子囊孢子的分离及分析: 1 正常分离
—————— A —————— A —→ ┈┈┈┈┈┈a ┈┈┈┈┈┈a —→ AAAAaaaa 非交换型(M1)

—————— A —————— A ┈┈┈┈┈┈ a ┈┈┈┈┈┈ a

—————— A —————— A ┈┈┈┈┈┈ a ┈┈┈┈┈┈ a —→

┈┈┈┈┈┈ a —————— A —————— A ┈┈┈┈┈┈ a —→ aaAAAAaa(1、3 线交换) 交换型(M2)

—————— A —————— A ┈┈┈┈┈┈ a ┈┈┈┈┈┈ a —→

—————— A ┈┈┈┈┈┈ a —————— A ┈┈┈┈┈┈ a —→ AAaaAAaa(2、3 线交换) 交换型(M2)

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异常分离

(全部为减数后分离)
——————A 基因转换 ————→ ——————A ——————A ┈┈┈┈┈┈a —→ AAAAAAaa(6:2) 染色单体转变

—————— A —————— A ┈┈┈┈┈┈ a ┈┈┈┈┈┈ a

——————A ——————A —————— —————— ┈┈┈┈┈┈ ┈┈┈┈┈┈ —→ ——————A ——————A ┈┈┈┈┈┈a ┈┈┈┈┈┈a ┈┈┈┈┈┈a ┈┈┈┈┈┈a —→

—————— —————— —————— —————— —————— ┈┈┈┈┈┈ ┈┈┈┈┈┈ ┈┈┈┈┈┈ ( 5:3 ) 半染色单体转换

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——————A ——————A —————— —————— ┈┈┈┈┈┈ ┈┈┈┈┈┈ —→ ——————A ——————A ┈┈┈┈┈┈a ┈┈┈┈┈┈a ┈┈┈┈┈┈a ┈┈┈┈┈┈a —→

—————— —————— —————— ┈┈┈┈┈┈ —————— ┈┈┈┈┈┈ ┈┈┈┈┈┈ ┈┈┈┈┈┈ (3:1:1:3) 半染色单体转换

三、材料和器材 1、实验材料: 粗糙链孢霉(Neurospore crassa )野生型菌株和 Lys 缺陷型菌株。 2、实验仪器及用具: 显微镜、接种针、载玻片、试管、三角瓶 3、药品和试剂: 粗糙链孢霉培养基、5%石炭酸等。

四、实验方法和步骤 1、菌种活化 为使菌种生活得更好,先要进行菌种的活化。从冰箱中取出保存的野生型和 Lys 缺陷型的原种, 在无菌条件下分别接种在两支完全培养基试管的斜面上, 28℃ 温箱培养 5-6 天左右。直至在试管中长成许多菌丝,并且在菌丝上部有许多分生 孢子时表明菌种活化成功。 2、杂交 取野生型和 Lys 缺陷型的少许菌丝接种到同一试管的玉米琼脂培养基上, 共 接两支试管;或者将两种菌丝分别接种到培养皿中“桥”的两侧。在 25℃恒温 箱中培养 2-3 周,直至在菌丝上有子囊果出现,子囊果为棕黑色,用镊子或解剖 针触摸时有坚实感。

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3、观察 (1)在长有子囊果的试管中加少量无菌水,摇动片刻,把水倒在空三角瓶 中,加热煮沸,以防止分生孢子飞扬。 (2)取一载玻片,滴 1-2 滴 5%次氯酸钠,然后用接种针挑出子囊果放在载 玻片上(若附在子囊果上的分生孢子过多,可先在 5%次氯酸钠中洗涤,再移到 载玻片上) ,有另一载玻片盖上,用手指压片,将子囊果压破,置显微镜下(10 ×15 倍)检查,即可见 30-40 个子橐果。观察子囊中子囊孢子的排列情况。用 载玻片盖上压片而不用盖玻片,是因为子囊果很硬,若用盖玻片会破碎。如发现 30-40 个子囊果象一串香蕉一样,可加一滴水,用解剖针把子囊拨开。此过程无 需无菌操作,但要注意不能使分生孢子散出。观察过的载玻片、用过的镊子和解 剖针等物都需放入 5%石碳酸中浸泡后取出洗净,以防止污染实验室。

五、实验报告 1.绘出显微镜下观察到的完整子囊图。 2.计算 Lys 与着丝粒的距离。 M2/(M1+M2)×100%×1/2 (必须是完整的子囊;灰色的不算;异常分离的不算) 异常分离的百分数=异常分离数/( M1+M2+异常分离数)×100%

附:实验用培养基配方 1、基本培养基(又称土豆培养基,供接种野生型菌株)50ml 用量。 (1) 将土豆洗净削皮, 挖去发芽部分, 切成黄豆粒大小的碎块, 每管放 5-6 粒。 (2)称琼脂 1.2 克,蔗糖 1 克,加水到 50ml,煮沸溶解。 (3)将 B 分装到 A 中,每管放 3-4ml。 (4)做好试管塞,用牛皮纸包好,贴好标签。8 磅条件下高压灭菌 30 分钟。 2、补充培养基(供接种 Lys 缺陷型菌株) 在基本培养基中加入少许 Lys ,其它同上。 3、玉米琼脂培养基(供杂交实验用) 将玉米粒在水中浸泡 24 小时后晾干,每试管放 2-3 粒,配 2%的琼脂放入蒸 馏水中煮沸,每试管倒 3-4ml,其它方法同基本培养基。

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实验七

染色体数目变异

一、实验目的 1、了解人工诱发多倍体植物的原理、方法及其意义; 2、观察植物染色体数目的各种变异及其在有丝分裂过程中的细胞学特征。

二、基本原理 植物染色体数目一般为二倍体(2n) ,但是在自然条件下和人工条件下可以 诱发染色体数目的变异。染色体数目变异分为整倍性变异和非整倍性变异。整倍 性变异有同源多倍体变异和异源多倍体变异。 非整倍性变异有单体、 缺体、 三体、 四体等。 由于染色体数目的变异可以导致有丝分裂和减数分裂过程出现不正常的 细胞学行为以及形态特征的变化。 人工诱导多倍体的方法很多。 用秋水仙碱诱发多倍体是常用而且是最有效方 法。秋水仙碱是从秋水仙(Colchium autumnale. L.)器官和种子的提炼出来的一 种植物碱,其化学分子式为 C22H25O6N,有剧毒。其作用是阻止分裂细胞形成纺 锤丝,使复制了的染色体不能分向两极,细胞也不能分裂成二个细胞,仍处于同 一个细胞中,于是每个细胞内的染色体数目发生了加倍。成为多倍性细胞,进一 步发育成多倍体植物。 多倍体诱变结果鉴定: 1、多倍体植物的个别部分如气孔、花器、种子、果实等明显增大,叶片肥 厚,植株比二倍体高大,叶表皮组织气孔明显增大。 2、多倍体植物在减数分裂时,由于同源染色体联会和分离不正常,导致育 性降低。 3、经诱变的多倍体植物有丝分裂时,可以染色体数目成倍增加。

三、材料和器材 1、实验材料: 蚕豆(Vicia faba, 2n=12)种子;洋葱(Allium cepa, 2n=16)鳞茎 2、实验仪器及用具: 显微镜、培养箱、分析天平、水浴锅、酒精灯、剪刀(或刀片) 、镊子、解
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剖针、载玻片、盖玻片、滤纸、铅笔、标签纸、胶水

3、药品和试剂: 秋水仙碱、苏木精、水合三氯乙醛、铁铵矾、酒精、冰醋酸、盐酸、丙酸

四、实验方法和步骤 1、材料准备 取蚕豆干种子或洋葱鳞茎, 经浸种催芽后,待根长 1 厘米左右时,吸干水分, 将根部用 0.1~0.2%秋水仙碱药液浸没,根尖朝下,20℃继续催芽生长,一直浸 到根尖明显膨大时, (大约 36~48 小时) ,冲洗干净取下根尖 0.5 厘米部位,经卡 诺氏固定液固定 0.5~1 小时,然后 70%酒精保存。 2、解离: (1)取 70%酒精保存的根尖,冲洗后置入 1N 的盐酸中,室温处理 20 分钟, 将酸冲洗干净备用。 (2)取出经固定的备用根尖,切取具分生组织部分约 1~2 毫米, (去除根冠 和伸长区细胞)置 1NHCl 中解离 10 分钟。然后用蒸馏水洗尽材料上盐酸,准备 制片和染色 3、染色制片 取一枚经解离的蚕豆根尖,置载玻片正当中,两片载玻片呈十字形对压,然 后揭开, 在有材料的部位各滴上一小滴丙酸―铁矾苏木精染色, 再用盖玻片压片。 4、镜检 观察有丝分裂中期和早后期细胞,并进行染色体计数。

五、实验报告 1、交染色体数目变异的有丝分裂制片一张, 2、绘制观察的染色体数目变异的形态并说明。

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实验八

染色体结构变异

一、实验目的 了解染色体结构发生变异后,在有丝分裂的细胞中,可以观察到在后期出现 染色体桥或染色体断片,在间期的细胞可以观察到微核。

二、基本原理 染色体结构变异主要有缺失、重复、倒位、易位四种。其发生过程是由于同 源染色体或非同源染色体之间发生断裂,然后发生错误重接的结果。各种结构变 异的杂合体,在细胞分裂过程中常常表现不正常的细胞学行为,可以进行细胞学 鉴定。在减数分裂过程粗线期,可以观察到缺失杂合体的“缺失环” ,重复杂合 体的染色体突出的环或瘤,倒位杂合体的“倒位圈”或者后期的染色体桥,易位 杂合体的“十字形”联合或者终变期“四体环” “四体链” “8 字形环” 。在有丝 分裂细胞中可见到后期的染色体桥,染色体断片,以及间期的细胞核显出现“微 核”等。 染色体结构变异一般可导致花粉和胚珠的部分不育,或者半不育,产生遗传 性状的变异,以及假显性,假连锁、剂量效应、位置效应等等改变基因连锁关系 遗传后果,严重的可造成个体死亡。通过染色体行为观察和遗传效应实验相互印 证,鉴别染色体结构变异的类型。

三、材料和器材 1、实验材料: 蚕豆(vicia faba, 2n=12)干种子 2、实验仪器及用具: 显微镜、培养箱、分析天平、水浴锅、酒精灯、剪刀、镊子、解剖针、载玻 片、盖玻片、滤纸、铅笔、标签纸、胶水 3、药品和试剂: 醋酸洋红、改良苯酚品红、无水酒精、70%酒精、1N 盐酸、

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四、实验方法和步骤 1、材料准备 选购具强生活力的蚕豆干种子,经 45 格伦钴 60 照射(或用植物诱变剂等) 处理后。浸种 24 小时,然后置搪瓷盘上摊平催芽,上盖三层纱布保温,于 20℃ 上培养, 待根长 1~2 厘米时, 切取顶端根尖 5 毫米左右于卡诺氏固定液 0.5 小时, 然后换入 70%酒精保存备用。 2、解离 取出经固定的备用根尖,切取具分生组织部分约 1~2 毫米, (去除根冠和伸 长区细胞)置 1NHCl 中解离 10-20 分钟。然后用蒸馏水洗尽材料上盐酸,准备 制片和染色 3、染色制片 取一枚经解离的蚕豆根尖,置载玻片正当中,两片载玻片呈十字形对压,然 后揭开,在有材料的部位各滴上一小滴染色(醋酸洋红或改良苯酚品红) ,再用 盖玻片压片(见实验一) 。 4、镜检: 观察有丝分裂细胞后期的染色体桥和染色体断片,间期细胞的微核。

五、实验报告 1、交染色体结构变异的细胞学制片一张 2、绘制经染色体结构变异处理所观察到的变异染色体,并说明变异特点。

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实验九
一、实验目的 1、了解微核测定的方法与意义

诱变物质的微核测定

2、寻找新的测试系统及新的更安全有效的植物诱变剂

二、实验原理 微核(micronuclei)简称(MCN)是真核类生物细胞中的一种异常结构,往 往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间期,微核呈圆形,游离于 主核之外,大小应在主核 1/3 以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一 样,也具有伍万 DNA 的能力。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒断片产 生的。研究工作证实:整条染色体或好几条也能形成微核。这些断片或染色体在 比细胞分裂未期被两个子细胞核所排斥便形成了第三个核块。 已经证实微核率的 大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关, 这一点和染色体畸变的情况是一 样的。 所以许多人认为可用简易的间期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计 数。由于大量新的化合物的合成,原子能的应用,各种各样的工业废物的排出, 使人们需要有一套高度灵敏,技术简单的测试系统来监视环境的变化。只有真核 类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害。 在这方 面,微核测试是一种比较理想的方法。目前国内外不少部门已把“微核测试用于 辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断 等各方面。 现有的微核测试系统多数是用哺乳动物的骨髓细胞或外周血细胞, 其缺点是 需要一定的培养条件与时间,且细胞同步化困难,微核率低,一般只在 0.2%左 右。近年来,有人采用高等植物花粉孢子,利用天然的同步性作微核测试材料。 取 得 良好的效果。其 中马德修 用一种原产 于美洲的鸭跖草( Tradescantia

paludosa),建立四分孢子期微核率计数(MCN-in-Tetrad)的测试系统,是近年
来普遍认为较好系统之一。该系统用低剂量的化学药物处理或辐射处理,其微核 率可达 10%-67%。 本实验改用简单易行的烟草种子进行发芽, 用一定浓度的盐酸平阳霉素进行 处理,以计微核的诱变率。
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三、实验材料 将烟草种子用 40℃温水中浸泡 40 分钟,用布包住种子轻轻撮,之后,置具 有吸水纸的培养皿中于 25-28℃下催芽, 大约三天左右, 待幼根长到 2-4mm 左右, 将萌芽的种子置入一定浓度的盐酸平阳霉素中进行诱变 5-8 小时, 用清水冲洗三 到五遍,再培养过夜后,用固定液固定待用。

四、实验器具和药品 1、盐酸平阳霉素,配制 20??g/ml、40 ??g/ml、80???g/ml 浓度的溶液 2、固定液:3 甲醇:1 冰醋酸 3、染色液:见实验一 4、实验用具:三角瓶,剪刀,镊子,载玻片,盖玻片等

五、实验说明 处在分裂时期的细胞,对理化因素的处理是有一定敏感时期的。烟草糼根在 17:00-24:00 对平阳霉素的处理较为敏感。处理过程中所产生的落后染色体或 落后染色体组也能在中期染色体中表现。

六、实验步骤 1、将烟草种子用 40℃温水中浸泡 40 分钟,用布包住种子轻轻撮,之后, 置具有吸水纸的培养皿中于 25-28℃下催芽(或置入盛有蒸馏水的三角瓶中 25-28℃振荡培养) ,大约 2-3 天左右,待幼根长到 2-4mm 左右。 2、将萌芽的种子分别置入 20??g/ml、40 ??g/ml、80???g/ml 浓度的盐酸平阳 霉素中进行诱变 5-8 小时,用清水冲洗三到五遍,再培养过夜后,用固定液固定 待用。 3、 、挑取适当经诱变后的幼根,换以 70%,50%,30%酒精中各 10 分钟,蒸 馏水冲洗两次。 4、60℃1NHCL 中 3-5 分钟,再放入 1N 冷 HCL 中 1 分钟,取出用清水稍微冲 洗后,置载玻片上,滴少量染色液,盖上盖玻片,轻轻敲打,使根尖细胞分散, 置显微镜下观察。 5、对照以下图片说明,比较所观察到的结果。
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七、实验报告 画出 3-4 个你所观察到的诱变细胞的实图,

图片说明:1,微核,; 2 小核, ;3,双核, ;4,核出芽;5,核缢缩;6,核耳; 7,桥+落后染色体;8,桥+染色体断片;9 双桥;10,多桥;11 游离染色体, 12 染色体粘连; 注:以上图片为 X 200

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实验十

基因分离的验证

一、实验目的 通过一对相对性状杂交实验,验证基因分离原则。

二、基本原理 植物在减数分裂形成配子的过程中, 同源染色体上的等位基因随着所在染色 体的分离,形成带有不同基因的孢子,进而产生不的配子。因此,将一对相对性 状的亲本杂交,如果这一对相对性状受一对基因控制,且存在于同源染色体上, 具有显隐性关系,那么 F1 产生的雌雄配子,各有两种。理论上数量相等,各种 雌雄配子的结合机会是均等的,因此 F2 中有三种基因型,按表现型归纳为两种, 比例是 3:1。按 F1 与隐性材料测交,后代分离比例为 1:1。按 F1 形成配子时 基因的分离,是难以观察的,而 F1 产生的花粉粒的某些性状是可以观察的。通 过花粉粒即配子性状的分离,提供了在形成配子的过程中,等位基因发生分离的 证据。 由于淀粉存在于植物体的许多细胞中,花粉粒中也有淀粉粒。如果把非糯与 糯性的玉米自交系杂交,F1 是非糯的杂合体,Wxwx,形成配子时,花粉母细胞 进行减数分裂时,等位基因发生分离,结果形成两种不同的孢子,发育成不同的 花粉粒。一部分是带非糯基因(Wx)产生直链淀粉,遇碘液呈蓝色,一部分带糯 性基因(wx)产生支链淀粉,遇碘液呈棕色(或黄色) 。这两种花粉粒理论上数 量相等,其比例为 1:1。

三、实验材料 以腊质(非糯)与粉质(糯性)玉米或水稻杂交种子 F1 的花粉为材料。 第一年将腊质(非糯)与粉质(糯性)玉米或水稻杂交,次年种植 F1 及两 亲本。 穗时, 于前一天将雄花套袋, 次日上午 9—11 时在开花最盛时抖落其花粉, 分藏于冷凉干燥处备用,或于头一天取将要开花而未开花散粉的雄花序,放入固 定液中保存备用。

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四、实验用品 显微镜、计算器、载玻片、盖玻片、烧杯、培养皿、皮头玻棒(或带橡皮头 铅笔) 、金属碘、碘化钾、镊子、解剖针、吸水纸等 药品配制:1%I-KI(碘-碘化钾溶液) :取 2 克碘化钾溶于 5ml 蒸馏水中,加 入 1 克金属碘,待其溶解后再加入 295ml 蒸馏水,保存于棕色瓶中。

五、实验方法和步骤 1、镜检 先镜检亲本,再镜检杂种的花粉粒,方法如下: 挑出少量的花粉于载玻片上, 或取一个花药置载玻片上用镊子夹破花药 壁,让花粉粒充分释放出来,置低倍镜下观察(注意调节显微镜的光线,可 稍为暗一点) ,花粉呈现亮晶乳白色光泽。滴一小滴 I-KI 溶液,盖上盖玻片, 静观花粉粒颜色变化。可见有的花粉粒染成蓝天色,是非糯花粉粒,有的花 粉粒染成棕色(或黄色) ,是糯性花粉粒。对杂种材料每张玻片按 5 点取样, 即取 5 个视野进行观察,记录各种颜色的花粉粒数量。检查的花粉总数要在 5000 个以上,才能进行适合性测验。 镜检时应注意:1、解剖用具如:解剖针、镊子等每次用后随时洗去粘 附的花粉,以免混杂,干扰检查结果;2、调节照明,不要用强光以及直射 光, 调节光栅, 直至两种花粉粒的颜色能明显地区别开, 先在 100 倍下观察, 再在 200 倍下计数;3、必须仔细鉴别花粉粒的颜色,准确地归纳,凡畸形 瘪皱, 特小, 发育不良的花粉粒, 不能作为鉴别糯与非糯的依据, 不能计数。 2、适合性测验 用卡平方法(X2-test)测验实际分离比例是否与理论预期相符,将各观 察数据填入下表:

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玉米糯与非糯 F1 花粉粒分离的卡平方测验 花粉粒 颜 色 蓝 色 观察值 O 理论值 C 偏 差 差 方 D2 差方/理论值 D2/C

D= O-C

棕(黄)色 合 计 X2 =

X2 = ∑[D2/C]

自由度

n = 2-1

查 X2 表可知:n=1 时,P0.05=3.841,即:如所得的 X2<P0.05,则表示符 合,即实际所得的结果符合 1:1 比例;如果得的 X2>P 0.05,则表示不符合, 即实际所得的结果不符合 1:1 比例。

六、实验报告 1、 每人检查玉米 F1 的花粉粒 200 个以上,记录不同类型花粉粒数; 2、综合全班(数人)镜检结果,做卡平方测验,并解释实验结果。

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实验十一 自由组合规律验证

一、实验目的 通过两对相对性状的杂交实验,分析杂种后代的性状表现,验证独立分配规 律,并了解基因互作现象。

二、基本原理 在减数分裂过程中,位于非同源染色体上的两对等位基因在形成配子时, 每对等位基因既随同源染色体的分离而分离, 又随非同源染色体的重组而自由组 合,形成四种基因型的配子,其比例相等。因此,两对基因的杂合体在完全显性 的条件下,其自交子代的表现型分离比例为 9:3:3:1,测交子代的表现型分 离比例为 1:1:1:1。如果基因间发生互作,则随着互作方式的不同,产生的 表现型分离比例有所不同。 玉米籽粒是由果皮、胚乳和胚三部分组成,其中胚乳包括糊粉层和淀粉层。 如图:

已知控制玉米籽粒各种性状的基因,具有下列的遗传表现。果皮颜色性状有 红色、棕色和无色。在基本色素基因 A1 存在时,果皮颜色的表现一般是由 P 和 BP 两对基因互作的结果。 胚乳性状有非甜粒和甜粒,非甜粒外形饱满,甜籽粒外形皱缩。已知皱缩性 状是受位于第 6 染色体上的隐性基因 su 所控制。 糊粉层颜色性状有紫色、 红色和无色。 它主要由 7 对基因 (花青素基因: lal、 A A2a2、A3a3;糊粉粒色基因:Cc、Rr、PrPr;色素抑制基因:Ii) 所控制。只有当

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显性基因 Al、A2、A3、C、R 同时存在、而抑制基因又呈隐性纯合 ii 时,色素才 能形成。而色素形成的类别是由 Prpr 决定的,当显性基因 Pr 存在时,呈现为紫 色,当隐性基因纯合 prpr 存在时则表现为红色。当显性基因 A1、A2、A3、C、R 中缺少任何一个或所有这些色素基因均为显性,但当显性抑制基因 I 存在时,均 表现为无色。 由于控制玉米籽粒、果皮和糊粉层颜色,以及胚乳性状的基因分别位于非同 源染色体上,故这些性状的遗传表现为独立分配和基因互作现象。

三、材料和器材 1、实验材料: 水稻(Oryza sativa):V20A(叶鞘有色、不育)、明恢 77(叶鞘无色、可育)、V 优 77 的 F1、F2 群体。 玉米(Zeamays)果穗:PC5-2 (淡黄色、非糯性、硬粒);2041 (白色、糯性、 硬粒);PC5-2 × 2041 F1 植株的自交果穗。 2、实验仪器及用具: 计算器、计数器等。

四、实验方法和步骤 1、自由组合规律验证 配制玉米自交系 PC5-2 和自交系 2041,将自交系(PC5-2× 20414)杂交,产 生杂交 F1 植株的自交果穗,观察果穗上籽粒性状的分离现象。每一果穗的籽粒 表现是:有色、非糯,有色、糯性,白色、非糯,白色、糯性,四种表现型。每 位(或两位)同学统计一果穗,各组统计实验结果,最后全班汇总,进行 X2 测验。 2、观察基因互作现象 (1) 互补作用 ⅰ:玉米果穗:由于 A、C、R 中缺少任何一个色素显性基因,籽粒均为无 色。因而将籽粒无色、基因型分别为 aaCCRR、AAccRR 或 AACCrr 亲本间杂交, 例如 aaCCRR×AAccRR 产生 F1 为 AaCcRR,由于显性基因 A 和 C 的互补作用, 其 F1 籽粒表现有色。让 F1 植株自交产生果穗,观察果穗上 F2 籽粒的分离现象, 按有色和无色两种表现型记数,其 F2 籽粒色的分离比例为 9 有色(9A_C_RR):7
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无色(3aaCcRR+3AaccRR+1aaccRR)。 ⅱ:水稻植株:V 优 77 叶鞘色由两对基因互作控制,F1 植株表现为有色, F2 叶鞘色分离为紫色和无色。播 F2 种子,光照培养至 4 叶期,观察叶鞘色分离 现象。按紫色和无色两种表现型记数,其 F2 叶鞘色分离比例为 9 紫色:7 无色。 (2) 抑制作用 将有色籽粒 Ccii 与无色籽粒 ccII 的亲本杂交,产生 F1 的自交果穗。然后观 察果穗上籽粒性状的分离现象,按无色和有色两种表现型记数。上述组合中,由 于抑制基因 I 能抑制所有色素基因的表达,故其双亲虽均具有纯合的 A 和 R 基 因,但其 F1 的自交果穗籽粒的性状表现为 13 无色(9C_ I_+3ccI_ +lccii):3 有色 (3C_ ii)。 (3) 隐性上位作用 糊粉层颜色: 将玉米籽粒糊粉层颜色表现为紫色的亲本(CCPrPr)与无色的 亲本(ccprpr)杂交, 产生 F1 的自交果穗。 观察统计 F1 的果穗上籽粒糊粉层颜色的 分离现象。 由于 cc 隐性纯合基因对产生紫色糊粉层的基因 Pr 具有隐性上位作用, 故 F1 植株(CcPrpr)的自交果穗上的籽粒糊粉层颜色的分离比例为 9 紫色(9C_ Pr_):3 红色(3C_prpr):4 无色(3ccPr_+lccprpr)。

五、实验报告 1、观察上述各杂交实验的性状分离和重组的表现型,并写出它们的基因型。各 实验观察结果分别按下表填写和分析。

2、对以上各实验结果进行 X2 测验,从而对各性状的遗传表现作出解释。 (1) 验证自由组合规律。 (2) 观察基因互补现象:a、互作作用;b、抑制作用;c、隐性上位作用

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实验十二

人类 ABO 血型检查

一、实验目的 了解基因座位(locus)和基因位点(site)的关系,基因突变、复等位基 因、基因共显性概念及基因频率的分布。

二、基本原理 血液的组成是: 血浆:优良溶剂,含蛋白质、葡萄糖、无机盐、代谢产物、O2、CO2 血液 血细胞 红细胞:含血红蛋白,容易和 O2 和 CO2 结合 白细胞:具免疫(淋巴细胞) ,吞噬机能 血小板:止血,凝血 血型:指红细胞上所含抗原的不同,应用抗原与抗体的反应,产生凝集与否,对 血型进行判断: A 型:红细胞上具有 A 抗原,能与特异性抗体 A 发生凝集反应,而不与 B 抗体发 生凝集反应。 B 型:红细胞上具有 B 抗原,与特异性抗体 B 发生凝集反应,而不与 A 抗体发生 凝集反应 AB 型:红细胞上具有 A 抗原和 B 抗原,既与抗体 A 发生凝集反应,也与抗体 B 发生凝集反应 O 型:红细胞上缺乏 A 抗原,也缺乏 B 抗原,均不与抗体 A 或抗体 B 发生凝集反 应。

三、材料和器材 1、实验材料: 参试人员的手指毛细管血液两滴 2、实验仪器及用具: 显微镜、载玻片、消毒药棉、一次性采血针 3、药品和试剂: 抗 A 血清、抗 B 血清、70%乙醇
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四、实验方法和步骤 1、在载玻片上划分两格,分别标明 A 与 B,如下图: A B

2、在 A 处滴加抗 A 标准血清一滴,在 B 处加抗 B 标准血清一滴; 3、用 70%酒精药棉消毒手指采血部位(一般为无名指末端) ,再用此药棉消毒一 次性采血针; 4、用采血针刺手指,挤出血液; 5、一滴血液滴在加抗 A 血清处,另一滴血液滴在加抗 B 血清处; 6、分别用采血针调匀,调匀一处血液后揩擦采血针,再调另一处; 7、两分钟内肉眼观察反应结果,或用最低倍显微镜观察其凝聚的情况,反之可 能产生假凝集现象。 血型 A B O AB 抗 A 试剂 + - - + 抗 B 试剂 - + - +

+:表示凝集反应;-:表示无凝集反应

五、实验报告 通过实验判定自己及同学的血型。

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实验十三

人类 X 染色质的观察

一、实验目的 掌握观察与鉴别 X 染色质的简易方法,识别其形态特征及所在部位,为进一 步研究人体染色体的畸变与疾病提供参考条件。

二、基本原理 1、X 染色质的发现 1949 年,加拿大学者 Barr 等人在猫的神经元细胞核中首次在雌猫体内发现 一种染色较深的浓缩小体,而在雄猫中则没有这种结构。进一步研究发现,除猫 外,其他雌性哺乳动物(包括人类)也同样有这种显示性别差异的结构。而且不 仅是神经元细胞, 在其他细胞的间期核中也可以见到这一结构。 称之为巴氏小体, 也称为 X 染色质。 正常女性的间期细胞核中紧贴核膜内缘有一个染色较深,大小约为 1 微米 的三角形或椭圆形小体,即 X 染色质。间期核内 X 染色质的数目总是比 X 染色体 的数目少 1。正常女性有两条 X 染色体,因此只有一个 X 染色质;若有三条 X 染 色体,就会有两个 X 染色质,余此类推。正常男性只有一条 X 染色体,所以没有 X 染色质。 2、莱昂假说(Lyon hypothesis) 为什么正常男女之间的 X 染色质存在差异?女性两个 X 染色体上的每个基因 座的两个等位基因所形成的产物, 为什么不比只有一个 X 染色体半合子男性的相 应基因产物多?为什么某一 X 连锁的突变基因纯合子女性的病情并不比半合子 的男性严重?1961 年,Mary Lyon 提出了 X 染色体失活的假说,即 Lyon 假说对 这些问题进行了解释。其实验依据是对小鼠 X 连锁的毛色基因的遗传学观察。发 现雌性小鼠毛色杂合体不表现显性性状,也不是中间类型,而是显性隐性两种颜 色嵌合组成斑点状(不是共显性) 。而雄性小鼠却从不表现斑点状毛色,而是显 性或隐性单一颜色的毛色。 Lyon 假说的要点如下: (1)雌性哺乳动物体细胞内仅有一条 X 染色体是有活性的。另一条 X 染色体在 遗传上是失活的,在间期细胞核中螺旋化而呈异固缩为 X 染色质。
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(2)X 染色体的失活是随机的。异固缩的 X 染色体可以来自父方或来自母方。 但是,一旦某一特定的细胞内的一个 X 染色体失活,那么此细胞而增殖的所有子 代细胞 也总是这一个 X 染色体失活,即原来是父源的 X 染色体失活,则其子女 细胞中失活的 X 染色体也是父源的。因此,失活是随机的,但是,是恒定的。 (3)X 染色体失活发生在胚胎早期,大约在妊娠的第 16 天。在此以前的所有细 胞中的 X 染色体都是有活性的。 3、剂量补偿: 细胞内的 X 染色体数目超过两条时,仍只有一条保持活性,其余的都形成异 固缩的 X 染色质。正常男性只有一条 X 染色体,所以 X 染色质的数目为 0。45, XO 性腺发育不全的患者虽然是女性,但是因为只有一条 X 染色体,所以细胞内 无 X 染色质。一个细胞中所含的 X 染色质的数目等于 X 染色体数目减一。 剂量补偿: 由于雌性细胞中的两个 X 染色体中的一个发生异固缩 (也称为 Lyon 化现象) ,失去活性,这样保证了雌雄两性细胞中都只有一条 X 染色体保持转录 活性,使两性 X 连锁基因产物的量保持在相同水平上。这种效应称为 X 染色体的 剂量补偿。 需要指出的是,失活的 X 染色体上基因并非都失去了活性,有一部分基因仍 保持一定活性,因此 X 染色体数目异常的个体在表型上有别于正常个体,出现多 种异常的临床证状。如 47,XXY 的个体不同于 46,XY 的个体;47,XXX 的个体 不同于 46,XX 的个体,而且 X 染色体越多时,表型的异常更严重。

三、材料和器材 1、实验材料: 口腔颊部粘膜细胞;带毛囊头发 2、实验仪器及器具: 显微镜、灭菌玻璃片、酒精棉球 3、药品和试剂: 60%冰醋酸、45%冰醋酸、改良苯酚品红

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四、实验方法和步骤 1、口腔颊部粘膜细胞巴氏小体观察 刮取颊部粘膜上皮细胞(用灭菌玻璃片)→涂片(两片 45°角)→60%冰醋 酸固定 5 分钟→吸去冰醋酸,用改良苯酚品红染色 1-2 分钟→压片→镜检 2、发根细胞巴氏小体观察 拔取带毛囊头发一段→45%冰醋酸解离 5 分钟→剥取毛囊→染色 2-3 分钟→ 压片观察 在女性间期细胞核内侧靠近核膜处有约 1 微米大小的反光极强的颗粒状亮 点, 即为巴氏小体。 材料不同, 观察结果可能有不同, 且必须和核仁区别开来 (核 仁往往离核膜较远或接近核中央部位) 。 正常女性口腔粘膜细胞中约 30-50%有一个巴氏小体,男性则低于 1-2%。 注意事项: 1. 刮口腔上皮前要漱口; 2. 刮时用灭菌玻璃片的宽边,勿用一角,以免划破口腔; 3. 第一次刮下的脱落细胞用酒精棉球擦去,在原位重复刮一下制片; 4. 盛放酒精棉球的小广口瓶,瓶盖用完即时盖好; 5. 涂片略干再加改良苯酚口红; 6. 染色时间不要太长,否则核质着色深,X 染色质体不易区分; 7. 毛囊细胞要充分解离,压片前可先用解剖针敲片,使细胞解离; 8. 可数细胞的标准:核质染色呈网状或颗粒状;核膜清晰,无缺损;染色 适度,周围无杂质。

五、实验报告 1、分别观察男女各 50 个可数细胞,计算显示 X 染色质所占百分比。 2、观察中选绘 4-5 个典型细胞,示明 X 染色质体的形成和部位。

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实验十四

小白鼠骨髓细胞染色体制片技术

一、实验目的 1、掌握哺乳动物骨髓细胞染色体玻片标本的制备方法。 2、观察动物染色体的形态特征,统计小白鼠体细胞中染色体数目。

二、基本原理 制备染色体标本是细胞遗传学最基本的技术, 优良的染色体制片是进行染色 体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。 制备动物染色体标本原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬液中 得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中获得。 小型动物的染色体制片最好最有效的材料是骨髓组织,且程序简便。另外, 在骨髓细胞中,有丝分裂的指数相当高,因此可以直接得到中期细胞而不必象淋 巴细胞或其它组织那样要经过体外培养。中期分裂相主要来自成红系统,也来自 其它各种骨髓母细胞,单核细胞和淋巴细胞的分裂相较少,不过在染色体制片上 已无法区别上述来源。多倍体的中期分裂相往往来自于巨核细胞。 对大型动物通常采用对股骨、脊或胸骨穿刺术吸取红骨髓,小型动物多采用 剥离术取股骨以获得骨髓细胞。通过骨髓得到的染色体是比较简便的,一般无须 无菌操作,在临床上多用于白血病的研究。在实验条件下,这种染色体是机体内 真实情况的反映, 因此在药品检验、 环境监测、 食品检验等工作以及致畸、 致癌、 致突变等研究中, 利用骨髓制片的方法易于观察毒性物质在体内对细胞和染色体 的影响。 不过,在有些情况下,穿刺取骨髓较困难,或者希望对同一个体材料进行连 续的对比取材,以观察药物或环境因素对人类或动物的影响及染色体的动态变 化,这时一般采用外周血细胞而不伤害供血者直接制备染色体的技术则十分有 利。

三、材料和器材 1、实验材料: 两个月龄的健康小白鼠(Mus musculus) 。
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2、实验仪器和用具: 解剖器具(刀、镊等) 、注射器(1ml) 、离心机、水浴锅、显微镜、吸管等。 3、药品和试剂: 秋水仙素、 固定液 (甲醇:冰醋酸 = 3:1) Giemsa 染液、 、 磷酸缓冲液 (pH6.8) 等。

四、实验方法和步骤 1、 预处理:实验前 3—4 小时,取健康小鼠,每只腹腔注射 0.01%秋水仙素 0.3—0.4ml。注意不要伤及内脏。 2、 取股骨:用一只手的拇指和食指按住小鼠的头部,另一只手拉住它的尾巴, 用力向后拉断其颈椎。处死后立即用剪刀剪开后腿上的皮毛,取出小鼠的股 骨,剔除上面的肌肉,洗净。 3、 取骨髓细胞:将股骨纵向剪开,剔除深红色的骨髓,放至装有蒸馏水的小烧 杯中。用剪刀把骨髓剪碎,至残渣变白,把上清液倒入离心管中。 4、 低渗处理:将离心管中的液体用蒸馏水补充到刻度,然后置于 37℃的恒温水 浴锅内保温 30 分钟。 5、 离心固定:将离心管放入离心机内,平衡后,以 1000 转 / 分的转速离心 10 分钟,然后用吸管移去上清,加甲醇-冰醋酸的固定液至刻度,固定 30 分钟, 如前,同速度同时间离心一次,弃去上清,留约 0.2ml,将沉淀轻轻吹起成 细胞悬液。 6、 滴片:用镊子从冰水中取出预冷的载玻片,甩掉上面的冰水后迅速用吸管吸 取细胞悬液滴在载玻片上 2—3 滴(滴片的高度 30—50cm) ,立即用嘴向同一 方向吹,使细胞染色体散开,然后置室温下干燥或置于酒精灯火焰上微微加 热干燥。每人做两张滴片,注意平均分配细胞悬液。 7、 染色:取一张干燥的滴片放入装有 1%Giemsa 染液的染色缸中染色 30 分钟, 另一张不染,留下次实验用,染色完毕,用自来水冲洗后干燥。 8、 镜检:将制备好的玻片标本置于显微镜下,首先用低倍镜寻找细胞和中期分 裂相,然后换用中高倍镜观察染色体的形态,统计染色体的数目。

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五、实验报告 1、绘制小白鼠骨髓细胞染色体核型图。 2、实验中的预处理的目的是什么? 3、实验过程中的关键步骤有哪些?要如何把握才能确保实验的成功?

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实验十五

小白鼠骨髓细胞染色体显带(C 带)技术

一、实验目的 1、了解染色体显带技术的基本知识; 2、学习小白鼠骨髓细胞染色体显带(C 带)技术。

二、基本原理 染色体显带(Banding)技术是一种用染料对染色体进行分化染色的方法。 就是将染色体经酸、碱、温度等处理后,再以染料染色,或单用某些荧光染料就 可以染出深浅不同或明暗各异的带纹的纵向结构。 此项技术发明于本上世纪六十 年代末、七十年代初,发展至今已是非常成熟。1971 年在巴黎召开第四次国际 人类遗传学会议上制定了人类染色体识别的统一体制, 订出了各条染色体分带的 宽窄、位置和名称;1981 年又公布了《人类细胞遗传学高分辨率显带命名国际 体制》 ,这些规定目前为世界各国学者所普遍采用。在我国,染色体显带工作起 步于 70 年代,主要以核型为主,临床上则以染色体异常疾患为主。目前,人类 染色体显带在一些医院中正成为常规化验项目之一。 染色体显带技术在人类和动物方面的研究取得了显著的成果, 植物染色体显 带虽然一直落后于人类及动物染色体显带技术,但近些年来也取得了很大的进 展,主要原因是植物染色体带纹简单,使得该技术在实际应用上受到限制。 显带技术可以分成两大类:一类产生分布于整个染色体长度上的带纹,如 Q 带、G 带、R 带等;另一类则只能使少数特点的带或结构染色,如 C 带(使着丝 粒即异染色质着色) 带(使染色体端粒着色) 带(使核仁组织区即次级缢 、T 、N 痕着色) 。 不同的显带技术采用的处理方法各异, 经过处理使染色体的结构和组成差异 表现为对染料亲和性的不同。对各种不同带型产生的机理有各种看法和推断,目 前还在进一步探索中。 由于经显带处理后,染色体上带纹的数目、位置、宽窄及染色的深浅都具有 相对的稳定性,具有一定的种属特异性,所以可以将它作为一种更精细的标志, 使我们能更有效地鉴别染色体,分析染色体组型,进行物种间亲缘关系的鉴定,

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更深入地研究染色体的结构和功能。随着显带技术的不断发展完善,对细胞学、 遗传学、分类学、育种学、医学等都有十分重要的意义。 C 带是显带技术中最简单的一种带型。C 带的操作程序特别能使着丝粒型的 异染色质着色,这种异染色质常位于着丝粒周围并常含有高度重复的随体 DNA。 因通常在着丝粒(centromere)处出现,故称之为 C 带。 关于 C 带产生的机理, 有一种说法认为由于异染色质部分结构紧密且主要结 合组蛋白, 氢氧化钡或其他碱性物质处理时异染色质区被保护而优先提取了常染 色质区即非 C 带区的 DNA,致使染色体臂着色浅而异染色质部分着色深,从而产 生 C 带。 操作中氢氧化钡溶液处理的时间是全过程最关键的一步, 染色体标本在氢氧 化钡溶液中处理时间过长,会使染色体均为浅色,反之则会染为紫色,表现不出 分化染色。

三、材料和器材 1、实验材料: 小白鼠骨髓细胞染色体标本。 2、实验仪器和用具: 恒温水浴锅、立式染色缸等。 3、药品和试剂: 0.2mol / L 盐酸、5%Ba(OH)2、2×SSC 溶液、Giemsa 染液等。 2×SSC 溶液(0.3mol / L NaCL + 0.03mol / L 柠檬酸钠) :称取 NaCL117.53 克和柠檬酸钠 8.8233 克置于容量瓶中加至 1000ml。

四、实验方法和步骤 1、制片:见实验十四。 2、HCl 处理:室温下,将上次实验未染色的小白鼠骨髓细胞染色体标本放入 0.2mol / L 盐酸溶液中处理 1 小时,然后水洗。 3、Ba(OH)2 处理:将标本浸于 50℃的 5%Ba(OH)2 溶液中,处理 10—30 秒(随气 温和标本龄而变动)后,水洗。 4、2×SSC 处理:将标本转入 60℃的 2×SSC 溶液中处理 1 小时,水洗。
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5、染色:将标本放入 Giemsa 染液中染色 10 分钟,水洗。 6、镜检:将标本干燥后用显微镜高倍物镜检查显带标本,选择染色体分散均匀, 显带明显的分裂相。

五、实验报告 1、绘制你所制小白鼠骨髓细胞染色体 C 显带的带型图。 2、染色体显带技术的概念是什么?它是如何分类的?该技术有哪些实际应用? 3、如果实验未能取得预期效果,请分析原因。

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实验十六

人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片

一、实验目的 学习和掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法。

二、基本原理 人体的 1ml 外周血中一般含有约 1-3×106 个小淋巴细胞,通常它们都处于 间期的 GO 和 G1 期。在培养条件下给予药物刺激时,经过 53-72 小时可在培养物 中获得大量的有丝分裂细胞,供染色体标本制备和分析之用。这种外周血培养方 法是在 1960 年由 Moorhead 等所建立的。 人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板,其中红细胞和血小板不 能离体培养。血细胞中的小淋巴细胞处于间期的 GO 和 G1 期。在培养时给予药物 刺激,可转变为淋巴细胞,随后进行有丝分裂。这样经过 66-72 小时短期培养、 秋水仙素处理,低渗和固定,就可获得大量有丝分裂的细胞。这种微量全血培养 技术已得到了广泛的应用。 1912 年,Warfter 最先研究人类染色体。1923 年,报道人类染色体的二倍 体为 48 条。 细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。 技术突破主要在于: (1) 人体外周血淋巴细胞培养和 PHA 的应用 : PHA 是从菜豆种子中提取出来的, 大量的 PHA 具有凝血作用。如果适合,可刺激细胞转为母细胞,从而进行有丝分 裂。 (2)秋水仙素的应用:秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期,使染色体个体大, 结构清晰,缩短适度,细胞质粘度降低。 (3)低渗处理(水或 0.075mlKcl)使红细胞胀破,白细胞胀大,染色体空间变 大,易伸展,便于观察。 1956 年,J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞,计数人体细胞染色体数 为 46 条。1960 年,Moorhead 建立人体外周血培养技术,使染色体的研究跃进一 步。1968 年,T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。

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三、材料和器材 1. 实验材料: 人的外周血淋巴细胞 2. 实验仪器和用具: 2ml 灭菌注射器,离心机,电子天平,恒温培养箱,除菌滤器,显微镜,酒 精灯,载玻片等。 3. 药品和试剂: RPMI1640 培养基,植物血凝素(PHA) ,小牛血清,肝素,双抗,秋水仙素, 低渗液:0.075Mol/L Kcl,卡诺氏固定液,Giemsa 染色液,0.1Mol/L 磷酸缓冲 液(pH7.4-7.6)等。 磷酸缓冲液的配制 0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6): A: Na2HPO4·12H2O KH2PO4 28.8 克 2.67 克 B: Na2HPO4·7H2O NaH2PO4·2H2O 2.164 克 0.3 克

溶解于 1000 ml 双蒸水中

溶解于 1000 ml 双蒸水中

四、实验方法和步骤 1. 器皿清洗灭菌 清洗:洗衣粉煮、洗液浸泡,流水冲洗,双蒸水冲洗 灭菌:烘箱干热灭菌 160℃,30 分钟(玻璃器皿) 湿灭 15 磅,30 分钟(药品,KCl,秋水仙素) 2. 培养基的制备与分装 成分:PRMI1640 80%(培养液:多种氨基酸,维生素,糖,无机盐) 小牛血清 20% (细胞繁殖促进剂,4℃保存,用前 50℃灭活,30 分钟) PHA0.04mg/ml 双抗或庆大霉素:100 单位/ml 灭菌:RPMI 1640 经抽滤灭菌 分装:5ml/ 瓶,4℃保存 3. 接血培养 接血:注射器用肝素湿润后抽静脉血 0.3ml/瓶,7 号个头 15 滴。
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培养:37℃恒温培养 66-72 小时,不时摇动。 阻断:收集前 2-4 小时加秋水仙素,使其终浓度为 0.4-0.8μ g/ml(7 号针头 2 滴,6 号针头 3 滴)。 4. 细胞悬浮液制备与制片(离心管中操作) (1)收集细胞:2000rpm 10 分钟,弃上清,用吸管打匀沉淀。 (2)低渗:加入 5ml 温育的 0.075Mol/L Kcl,用滴管轻轻冲打成细胞悬浮液, 37℃培养 30 分钟,使红细胞、血小板破碎,白细胞膨胀。 (3)预固定:加管壁缓缓加入 1ml 固定液(以免砸碎细胞) ,静置 5 分钟。固 定液使红细胞破裂后出来的血红蛋白变性,防止白细胞聚集成团。 (4)收集白细胞:2000rpm,10 分钟,弃上清。 (5) 再固定: 加入 5ml 固定液, 静止 30 分钟, 白色絮状物为白细胞。 2000rpm, 10 分钟,弃上清。 (6)制片:加入固定液 0.4ml,用滴管小心冲打成细胞悬浮液。距 4℃预冷的 载玻片半米处滴片,2-3 滴/片,吹片。 (7)干燥:37℃干燥。 (8)染色:用 Geimsa 染色液染色 30 分钟,然后倒去多余染液,并用蒸馏水 轻轻冲洗。 (9)镜检:待稍干后,在显微镜下观察。

五、实验报告 选择染色体清晰,分散度好的细胞进行显微摄影,进行核型分析。

人体淋巴细胞染色体(46,XX)
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实验十七

人类染色体核型分析

一、实验目的 学习和掌握人类染色体核型分析的方法,进一步识别和鉴定人类染色体。

二、基本原理 核型(karyotype)一词在 20 世纪 20 年代首先由苏联学者 T. A. Levzky 等人 提出。核型分析的发展有三项技术起了很重要的促进作用,一是 1952 年美籍华 人细胞学家徐道觉发现的低渗处理技术,使中期细胞的染色体分散良好,便于观 察;二是秋水仙素的应用便于富集中期细胞分裂相;三是植物凝集素(PHA)刺 激血淋巴细胞转化、分裂,使以血培养方法观察动物及人的染色体成为可能。 核型是指染色体组在有丝分裂中期的表型,包括染色体数目、大小、形态特 征等。核型分析是对染色体进行测量计算的基础上,进行分组、排队、配对并进 行形态分析的过程。 核型分析对于探讨人类遗传病的机制、 物种亲缘关系与进化、 远缘杂种的鉴定等都有重要意义。 将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征描 绘下来,再按长短、形态等特征排列起来的图像称为核型模式图,它代表一个物 种的核型模式。 1960 年,丹佛会议上,提出了人类有丝分裂染色体命名标准体制草案,为 以后的所有命名方法奠定了基础。1963 年,伦敦会议上,正式批准 Patan 提出 的 A、B、C、D、E、F、G 七个字母表示七组染色体的分类法。1966 年,芝加 哥会议上,提出人类染色体组和畸变速记符号的标准命名体制。 A 组(1-3 号) 1 号:最大的中央着丝粒染色体,长臂靠近着丝粒外有次缢痕。 2 号:最大的亚中着丝粒染色体。 3 号:中央着丝粒染色体,比 1 号小三分之一。 B 组(4-5 号) :为较大的亚中央着丝粒染色体,二者不易区分。 C 组(6-12 号,X) :中等近中央着丝粒染色体,彼此难区分。 6、7、9、11 号:着丝粒略近中央。 8、10、12 号:偏离中央。 9 号:q 有次缢痕。
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X 位于 6、7 之间。 D 组(13-15 号) :中等近端着丝点染色体,p 常有随体。 E 组(16-18 号) 16 号:中等中央着丝粒染色体,q 上有次缢痕。 17 号:较小,近中央着丝粒染色体。 18 号:较小,近中央着丝粒染色体,p 比 17 号更短。 F 组(19-20 号) :小的中央着丝粒染色体,彼此不易区分。 G 组(21-22 号,Y) :小的近端着丝粒染色体。 21、22 号:p 常有随体,q 常呈分枝状彼此不易区分。 Y:p 无随体,q 通常平行靠近。

三、材料和器材 1、实验材料: 人外周血淋巴细胞染色体标本 2、实验仪器及用具: 摄影显微镜,显微测微尺,染色缸,吹风机等。 3、药品和试剂: Geimsa 染色液等。

四、实验方法和步骤 1、将人外周血淋巴细胞染色体标本放入染色缸,用 Geimsa 染色液染色 10-15 分 钟→在盛水塑料杯中冲涮→风干→镜检 观察细胞的标准为: (1)细胞完整,轮廓清晰,染色体分布在同一水平面上。 (2)染色体形态和分布良好。 (3)最好无重叠,即使有个别重叠,也要能明确辩认,以免差错。 (4)所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段,即染色体螺旋化程度或染色体长短 大致一样。 (5)在所观察的细胞周围,没有离散的单个或多个染色体存在,以免影响计数。

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2、显微摄影:将制好的片子放在数码摄影显微镜下进行拍摄,以供分析。 3、核型分析 核型:一个细胞内所有染色体按一定顺序排列起来,代表着某一个体所有细胞 的染色体组成,包括数目、形态、大小等,分为 A、B、C、D、E、F、G 等七 组和一组性染色体。 组型:把核型按模式图的形式表现出来,代表一个种的染色体组成。 4、完成染色体组型分析,提交报告。

五、实验报告 1、显微镜分析:观察标准细胞 20-50 个。 2、显微照片分析: 染色体计数;染色体测量; 相对长度=单个染色体长度/ 整套单倍染色体总长×100 臂比率=q/p 着丝点指数=p/(p+q) ×100 3、配对:据大小、着丝点位置、随体有无,最后定细胞组染色体。 4、染色体排列分组:p 向上,q 向下,着丝点排列在一条直线上。 5、制作核型分析板,作出书面报告。

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实验十八

植物染色体组型分析

一、实验目的 分析植物细胞有丝分裂中期染色体数目、大小、着丝粒位置和随体等形态特 征,学习染色体组型分析的方法。为遗传育种研究提供细胞学证据。

二、基本原理 各种生物染色体的形态,结构和数目都是相对稳定的。每一生物细胞内特 定的染色体组成叫染色体组型。染色体组型分析也称核型分析。通过一定的方法 制得染色体有丝分裂的玻片标本,经数码显微照相,可获得染色体照片。从染色 体玻片标本和染色体照片的对比分析,进行染色体分组,并对组内各染色体的长 度,着丝点位置,臂比和随体有无等形态特征进行观测和描述,从而阐明生物的 染色体组成,确定其染色体组型,这种过程称为染色体组型分析。

三、材料和器材 1、实验材料: 蚕豆(Vicia faba, 2n=12) ;洋葱(Alliums cepa, 2n=16) ;大麦(Hordeum

vulgare, 2n=14) ;黄麻(Tiliaceae Corchorus, 2n=14) 。
2、实验仪器及用具: 显微镜,显微照相系统,目镜测微尺,镜台测微尺,计算器,透明尺,剪刀, 坐标纸,胶水以及制作有丝分裂玻片所需的用具。 3、药品和试剂: 制作有丝分裂玻片所需的药品和试剂(见实验一) ;

四、实验方法和步骤 1、染色体标本玻片的制作 染色体组型分析一般用有丝分裂中期的分裂细胞,通常采用植物根尖细胞。 有丝分裂中期的染色体具有典型的形态特征, 便于进行分析, 制作方法见实验一。 2、镜检和测量 当染色体玻片制好后,放在显微镜下观察,选出符合染色体组型分析要求
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的细胞, 这些细胞是处于有丝分裂中期, 染色体分散良好, 没有重叠, 数目完整, 随体和着丝点明显,没有断裂,着色鲜明,形态清晰,且各条染色体处于同一平 面上。 选择染色体较平直的一条或几条,用目镜测微尺测量其长度。 3、显微照相 将在显微镜下选定的符合要求的细胞进行数码显微照相(可用 10×100 倍 的油镜) ,可得到染色体形态清晰的照片,并计算放大倍数。 4、测量和计算 (1) 测量:在放大的照片上用透明尺准确地量出各条染色体的总长度和每 条染色体两臂的长度(分别量到着丝点的中部) 。随体的长度可计入或不计入染 色体长度之内,应注明。染色体弯曲不能用直尺测量时,可先用细线量取染色体 相等的长度,再用尺量出细线的相应长度。 (2) 计算:
ⅰ:放大倍数= 放大照片上某染色体的照相长度(μ ) 目镜测微尺测定的实际长度(μ ) 或= 放大相片的台测微尺长度(mm) 台测微尺实际长度(μ )

ⅱ:绝对长度=

某染色体(臂)照片长度(μ ) 放大倍数

ⅲ:相对长度: (取小数点后两位数) 某染色体(臂)绝对长度 = 1/2 全部染色体的总长度 某染色体(臂)长度 或= 染色体体组总长 ×100% ×100%

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ⅳ:臂比: (取小数点后两位数) 长臂的长度 短臂的长度



ⅴ:染色体形态测量数据表
染色 体序 号 长臂 短臂 全长 长臂 短臂 全长 放大相片长度(mm) 绝对长度(μ m) 相对 长度 染色 臂比 体类 型 备注

ⅵ:剪贴和配对 将放大照片上的各条染色体剪下,根据目测和染色体的相对长度、臂比、着 丝粒位置、次缢痕的有无和位置、随体的有无和形态大小等特征,进行同源染色 体配对。 ⅶ:排列和粘贴 将配对好的染色体按照由大到小的顺序依次排列起来。排列时把各对染色体 的着丝粒排在一条直线上,并且使短臂在上,长臂在下。等长的染色体,把短臂 较长的染色体排在前面。 随体染色体排在最后, 性染色体和额外染色体单独排列。 已排好的同源染色体按染色体编号先后顺序粘贴在绘图纸上,粘贴时着丝粒 要处在同一直线上。 ⅷ:分类
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根据着丝点的位置,确定染色体的形态类型,臂比是反映着丝点在染色体上 的位置。
臂比 1.0 1.0-1.7 1.7-3.0 3.0-7.0 7.0 以上 染色体类型 正中着丝粒染色体 中着丝粒染色体 近中着丝粒染色体 近端着丝粒染色体 端着丝粒染色体 符号 M m sm st t

具随体染色体(sat)用*标出。 5、翻拍和绘图 将剪贴排列的染色体组型图进行翻拍,并用座标纸绘制成染色体模式图。

五、实验报告 1、提交植物染色体组型剪贴图。 2、植物染色体组型的模式图。 3、染色体形态测量数据。 4、简述本实验的染色体组型结果,核型公式。

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实验十九

植物染色体显带技术和带型分析

一、实验目的 学习和掌握植物染色体 Giemsa 显带技术和带型分析方法,进一步鉴别植物 染色体组和染色体结构。

二、基本原理 对植物有丝分裂中期染色体进行酶解,酸、碱、盐等处理,再经染色后,染 色体可清楚地显示出很多条深浅、 宽窄不同的染色带。 各染色体上染色带的数目、 部位、宽窄、深浅、相对稳定,为鉴别染色体的形态提供依据,也为细胞遗传学 和染色体工程提供新的研究手段。 植物染色体显带技术包括荧光分带和 Giemsa(吉姆萨)分带两大类。在植物 染色体显带上最常用的是 Giemsa 分带技术,其中 C 带和 N 带较为常用。C 带的 形成认为是高度重复序列的 DNA(异染色质)经酸碱变性和复性处理后,易于复 性,而低重复序列和单一序列 DNA(常染色质)不复性,经 Giemsa 染色后呈现 深浅不同的染色反应。这种差异反映染色体结构的差异。

三、材料和器材 1、实验材料: 洋葱、蚕豆、大麦、黄麻的根尖。 2、实验仪器及用具 显微镜(附摄影装置) ,半异体致冷器,冰箱,恒温水浴锅,电子天平,液 态氮装置,容量瓶,试剂瓶烧杯,染色缸,载玻片,盖玻片等 3、药品和试剂 0.05%秋水仙碱溶液,卡诺氏固定液,无水酒精,盐酸,冰醋酸,Giemsa 液, 5%氢氧化钡, 2×SSC 溶液, NaH2PO4 溶液, 1M 1%纤维素酶和果胶酶混合液, 1/15 磷酸二氢钾和 1/15 磷酸氢二钠缓冲液等。

四、实验方法和步骤 1、染色体分带
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(1) 材料准备:洋葱鳞茎发根长 2cm 左右,切取根尖进行预处理。蚕豆种 子浸种发芽,待幼根长至 3cm 左右,切取根尖进行预处理。蚕豆主根根尖切去后 继续长出的次生根,可再切取次生根根尖进行预处理。大麦种子发芽至幼根长 1cm 左右,切取白色的幼根进行预处理。 (2) 预处理:洋葱和蚕豆根尖在 0.05%秋水仙碱溶液中预处理 2-3h。处 理温度一般为 25℃。预处理后须用清水冲洗多次,洗去药液。 (3) 固定:以上各材料经预处理后,放入卡诺氏固定液中固定 0.5-24h, 转换到 70%酒精,置于冰箱中保存备用。 (4) 解离:洋葱、蚕豆根尖在 0.1N 盐酸溶液中置于 60℃恒温下处理 10~15min。大麦根尖在 37℃下用 1%果胶酶处理 30min,然后在 0.1N 盐酸溶液 中置于 60℃下处理 5min。 上述材料用酸处理后,须用蒸馏水冲洗多次,除去残留酸液,否则将会影响 染色体的显带效果。 (5) 压片:与常规的植物染色体压片方法相同。在 45%醋酸中压片,制成 白片。在相差显微镜下检查染色体分散程度,挑选出分裂相多,染色体分散均匀 的片子。选出的玻片经液氮、CO2 干冰或半导体致冷器冻结,用刀片揭开盖玻片。 置室温下干燥。 (6) 空气干燥:脱水后的染色体标本一般需经过 4-7 天的空气干燥,再 进行分带处理。不同的材料所需干燥的时间不一样。洋葱要求空气干燥的时间较 严,未经空气干燥的染色体不显带,干燥一周后经显带处理显示末端带,干燥半 个月后能同时显示末端带和着丝点带。而蚕豆、黑麦、大麦则要求干燥时间不十 分严格。 (7) 显带处理:空气干燥后的染色体标本即可进行显带处理。处理方法不 同,可显示不同的带型。 C 带 HSG 法(Hydrochloric acid Saline Giemsa method)将空气干燥后的 洋葱、蚕豆染色体标本浸入 0.2N 盐酸(25℃左右)分别处理 30 和 60min。用蒸 馏水冲洗多次后,在 60℃的 2×SSC 溶液中保温 30min,再用蒸馏水冲洗数次, 室温风干,即可染色。 BSG 法(Barium Saline Giemsa method) 将空气干燥后的黑麦、大麦的染

色体标本浸入盛有新配制的 5%氢氧化钡饱和液的染色缸中,在室温条件下处理
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5-10min,然后用蒸馏水小心地多次冲洗浮垢后,在 60℃的 2×SSC 溶液中保温 60min,再用蒸馏水冲洗数次,室温风干,即可染色。 N带 将黑麦、大麦种子发根 1cm 左右切取,在 0℃冰水中预处理 24h。卡诺

氏固定液中固定半小时以上,1%醋酸洋红染色液中染色 2h,然后在 45%醋酸中 压片,冰冻法揭开。尔后在 45%醋酸 60℃条件下脱色 10min,再在 95%酒精室 温下脱水 10min,气干过夜。最后在 1M NaH2PO4 溶液中 95℃恒温下保温 2min,蒸 馏水冲洗,气干后即可染色。 (8) 吉姆萨染色:吉姆萨母液用 1/15M 磷酸缓冲液按一定的比例稀释。例 如, 份磷酸缓冲液加 1 份吉姆萨母液稀释即为 10: 一般都采用扣染法染色。 10 1, 在一干净的玻璃板上,对称放置两根牙签或火柴棒,距离与载玻片上的材料范围 相等。将带有材料的玻片翻转向下,放在牙签上,然后沿载玻片一边向载玻片与 玻璃板之间的空隙内缓缓滴入染色液,在室温下染色。染色时间因材料而异,因 吉姆萨染料批号不同、质量上有差异,因此其染色液浓度和染色时间需作适当调 整。下列材料的染色浓度和染色时间可供参考。
蚕豆 洋葱 大麦 黑麦 pH7.2 pH7.2 pH6.8 pH6.8 10:1 10:1 10:1 20:1 30min 15min 30min 30min

(9) 镜检和封片:染色后的玻片标本,用蒸馏水洗去多余染料,染色过深可 用磷酸缓冲液脱色。室温下风干后即可镜检,挑选染色体带型清晰的片子,用树 胶封片。 2、染色体带型分析 经过上述处理的植物染色体标本,可以显示出 C 带或 N 带的带型,一般有以 下四种带型: (1) 着丝粒带(C 带) 带纹分布在着丝粒及其附近,大多数植物的染色

体可显示 C 带。蚕豆、黑麦、大麦等的染色体着丝粒带比较清楚,洋葱染色体的 着丝粒带较浅。 (2) 中间带(I 带) 带纹分布在着丝粒至末端之间,表现比较复杂,不

是所有染色体都具有中间带。 (3) 末端带(T 带) 带纹分布在染色体末端。洋葱和黑麦染色体具有典

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型的末端带,而蚕豆、大麦的末端带不明显。 (4) 核仁缢痕带(N 带) 带纹分布在核仁组织者中心区。蚕豆的大 M 染

色体和黑麦的第Ⅶ染色体具有这种带型。 同时具有以上四种带型的叫完全带,以“CITN”表示,其它称为不完全带, 有“CIN”和“以 CTN”型、 “TN”型和“N”型。 根据植物各染色体上显示的不同带纹和带纹的宽窄,可按染色体组型分析的 方法对同源染色体进行剪贴排列, 绘出模式图, 从而对各染色体的带型作出分析。

五、实验报告 1、将提供的植物染色体 C 带带型进行同源染色体排列剪贴; 2、绘制带型模式图并作出带型特点分析描述。

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实验二十

同功酶遗传标记分析

一、实验目的 1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 2、同工酶遗传标记的分析

二、基本原理 同工酶是一类由具有不同分子结构和大小但具有相同催化功能的酶, 其分子 的多种形式是由基因决定的,即基因表达的直接产物。由同一基因座的不同等位 基因编码的各种同工酶又称为等位酶, 它们从分子水平上反映了等位基因的相对 差异。因此,同工酶不仅是一种生理生化指标,而且也是一种可靠的遗传标记。 在同工酶分析和鉴定中,电泳法应用最为广泛,它能简便、快捷地分离某类 酶的各同工酶组分,而不破坏酶的活力。电泳的支持介质——聚丙烯酰胺又是目 前最常用的, 它是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚 合成含酰胺基侧链的脂肪族长链,相邻的两个链通过甲叉桥交链起来,链纵横交 错,形成三维网状结构。丙烯酰胺的单体和双体的聚合有两种类型,一种是化学 聚合,常采用过硫酸胺——四甲基乙二胺(TEMED)催化系统。过硫酸胺是引 发基团,供给游离氧基,TEMED 是催化加速剂。另一种是光照聚合。常采用核 黄素——TEMED 催化系统。核黄素在光下形成无色基,TEMED 放氧再氧化, 产生自由基,从而引发聚合作用。制备丙烯酰胺凝胶时其凝胶的孔径由凝胶浓度 (100 毫升凝胶溶液中含有单体和交联剂总克数)决定。当采用垂直平板不连续 聚丙烯酰胺凝胶电泳体系时,一般上层是大孔径的浓缩胶(pH 6.7) ,下层为小 孔径的分离胶(pH 8.9) ,电泳缓冲液为 Tris-甘氨酸缓冲液(pH 8.3) 。在这种 不连续系统里,存在着电荷效应,分子筛效应和浓缩效应。蛋白质(酶)按其电 荷效应和分子筛效应而被分离在凝胶的不同位置上。 用此凝胶板与酶反应底物进 行催化反应,再用生物染料染色便形成肉眼可见各种酶带。 据研究认为以萘乙酸酯为底物的同工酶属于羧基的酯酶类, 为单体或二聚体 的蛋白质。酯酶同工酶中也存在等位酶,表现出共显性的遗传特性。因此,酯酶

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同工酶可以作为孟德尔遗传的一种分子标记。 本实验所用的材料为我省种植面积较大的水稻品种特优 63,其父母本和杂 种 F1 酶带有差异。酶带的差异反映其基因型的差别。父本和母本有两条酶带上 的差别,杂种 F1 是双亲这两条酶带的互补带。 如图: 负 极 父 本 母 本 F1

正 极 水稻酯酶同工酶主要酶带

三、材料和器材 1、实验材料: 水稻(Oryza Sativa) :龙特浦 A、明恢 63,特优 63(F1) 2 四种植株群体 ,F 的幼苗。 2、实验仪器及用具: 电泳仪,电泳槽,离心机,冰箱,移液管。 3、药品和试剂: 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、过硫酸铵、核黄素、磷酸二氢 钠、磷酸氢二钠、 HCl、蔗糖、乙醇、丙酮、维生素 C、半胱氨酸、MgCl2、

硫基乙醇、TEMED、溴酚兰、坚牢蓝 RR、α -萘酯。

四、实验方法和步骤 1、溶液配制 (1)样品提取液 0.35M 蔗糖、5mM vit c、3mM 半胱氨酸、1mM 酸、50mM Tris。 (2)分离胶(A:B:C:D=1:2:1:4)pH 8.9 A、甲液(100ml) 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 36.6g
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MgCl2、5mM 硫基乙

四甲基乙二胺(TEMED) 1N HCl

0.46ml

48ml(84ml 浓 HCl 定容至 1000ml 成 1N HCl)

B、丙液(100ml) 丙烯酰胺(Acr) 甲叉双丙烯酰胺(Bis) C、蒸馏水 D、0.28%过硫酸胺(现用现配) (3)浓缩胶(a:b:c:d=1:2:1:4) a、乙液(100ml)pH 6.7 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 四甲基乙二胺(TEMED) 1N HCl b、丁液(100ml) 丙烯酰胺(Acr) 10.0g 5.98g 0.46ml 48ml 28.0g 0.753g

甲叉双丙烯酰胺(Bis)2.5g c、戊液(100ml) 核黄素 4mg

d、己液(100ml) 蔗糖 40g

(4)电泳缓冲液母液(pH8.3)1000ml Tris 甘氨酸 6.0g 28.8g

用时稀释 10 倍 (5)前沿指示剂 溴酚蓝 1%

(6)磷酸缓冲液 0.2M Na2HPO4 0.2M NaH2PO4 (7)染色液(酯酶) 磷酸缓冲液(pH6.4)90ml

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坚牢蓝 RR 1%α -萘酯 2、操作步骤

0.1g 10ml(以少许丙酮溶解后,用 80%酒精配制)

(1)清洗:玻璃板、橡胶密封圈、电泳槽 (2)装板:将高、矮玻璃板各一片,矮板嵌入橡胶圈内圈,高板装在外圈 (3)装槽:将装好的玻璃各两组装到电泳槽上,两高玻璃板相对,两矮玻璃板 朝外,旋紧螺丝,防止漏胶。 (4)封边:用滚烫的 2%琼脂沿高玻璃板的底边灌注约 0.5-1.0 厘米。 (5)配灌分离胶:按溶液 A:B:C:D=1:2:1:4 比例(胶浓度=7.2%)配制分离胶, 混合均匀,不要有气泡,沿着玻璃板壁缓缓倒入电泳槽上的玻璃板夹层里到 一定的高度。 (6)隔氧:在上述分离胶上立即滴一层蒸馏水,隔绝空气,促进聚合。 (7)分离胶化学聚合:分离胶在 28℃左右约 30~40min 可聚合,可透过玻璃看 到胶与水之间出现界面时,表明凝胶已聚合好。 (8)配灌浓缩胶:分离胶聚合后,吸去上部的水分,按溶液 a:b:c:d=1:2:1:4 比 例(胶浓度=3.1%) ,配制浓缩胶,混合均匀,灌入玻璃板夹层到顶部。 (9)制备加样口:将 1mm 厚的“样品梳子” (50 个板品)插入浓缩胶溶液中。 (10)浓缩胶光照聚合:将灌制好的凝胶板置于自然光照条件下(或 40W 日光 灯下)聚合 1 小时左右。直到界面出现乳白色,说明浓缩胶已聚合好。 (11)制备样品:取 2 厘米左右的水稻幼苗于 0.5ml 的 Eppendorff 管中,加入样 品提液 70~80ml, 用捣样器捣烂后, 离心后置冰箱备用, 每组制备龙特浦 A、 明恢 63、 1 各 5 株样品, 2 样品 85 株。 F F (制备的每个样品插于塑料泡沫内) 。 (12)加样:将浓缩胶上端的“样品梳”小心取出(若样品孔中有多余水份,用 注射针吸干) 每一样品孔,按顺序用移液枪加入 15μ l 的上述制备的样品。 , (13)稳压稳流电泳:在电泳槽的内层(正极)和外槽(负极)应加入 Tris-甘 氨酸电泳缓冲液(母液稀释 10 倍) ,负极方向的电泳缓冲液量应超过其玻 璃板(矮板) ,电泳槽的正负极与电泳仪的正负极要对应连接。插上电源, 调整电压到 220v,并使之处于稳流状态。在电泳槽的负极处滴两滴 1%溴 酚兰,作为电泳的前沿指示剂。待前沿指示剂离凝胶板底部 1 厘米时,停 止电泳,即调整电压到 0 点,关掉电源开关,取下电泳槽的电极连线。
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(14) 卸凝胶板: 倒去电泳槽中的电泳缓冲液, 旋松螺丝, 卸下两组玻璃凝胶板, 去掉橡胶密封。 (15)剥离分离板:轻轻撬开每组玻璃凝胶板的高低两片玻璃,去除凝胶板中的 上部浓缩胶和底部的封边琼脂。小心剥离分离胶于染色缸中,或将带分离 胶玻璃板浸泡于清水中,利用水的浮力剥离分离胶。然后再将凝胶小心滑 入染色缸中。 (16)染色:将 0.2M 磷酸缓冲液(pH6.4)90ml 和 1%α -萘酯 10ml 倒入染色 缸中。37℃轻轻振荡,让分离胶与底物充分接触起酶促反应,10 分钟后加 入生物染色剂坚牢蓝 RR 要过长) 。 (17)观察纪录:染色好的凝胶倒去染色液,用清水洗 3~4 遍,置于透光箱上观 察酯酶同工酶的酶带,及其变化情况。 100mg,继续振荡,直到酶带清晰为止(染色不

五、实验报告 1、绘出各种样品中酯酶同工酶谱,并说明酶谱差异; 2、分析 F2 酯酶同工酶标记的遗传分布及其规律。

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实验二十一
一、实验目的

荧光原位杂交实验

1、通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和实验技术, 2、掌握原位杂交技术的操作方法及荧光显微镜的使用方法。 3、了解其在生物学、医学领域的应用。 二、基本原理 荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是一门新兴 的分子细胞遗传学技术, 20 世纪 80 年代初期在放射性原位杂交技术的基础上 是 发展起来的一种非放射性原位杂交技术。 目前这项技术已经广泛应用于动植物基 因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤 遗传学和基因组进化研究等许多领域。FISH 的基本原理是用已知的标记单链核 酸为探针, 按照碱基互补的原则, 与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合, 形成可被检测的杂交双链核酸。 由于 DNA 分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线 性排列, 因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定 位。与传统的放射性标记原位杂交相比,荧光原位杂交具有快速、杂交特性高、 检测信号强和可以多重染色等特点,因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。 杂交所用的探针大致可以分为三类:1)染色体特异重复序列探针,例如 ? 卫星、卫星 III 类的探针,其杂交靶位常大于 1Mb,不含散在重复序列,与靶位 结合紧密,杂交信号强,易于检测;2)全染色体或染色体区域特异性探针,其 由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成, 可由克隆到 噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得;3)特异性位置探针,由一个或几个 克隆序列组成。 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。 间接标记是采用生物素 对探针进行标记,杂交之后用耦联荧光素的抗生物素的抗体进行检测,同时还可 以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋 白—荧光素的处理,将荧光信号进行放大,从而可以检测 500bp 的片段。而直接 标记法是用荧光素直接标记探针。直接标记法在检测时步骤简单,但由于不能将 信号放大,因此灵敏度不如间接标记的方法。

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三、材料和器材 1、实验材料: 簇毛麦-小麦易位系(6VS/6AL)中期染色体标本 2、实验仪器及用具: 恒温水浴锅、 培养箱、 染色缸、 载玻片、 荧光显微镜、 盖玻片、 封口膜、 200?L 移液器、20?L 移液器等。 3、药品和试剂: 簇毛麦 DNA 探针、小麦基因组 DNA、鲑鱼精 DNA(Salmon sperm DNA, 10mg/ml)、去离子甲酰胺、20×SSC、50%硫酸葡聚糖、PI(碘化丙啶)溶液、 FITC-conjugated avidin 、BSA、无水乙醇等。

四、实验方法和步骤 1、染色体制片经-70 oC 冰冻后揭去盖玻片,在 100%酒清中脱水过夜,气干。 2、配杂交液:按每张 18mm×18mm 制片 10μl 体积配制杂交液,依次向 1.5ml Ependorf 管中加入: 药品 鲑鱼精 DNA(Salmon sperm DNA, 10mg/ml) 封阻 DNA(小麦基因组 DNA,1.2μg/μl) 在旋涡上混匀,抽干后(约 30 分钟)继续加入: 簇毛麦 DNA 探针 去离子甲酰胺(Deonized Formamide) 20×SSC(3M NaCl, 0.3M 醋酸钠) 50%硫酸葡聚糖(dextran sulfate) 总体积 杂交液配好后在旋涡器上充分混匀。 3、杂交液变性:杂交液用封口膜封上,在沸水浴中变性 10 分钟,立即置冰上, 冰浴至少 5 分钟。 4、染色体变性:制片在 70%甲酰胺中(35ml 甲酰胺,5ml 20×SSC,10ml ddH2O) 78℃下处理 1’10”,取出后立即在-20℃的 70%、95%、100%乙醇中脱水各 5 分钟, 气干。 5、杂交:每张制片加 10μl 经变性处理的杂交液,盖上 18mm×18mm 盖片,放在 保持湿润的保鲜盒中,置 37 C 杂交箱中杂交 6 小时以上(通常过夜) 。
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o

用量(6 张制片) 18μl 14μl 12μl 30μl 6μl 12μl 60μl

终浓度 3μg/μl 0.3μg/μl 0.002μg 50% 2×SSC 10%

6、洗脱:取出经过杂交的制片依次在 2×SSC(室温,5 分钟) 、2×SSC(42 C, 10 分钟) 、2×SSC(室温,5 分钟)和 1×PBS(室温,5 分钟)溶液中洗脱未杂 交的探针。 7、配检测液及检测: ⑴ 使用前,按每张制片 70μl 配检测液,依次向 1.5ml Ependorf 管中加入:

o

药品 BSA(10mg/ml) ddH2O 10×PBS FITC-conjugated avidin (Enzo diagnostic, 500μg/ml) 总体积

用量(6 张制片) 180μl 186μl 42μl 12μl 420μl

⑵ 混匀后,每张制片加 70μl,盖 20mm×20mm 盖玻片,37 oC,30min 以上, 保持黑暗。 ⑶ 移去盖玻片,在黑暗下依次用 1×PBS(室温,5 分钟) 、1×PBS(室温, 5 分钟) 、1×PBS(室温,5 分钟)冲洗,然后仍在黑暗下依次经过 70%、95%、 100%乙醇脱水各 5min,气干。 ⑷ 套染、 封片: 每张制片加 12μl PI 稀释液, 盖上 22mm×22mm 盖片封片 (保 持黑暗) 。 8、观察和照相:先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野,然后打开荧光激 发光源,FITC 的激发波长为 490nm。簇毛麦杂交信号呈黄绿色,小麦染色体被 PI 染成红色。照相记录实验结果。 五、实验报告 (1)上交实验结果照片 (2)通过实验总结荧光原位杂交实验的技术关键。 (3)实验中如果出现假阳性,可能是为什么?如果没有信号,可能的原因 是什么?

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附1

FISH 相关部分溶液的配制

1、 20×SSC: 175.3g NaCl, 882.g 柠檬酸钠, 加水至 1000mL (用 10mol/L NaOH 调 pH 至 7.0)。 2、10X PBS:76g NaCl,18.8g Na2HPO4×7H20,4.1g NaH2PO4×H20,加水至 1000mL(调 pH 至 7.0) 3、PI 溶液配制:400μl Vectashield + 10μl PI 母液 附2 探针的生物素标记
TM

Mounting medium for fluorescence

探针的标记可采用随即引物扩增法、末端标记法或缺刻平移法来制备,但多 数情况下采用缺刻平移法来制备,即 DNase I 在 DNA 双链上作用产生缺口,而大 肠杆菌聚合酶 I 自缺口处进行修补合成。在修补合成互补链时将生物素标记的 d-NTP 掺入,从而复制出带有生物素标记的探针。本实验采用缺刻平移法,使用 Nick Translation Kit, Cat. 42803 (Enzo Diagnostics, Inc.)试剂盒。簇毛 麦 DNA 用生物素(biotin-11-dUTP)标记。 将一个 0 .5ml Ependorf 管置冰上,依次加入: dNTP Mix(包括 biotin-11-dUTP) 簇毛麦基因组 DNA 10×DNA PolymeraseI buffer 加 d.d.H2O 使总体积达到 43.7μl,然后再加入: DNA Polymerase (4 U/μl) DNase I (将 1×DNaseI 原液稀释 500 倍: 1μl DNaseI+10μl DNaseI buffer+489μl d.d.H2O) 总反应体积 标记好的探针可以在-20℃下长期保存。 5μl 50μl 1.3μl 5μl 1μg 5μl

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附3 荧光染料

所用不同荧光染料的激发光和发射光波长及滤光镜选择 激发波长(nm) 发散波长 (nm) 490 511 596 450 365 520 572 620 570 465 适用激发 光 IB IG IY B,VB U

异硫氰酸荧光素 异硫氰酸四甲基罗丹明 得克萨斯红 色霉素 2’[4-羟基苯]-5-[4-甲基-派 嗪]-2,5’二进制 H-苯并咪唑 碘化丙啶

530 罗丹明毒伞素 550 4,6-二氨基-2-苯基吲哚 372

615 680 456

IG,G,IG G,IG U

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附录一:X2 测验表

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