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RNA干扰技术


RNA 干扰技术
RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA (double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源 mRNA 高效特异性降解的现象。它是生物 进化过程中遗留下来的一种在转录后通过 RNA 调控基因表达的机制。最早的 RNA 干扰研 究是从植物和线虫开始,2001 年 Tuchl 等首次应用长度约为 19~23 个碱基对的双链小分子 干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA)在哺乳动物细胞中诱发基因沉默现象,证实这 些细胞也普遍存在 RNA 干扰的机制,从而在世界范围内掀起了研究和应用 RNA 干扰技术 的热潮。 RNA 干扰之所以能引起生物医学界几乎所有研究领域的广泛性趣,是因为 siRNA 具有 强大的抑制基因表达的效应和高度的序列特异性。 与抑制基因表达的传统工具, 如反义寡核 苷酸和核酶等比较, siRNA 沉默基因的效率高达数十到数千倍, 是逆基因工具的革命性改进。 此外与目标基因信使 RNA 相差一个碱基序列的 siRNA 的基因沉默效应大大受到削弱, 从而 保证了抑制目标基因的高度特异性。因此,siRNA 的发现具有划时代的意义,它不仅深入揭 示了细胞内基因沉默的机制, 而且它还是基因功能分析的有力工具, 极大地促进了人类揭示 生命奥秘密的进程。 siRNA 本身还是一种极具前景的基因靶向药物, 可广泛地用于诸如癌症 等疾病的治疗。鉴于 siRNA 技术的巨大意义与广阔应用前景,siRNA 技术连续多年被美国 《Science》杂志评选的“全球年度十大科学突破” 。 由于使用 RNAi 技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达, 所以该技术已被广泛用于 探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗等领域。

第一节 RNA 干扰的研究历程
虽然 RNA 干扰是一种古老的机制,但是第一篇报道这种现象的论文是在 1990 年发表 的。 1990 年, Napoli 和 Van der Krol 等在研究矮牵牛花查尔酮基因时发现了基因共抑制现象 (cosuppression) 。她在体外构建了控制矮牵牛花花色的基因查尔酮基因片段,连上花椰菜 花叶病毒的 35S 启动子,连入农杆菌的 T-DNA 质粒,在矮牵牛花中过度表达。她原先预期, 查尔酮的过度表达能加深牵牛花花色的紫色,但是结果却导致了矮牵牛花子代花色的褪色, 内源性的查尔酮遭到沉默。Napoli 教授把这一现象称之为内源性基因共抑制现象。 1998 年,Andrew J. Hamilton 教授研究了番茄 ACC 氧化酶基因的基因共抑制现象。他 利用放射性标记法和放线菌酮处理法分析转录后 ACC 氧化酶基因的 mRNA 和成熟 mRNA。 实验结果表明,外源重组基因片段能成功转录,但是 mRNA 成功转录后,因为某种原因发 生了转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS) 。因此,Andrew J. Hamilton 认为内源性基因共抑制现象属于转录后的基因沉默现象。 1995 年,Guo 等发现注射正义 RNA(sense RNA)和反义 RNA(antisense RNA)均能 有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫(C. elegans)par-1 基因的表达,该结果不能使用反义 RNA 技术的理论做出合理解释。直到 1998 年,Fire 和 Mello 课题组接手了此课题。他们以 秀丽新小杆线虫为模型,发现在 Guo 的课题中,引发线虫 par-1 基因沉默的是小片段的双链 RNA, 而不是正义单链 RNA 或负义单链 RNA。 他们之后又研究了秀丽新小杆线虫的 unc-22 基因,进一步阐述了双链 RNA 在基因沉默中的作用,并将这一现象命名为“RNA 干扰” 。 他们的研究成果激起了其他科学家研究 RNA 干扰现象的浓厚兴趣,由于他们的发现揭 示了分子生物学中一个全新的,具有普遍性的机制,Andrew Fire, Craig C. Mello 两位科学家 因此在 2006 年获得诺贝尔奖。 此后 dsRNA 介导的 RNAi 现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、

斑马鱼等多种真核生物中,并逐渐证实植物中的转录后基因沉默、共抑制(cosuppression) 及 RNA 介导的病毒抗性、真菌的抑制(quelling)现象均属于 RNA 干扰在不同物种的表现 形式。

RNA 干扰实验 a:植物叶片;b:秀丽新小杆线虫;c:小鼠卵母细胞;d:果蝇复眼。

1999 年,Hamilton 等首次在 PTGS 植株中发现了长度为 25nt 的 RNA 中间产物。2000 年,Zamore 和 Hammond 等使用体外培养的果蝇细胞进行研究发现,外源性 dsRNA 通过耗 能过程降解成 21-23nt 的 siRNA 引发 RNAi。同年,Wianny 和 Svoboda 等分别证实在小鼠胚 胎细胞和卵母细胞中 dsRNA 能引发 RNAi 效应。2001 年,Elbashir 等证实 21nt 的 siRNA 可 在避免激活 dsRNA 依赖的蛋白激酶(dsRNA-dependent protein kinase,PKR)和 2',5'-寡聚腺苷 酸合成酶(2',5'-oligoadenylate synthetase,2',5'-OAS)信号转导途径的同时,有效抑制人胚肾 293 细胞、Hela 细胞等哺乳动物细胞中目的基因的表达。2002 年,Brummelkamp 等首次使 用小鼠 H1 启动子构建了小发卡 RNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体 pSUPER,并 证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达,为利用 RNAi 技术 进行基因治疗研究奠定了基础。

第二节 RNA 干扰原理
病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内,并利用 宿主细胞进行转录时,常产生一些 dsRNA(图 1) 。宿主细胞对这些 dsRNA 迅即产生反应, 其胞质中的核酸内切酶 Dicer 将 dsRNA 切割成多个具有特定长度和结构的小片段 RNA(大 约 21~23 bp) 即 siRNA。 , 研究表明在生物体中 siRNA 具相似的结构特征: 为长约 21~23bp 的双链 RNA,具 5’单磷酸和 3’羟基末端,互补双链的 3’端均有一个 2~3nt 的单链突出。负 责将 dsRNA 转化为 siRNA 的 Dicer 核酸酶,属于 RNaseⅢ家族,具有两个催化结构域、一 个解旋酶(helicase)结构域和一个 PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille)结构域, Dicer 在催化过程中 以二聚体的形式出现,其催化结构域在 dsRNA 上反平行排列,形成四个活性位点,但只有 两侧的两个位点有内切核酸酶活性,这两个位点在相距约 22bp 的距离切断 dsRNA,各种生 物体内 Dicer 结构略有不同,致使 siRNA 长度存在微小差别。 siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链,继之由反义siRNA再与体 内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。 RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合, RISC 具有核酸酶的功能,在结合部位切割mRNA,导致特定基因沉默,切割位点即是与siRNA中 反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解,从而诱发宿主细胞针对这些 mRNA的降解反应。 在RISC中,起靶序列识别作用的是siRNA的反义链,Zamore等发现在RNAi过程中,首 先产生的是RISC无活性前体,分子量250kD,当加入ATP后可形成100kD的活性复合体。由

无活性前体向活性酶复合物的转换类似蛋白酶原的激活,但RISC酶复合物激活不需要共价 键断裂,而要求结合于其上的siRNA双链的解开。在ATP存在时,依赖于ATP的解旋酶解开 siRNA的双链并将其正义链与靶mRNA置换,mRNA取代正义链与反义链互补,然后由活化 的RISC在互补区的中间,距离siRNA反义链3’末端约12bp处切断靶mRNA序列。

图1 RNAi机制 siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA,而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的 dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA,经过若干次的合成-切割循环,RNAi的作用不 断放大,最终将靶mRNA完全降解。 此外许多研究还显示RNAi信号可以越过胞间屏障向其他细胞和组织扩散,在植物中, RNAi信号可以通过两种途径在细胞间传递:①短距离的相邻细胞之间的传递,植物细胞之 间有着非常丰富的连接——胞间连丝,沉默信号(如siRNA分子)可以通过胞间连丝在细胞间 传递;②沉默信号还可以通过植物里纵横交错的脉管系统进行长距离的传送。而在动物中, RNAi信号的扩散需要特殊的蛋白参与,Hunter等在线虫中鉴定出了一种与沉默信号传播相 关的蛋白,它是由SID一1基因编码的一种跨膜蛋白,能在膜上形成跨膜通道供沉默信号通 过,SID-1蛋白同源物在果蝇中不存在,但有研究表明在哺乳动物中存在SID-1蛋白同源物。 RNAi 发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是,由于 dsRNA 抑 制基因表达具有潜在高效性,任何导致正常机体 dsRNA 形成的情况都会引起不需要的相应

基因沉默。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止 dsRNA 形成的机制。 怀特黑德生物医学研究所的本杰明· 刘易斯等研究人员发现小 RNA 能通过阻断蛋白质 合成的方式调控基因表达。他们借助一个计算模型来确定小 RNA 和对应的基因,发现了 miRNA 控制很大一部分生命功能的证据。 研究人员比较了人类和狗、鸡、鼠的基因组,对这几个物种共有的蛋白质合成基因与 miRNA 寻求对应关系。结果发现,尽管这几个物种在 3.1 亿年前就开始“分家”各自进化, 但它们基因组中受 miRNA 调控的基因都占三分之一左右,而且这些基因在进化过程中都得 以保存而未发生变化。刘易斯说,随着更多的基因组数据发布以及实验技术的进步,还可能 发现更多的基因是由小 RNA 调控的。

一、线虫中的 RNA 干扰模型
Tabara 教授于 1999 年以秀丽新小杆线虫为模型(图 2) ,揭示了 RNA 干扰的原理。线 虫细胞上的跨膜蛋白 SID-1 引导细胞外的长链双链 RNA 进入细胞质, RNA 立即与细胞质内 的 RDE-4,RDE-1 蛋白形成复合体。然后 DCR-1 与 DRH-1 蛋白与该复合体结合,DCR-1 蛋白将长链 RNA 切断,得到 RDE-1 结合的 siRNA 复合物。RDE-1-si-RNA 复合物在解旋酶 的作用下解链,RDE-1 蛋白脱去,RISC 酶与正义链和反义链中的一条链结合,RISC-单链 RNA 复合物在引导下与靶 mRNA 结合。反义 RNA 与靶 mRNA 上同源的部分特异性结合, 在 RISC 的作用下,靶 mRNA 链被切断,无法与核糖体结合,翻译成蛋白质,引起基因沉 默。同时,以反义 RNA 为引物,以 mRNA 为模板,在 RdRP 的作用下,生成新的 siRNA 反义链。这就是 siRNA 的级联放大的机制。 RNA 干扰现象介导的 mRNA 降解特异性强, 同时由于放大机制的存在微量 siRNA 就能 引起明显的 RNA 干扰现象。线虫中的 RNA 干扰机制比较典型,但是在高等生物中,RNA 的机制又有细微差别。

图2

线虫中 RNAi 模型

二、高等植物细胞中的 RNA 干扰机制

植物细胞中在细胞核内产生的内源性 miRNA(微小干扰 RNA)参与了植物的基因表达 的调控。植物 miRNA 多数长 21 个碱基,具有保守性,它的产生,是由 miRNA 前体长链 dsRNA 经 Dicer 酶家族(与 DCR-1 类似,常被称为 DCL1、DCL2 等)切割产生。 以下机制为高等植物所特有: 1、干扰机制依赖于 Ago 蛋白家族,该家族有 10 个成员,它们在 siRNA 积累,DNA 甲 基化作用中起着关键作用,在整个 RNA 干扰的转录后基因沉默(PTGS)机制中起调节作 用。 2、 Dicer 酶家族在高等植物中有特异性, 4 个成员, 共 称之为 DCL1~DCL4 它们与 miRNA 的成熟有关。同时,miRNA 的成熟需要植物细胞特有的 HYL1 这种双链 RNA 结合蛋白的 参与。 3、植物中特有的 RDRs(RNA 依赖的 RNA 多聚酶) ,它的作用机制与昆虫,哺乳动物 有明显差异。

三、哺乳动物的 RNA 干扰机制
哺乳动物的 RNA 干扰机制与高等植物稍有不同,主要表现在以下几方面: 1、动物 miRNA 的长度多为 22~24 个碱基,比植物的长。 2、动物 miRNA 的前体比植物 miRNA 的前体短得多,后者的长度是前者的三倍。 3、动物 miRNA 由 Drosha(与 Dicer 酶类似) 、RNaseⅢ在细胞核、细胞质中分两步完 成,而该步骤在植物细胞的细胞核中完成。 4、动物 miRNA 在切断 mRNA 时,通常喜欢在 3’非翻译区域结合。 5、哺乳动物如人类,小鼠等具有较发达的免疫系统,外源性大片段 dsRNA 会引起干扰 素样反应,蛋白酶 R(PKR)被激活,有时还能激活寡聚腺苷合成酶(OAS)通路,使得细 胞内蛋白质翻译停止,细胞死亡,该现象不出现在植物细胞中。

第三节 RNA干扰的生物学功能及其特点
一、RNA干扰的生物学功能
多年来DNA和蛋白质一直是基因组研究中的主角,而RNA只是被看做来往于DNA和蛋 白之间的信使而已。然而越来越多的实验表明了RNA的重要作用。在小分子RNA中发现了 一类与调节基因表达密切相关的分子micro RNA(miRNA)。这种内源性的小分子RNA针对3’ 端非编码区有着极高的保守性, 并在组织中广泛表达, 可在转录后以及翻译水平上调控基因 表达。有人推测siRNA实际上不过是外源或病毒的dsRNA闯入内源RNAi通路的结果而已。 寻找这类调节分子及其靶基因已成为研究的热点。2005年White head和MIT的研究人员发现 miRNA调节着成千上万个人类基因,这些基因所占的比例超过基因组蛋白编码区域的三分 之一。这首次证明了miRNA影响着很多的生命功能。在解开miRNA如何影响生物体发育这 一未解之谜的道路上,Gaul等人证明了miRNA调节着许多发育中基本的过程,包括身体形 态、神经系统和肌肉的发育,尤其是对细胞存活意义重大。另一方面,David Bartel等人发 现在植物中存在的miRNA也控制着发育过程中的基因表达。 1、通过组蛋白甲基化影响染色质结构 Volpe等利用裂殖酵母(S.pombe),发现整合入着丝粒区的转基因表达总被抑制,他们 称此现象为“着丝粒沉默 (centromeric silencing)” 随后发现着丝粒沉默是由于此区域核小 , 体组蛋白H3的Lys-9甲基化后引起染色质凝集所致, 并证明与RNAi相关的基因突变可使组蛋 白H3甲基化消失,同时使着丝粒沉默现象消除。由此可知,至少在裂殖酵母中,RNAi机制 可通过组蛋白甲基化改变染色质结构造成着丝粒区域基因沉默。

与此同时Bartel等从裂殖酵母中分离出了一种与着丝粒区序列同源的小RNA分子,将其 命名为异染色质siRNA,并推测“着丝粒沉默”是由siRNA造成的序列同源区组蛋白甲基化所 致,即在着丝粒区域,DNA一条链连续表达,而另一条链间断表达,两条链的转录本互补 形成dsRNA, 然后通过RNAi机制形成siRNA, siRNA引导甲基转移酶到序列同源的着丝粒区, 使组蛋白甲基化,最终导致染色质结构改变,从而调节基因活性。 2005 年《Nature》的一篇综述“Gene regulation: expression and silencing coupled”中提到, RNAi 不仅可以通过促使 mRNA 分解来进行转录后调控, 而且也在另外一个基因调控的过程 —染色质的修饰中扮演了重要的角色, 这一过程主要是通过控制组蛋白甲基化等修饰来实现 的。这说明了 RNAi 的一部分作用机理:由于只有在 DNA 未折叠的情况下基因才会表现, 因此 miRNA 凭借甲基化等修饰组蛋白而影响局部 DNA 的折叠, 从调控大区域的基因表现, 在发育及分化的过程中起非常重要的作用。miRNA 所诱发的染色质修饰需要 RNA polymeraseⅡ的参与,说明了这种凭借甲基化染色质来抑制基因表达的过程,可能也是需要 先转录成 RNA,然后制造 siRNA 已进行染色质的修饰,抑制基因的表达。

2、通过DNA甲基化在转录水平调节基因表达
对RNAi相关基因突变体的研究表明RNAi机制参与细胞编码基因正常转录的调控, 生物 体内三种基因沉默机制―DNA甲基化、协同抑制和转座子沉默均与RNAi有关。 Wessenegger等1994年在植物中发现染色体DNA甲基化依赖于RNA复制,即依赖于 dsRNA的存在。随后Wessenegger与Pelissier又证实病毒在细胞内复制所形成的dsRNA可使宿 主染色体上长约3Obp的同源序列甲基化,并发现只要存在序列同源性,dsRNA 即可使基因 发生甲基化。DNA甲基化后,基因就会失去转录活性,不再起始转录,导致特定基因沉默。 而且这种甲基化状态可以传给子代,使该基因在子代中表达仍然受到抑制。 协同抑制现象指转入的基因可导致细胞内同源基因沉默,Pal Bhadra等证实在果蝇中协 同抑制是由于Polycomb复合体结合到内源基因上所致, Polycomb由siRNA引导并结合到同源 序列附近,使染色质处于非活性状态,抑制其起始转录。 另外Sijan等发现在矮牵牛(Petunia)中若转入基因产生的dsRNA与靶基因的启动子同源 则会导致转录水平基因沉默(transcriptional gene silencing,TGS),若与编码区同源则会导致 转录后基因沉默,而且还发现TGS和PTGS过程中都有小分子RNA产生,并且两个过程均伴 随靶序列的DNA甲基化,最终都可导致基因沉默。

3、在翻译水平调节机体发育
对动植物中RNAi相关基因突变体的研究表明,RNAi机制与生物发育过程相关,其作用 机理是RNAi机制的某些组分通过与PTGS彼此分离但又密切相关的过程参与对发育过程的 调控。 Ketting等发现单个Dicer基因DCR-1发生突变的线虫,除了RNAi机制缺失外,还产生了 一系列表型改变。并且DCR-1突变体表现出的发育时序的改变与let-7和lin-4突变体相似,而 let-7和lin-4编码小分子RNA,在体内首先合成70nt长的RNA前体,然后在Dicer作用下生成 22nt的小分子RNA,称为小分子瞬时RNA (small temporal RNA,stRNA),这些小RNA在线 虫的发育过程中参与对rnRNA翻译的调节,是特定基因的负调控因子,但并不介导mRNA的 降解,而是结合于mRNA3’非翻译区,阻止核糖体与mRNA有效结合,从而抑制翻译的进行。 stRNA和siRNA关系密切, 除了都由Dicer加工成熟之外, RNAi必需的Argonaute(ALG-1, ALG-2)家族基因也为两种RNA行使生物功能所必需。有人认为在RNAi过程中形成的RISC 复合物既含有siRNA 又含有stRNA,此复合物可根据不同情况产生不同效应,它可利用 siRNA与靶mRNA互补介导mRNA降解,但若siRNA与靶序列不能严格配对(如有单个碱基错 配),则PTGS即无法进行,此时复合物又可转而利用stRNA抑制核糖体在mRNA上延伸从而 在翻译水平阻断基因表达,此模型中RISC作为一个平台,不同情况下可以募集不同的组件

在其上装配,从而行使不同的功能,但最终均导致特定基因沉默,Sharp等证实在哺乳动物 培养组织中,siRNA确实可通过与mRNA3’端非翻译区结合而抑制翻译的进行。

4、作为基因组的免疫系统
所有的复杂生物的基因组在长期的进化过程中均面临着病毒等外来核酸序列的侵入, 如 人类基因组约有54%的序列含有这种入侵留下的遗迹。 那么生物怎样才能使自己的基因组免 受外来核酸分子侵袭,保持结构完整呢? 研究表明 RNAi 机制在真核细胞中起着类似动物免疫系统的作用,充当基因组的防护 者。在植物中,RNAi 导致的 PTGS 和 VIGS 是保护基因组免受病毒入侵的重要机制,在动 物中也存在类似的机制。除了可以抵御外来病毒入侵外,RNAi 还可以控制基因组自身的寄 生物—转座因子的活动,在许多生物中,RNAi 机制通过使转座因子或重复序列区域异染色 质化,大大抑制了转座子和重复序列之间的同源重组对基因组可能造成的破坏。2002 年 5 月《Science》的一片封面文章将这一范围扩大到了动物领域:加州大学费赛德分校的 Shou Wei Ding 等人是首此证明动物细胞也可以利用 RNA 沉默来抵御病毒侵染,这也是首次为证 明动物和植物王国抗病毒通路的高度保守性提供了实验依据。 之后法国科学家进一步将这一 范围扩大到了哺乳动物。 2006 年 Eugene Koonin 等人又证明原核生物里存在类似于真核生物 RNA 干扰系统的 RNA 沉默机制。 正是由于 RNAi 机制的存在, 才使生物基因组在长期的进化过程中能够保持结构的完整 性和遗传的连续性。 另外,2006 年,David Corey 还在 Nature Chemical Biology 发表文章提出 siRNA 不但可 以沉默目标基因的表达,在某种情况下还可以激活目标基因的表达。同年的《Sicence》上 发表了第一个 Dicer 酶的晶体图片,“dsRNA 结合部分和 RNAseⅢ类似结构部分是分开的, 中间间隔一个带电的平台,可以容下 25bp 的 RNA”,为解释 Dicer 到底如何加工 siRNA 提 供了一些线索。 Alexander Murashov 等人则发现外周神经也能内吞 siRNA 并在轴突中运输 siRNA, 能检 测到轴突本地蛋白表达的下降。随后又发现在外周神经损伤后的某些时间点有特定的 miRNA 产生,表明 RNAi 机制在神经细胞修复过程中可能其某些作用,RNAi 甚至可能应用 于脊柱神经损伤的治疗。 2006年冷泉港实验室Gregory Hannon等人发现了一类关闭基因表达的新小RNA分子 —Piwi-干扰RNA,大量存在于老鼠和人的睾丸中,科学家相信,与piRNAs有关的Piwi基因 在多种生物中负责调控精细胞的发育和维持。这被《Sicence》评为2006年十大进展。 综上所述,可见RNAi机制在真核生物生命活动中处于极为重要的地位,可以把它看作 是一个以小分子RNA为核心的由多种组分构成的真核基因表达调控体系。它可以在转录水 平、转录后水平和翻译水平调节基因表达,并与细胞众多生物学过程密切相关。

二、RNA干扰的特点
应用 RNA 干扰技术抑制特定的基因表达远远优于传统的基因抑制工具,根本原因在于 RNA 干扰是源自细胞内在的基因调节机制,它沉默细胞基因表达具有以下几个显著特点:

1、应用的普遍性
如前文所述,RNAi 的机制系统发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。把长的 dsRNA 或短的 siRNA 导入生物体细胞,可激发 RNA 干扰、沉默基因表达。细胞培养和动 物模型的实验都证实,siRNA 可在多种器官的细胞中,包括肝脏、血液系统、视网膜、胚胎 和造血干细胞等抑制特异性的基因表达。 此外, 几乎所有的基因都能通过 RNA 干扰被沉默, 目前用 siRNA 或 dsRNA 抑制的基因已经达到 4000 多种。针对某种特定的哺乳动物细胞基 因,可以设计出数个至数十个能抑制其表达的 siRNA 序列。

与此相反, 传统的反义基因技术在序列设计上的选择, 以及所能沉默的记忆所能沉默的 基因种类都少得多。

2、高效性
RNA 干扰抑制目标基因表达的效能非常高,这是它区别于传统反义基因技术的主要特 点。 Elbashir 等在研究中发现分别为 25 nmol/L 与 100 nmol/L 的起始 dsRNA 产生的结果是一 样的,只是高浓度起始的更有效些。将 dsRNA 浓度降低到 1.5 nmol/L 时产生的基因沉默效 果变化不大, 只有当浓度降低到 0.05 nmol/L 时, 沉默的效果才消失。 Holen 等也证实 1~100 nmol/L 的 dsRNA 浓度对基因沉默的效果是一致的。这说明 RNAi 抑制基因表达具有很高的 效率,表型可以达到缺失突变体表型的程度,而且相对很少量的 dsRNA 分子(数量远远少于 内源 mRNA 的数量)就能完全抑制相应基因的表达。 更令人惊讶的是,一次性地把 50ug 的 siRNA 注入小鼠的血液内,能高效的抑制多个器 官,包括肝脏、肾脏、肺脏、脾脏和胰腺中目标基因表达。其中肝脏内特异的基因抑制效果 最强,能达到 80%以上。

3、特异性
siRNA 是严格按照碱基配对的法则与目标 mRNA 结合,对互补序列特异性的要求相当 高。Elbashir 等和 Brummel kamp 等发现在 21~23 个碱基对中有 1~2 个碱基错配会大大降 低对靶 mRNA 的降解效果。很多实验也证实,相差 2~3 个碱基序列的 siRNA 的作用则完 全丧失。并且只降解与之序列相应的单个内源基因的 mRNA。

4、ATP 依赖性
在去除 ATP 的样品中 RNA 干扰现象降低或消失显示 RNA 干扰是一个 ATP 依赖的过程。 Zamore 等认为 RNAi 过程中至少有 2 个步骤需要能量的供给:一是长的双链 RNA 被 Dicer 所酶切产生双链 RNA;二是在双链 RNA 与 RISC 结合解链后形成有活性的 RISC。

5、位置效应
Holen 等根据人 TF(tissue factor)不同的位置各合成了 4 组 dsRNA 来检测不同位置的 dsRNA 对基因沉默效率的影响。在不同浓度和不同类型的细胞中,hTF167i 和 hTF372i 能够 抑制 85%~90%的基因活性,hTF562i 只能抑制部分基因活性,而 hTF478i 则几乎没有抑制 基因的活性。 他们还以 hTF167 为中心依次相差 3 个碱基对在其左右各合成了几组双链 RNA, 有趣的是它们所能抑制该基因活性的能力以 hTF167 为中心依次递减。特别是 hTF158i 和 hTF161i 只与 hTF167i 相距 9 个和 6 个碱基,但它们几乎没有抑制该基因活性的能力。结果 还表明 dsRNA 对 mRNA 的结合部位有碱基偏好性,相对而言,GC 含量较低的 mRNA 被沉 默效果较好。

6、竞争效应
Hoten 等将 10 nmol/L 和 30 nmol/L 的 hTF167i 相比, 两者的沉默基因效果无差异, 但将 20 nmol/L 基因抑制效果很差的 PSK314i 和 10 nmol/L 的 hTF167i 相混和后, hTF167i 产生的 抑制效果明显降低。

7、可传播性
RNA 干扰抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持信 号甚至传播至整个有机体并且可遗传。 在线虫中,dsRNA 可以从起始位置传播到远的地方,甚至于全身。Feinberg 和 Hunter 在线虫细胞膜上发现一种跨膜蛋白 SID-1, 它可以将 dsRNA 转运出细胞, 因此系统性的 RNAi 包括了 SID-1 介导的双 dsRNA 在细胞间的运输。但在果蝇上并未发现有此基因的同源物, 因此在果蝇上通过注射产生的 RNAi 不能扩散。

8、长度一定

dsRNA 不得短于 21 个碱基, 并且长链 dsRNA 也在细胞内被 Dicer 酶切割为 21 bp 左右 的 siRNA, 并由 siRNA 来介导 mRNA 切割。 而且大于 30 bp 的 dsRNA 不能在哺乳动物中诱 导特异的 RNA 干扰,而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡。

第四节 RNA干扰技术要点
一、siRNA的设计
以前人们一般应用较长的dsRNA作为基因沉默的工具,但后来发现长链dsRNA 特异性 较差。 它可激活RNaseL导致非特异性RNA降解, 还能激活依赖于dsRNA 的蛋白激酶R, PKR 可磷酸化翻译起始因子elF2a并使其失活,从而抑制翻译起始。后来人们发现小于30bp的 dsRNA 就可以有效引起基因沉默,并且不会产生非特异抑制现象,进一步研究表明抑制作 用最强的是长21bp、3’端有两个碱基突出的siRNA。 但RNAi技术要求siRNA反义链与靶基因序列之间严格的碱基配对,单个碱基错配就会 大 大降低沉默效应,而且siRNA还可以造成与其具同源性的其它基因沉默(也叫交叉沉默),所 以在siRNA的设计中序列问题是至关重要的。要求所设计的siRNA只能与靶基因具高度同源 性而尽可能少的与其他基因同源。

二、siRNA 的合成
目前获得siRNA主要有三种方法,化学合成、体外酶法合成和体内转录。

1、化学合成
siRNA可以直接进行化学合成,方便且不受碱基限制,但合成一个siRNA需先分别合成 两条单链(每条链合成需20步反应,每步反应产物均需纯化),然后再退火成双链RNA,合成 耗时长且费用很高。

2、体外酶法合成
首先合成两段29nt的DNA,包括8个与T7启动子3’端互补的碱基(称为引导序列,leader sequence)和由21个碱基构成的siRNA 编码序列。将这两段DNA分别和T7启动子混合,T7启 动子和DNA引导序列退火结合,然后用DNA 聚合酶Klenow大片断补齐成为可用于转录的 dsDNA模板, 分别用T7 RNA聚合酶进行体外转录, 再将产物混合形成dsRNA。 新的双链RNA 包含5'端单链的引导序列和中间互补的19个碱基序列以及3’端两个重复的U (UU), 以DNA酶 降解模板,同时用单链专一的核糖核酸酶(RNase)消化5’的引导序列,由于RNase不能切开U 碱基也不能降解dsRNA,所以得到的产物就是所需的21bp的双链siRNA—有19对碱基互补, 3’端各有2个U突出。

3、体内转录
近几年,有几个研究小组构建了一些可以在真核细胞内表达 siRNA 的载体,包括被广 泛应用的质粒载体和新研发的转染效率较高的病毒载体。质粒载体(以 Ambion 公司提供的 Psilencer 系列质粒为例, )都包含有一个 RNA 聚合酶Ⅲ (Pol Ⅲ)启动子和一个 4~5 个连续的 T 构成的转录终止位点以及选择标记,选用 Pol Ⅲ启动子是因为此启动子总是在距其一定距 离的位置起始转录,而遇到 4~5 个连续的 T 就终止转录,并且终止于转录终止位点第二个 碱基处,十分精确。此法需首先化学合成一段编码 siRNA 正义和反义链的模板,正义与反 义序列之间由一段环(1oop)序列隔开,插入载体 Pol Ⅲ启动子下游,然后转入细胞,环序列 可使转录出的 RNA 链折叠成具发夹结构的小 RNA 分子 , 这些小 RNA 可被细胞内的 Dicer 切割为长 21bp 的 siRNA— 有 19 对互补碱基, 端各有 2 个 U 突出, 3 可引起特定基因沉默。 与化学合成及体外酶法合成相比, 表达载体是在细胞内通过转录持续产生 siRNA, 所以可延

长 siRNA 作用时间,

三、siRNA导入细胞的方法
在体外(in vitro)可用不同的方法将siRNA导入靶细胞,一般来讲化学合成和体外酶法合 成的siRNA可用电转移(electroporation)、微注射和转染的方法引入细胞。而表达质粒则常通 过转染的方法导人靶细胞然后再表达siRNA。 向体内(in vivo)导人siRNA的研究工作也已有报 道,如有研究者用静脉注射的方法将合成的siRNA引入动物体内进行基因功能的研究。但这 些方法所产生的抑制效应都是很短暂的,一般有效期只有一周左右。Abbas等利用改造后的 病毒载体转染哺乳动物细胞, 发现在细胞内的抑制效应可持续25天左右, 进一步促进了RNAi 技术的应用。

第五节 RNA干扰的应用前景
自从2001年Tuchl等证实RNA干扰现象也存在于哺乳动物,便掀起了RNA干扰的研究热 潮。很多不同研究领域的实验室在设计课题实验方案时都加进RNA干扰的内容,既丰富了 实验手段,有增强了课题研究的说服力。同时,生产合成siRNA和开发RNA干扰药物的生物 公司应运而生,不仅有像Dharmacon和Ambion等专门设计合成siRNA的公司,像Melk等大型 生物企业也投入对RNA干扰药物的研制,还有原来专门研制核酶产品的生物公司Ribozyme, 干脆易其名为SIRNA,转营siRNA产品开发。RNA干扰的国际会议已经召开,其他大型的国 际会议,如“慢性逆转录病毒和机会感染(CROI)大会”和“美国癌症研究协会(AACR)年 会”等,都加插了RNA干扰专题会场。

一、RNA干扰在探索基因功能中的应用
人类基因组计划的完成标志着后基因组时代(reverse genetics)的来临。阐明人类基因 组中功能基因表达产物的生物学作用对医学发展有着深远意义。 其中逆基因手段应用于探索 基因功能比转基因表达的方法更有效和合理。 所谓逆基因策略, 是指通过特异性的基因敲除 (knock-out)或敲低(knock-down) ,在去除该基因或降低其表达的系统中观察所呈现出来 的表性特征的研究方法。逆基因的概念最先是从“基因敲出小鼠”模型的建立过程中提出的, 后来又在反义基因技术和核酶技术的应用中进一步丰富。 但是, 基因敲除涉及非常复杂的分 子技术,既花时间又耗费资源,而传统的反义基因技术的基因抑制效果和特异性都较差,不 能满足探索基因功能的要求。 通过RNAi特异性地抑制基因的表达来阐明基因在生物体中的功能较传统方法如基因敲 除省时方便,Phillip认为使用基因敲除技术敲除一个基因约需要6-12个月,而使用RNAi技 术一个星期可以敲除约10个基因。Fraser等与Gonez等曾采用此方法证实了线虫染色体I和染 色体III中早期胚胎细胞分裂及细胞代谢等有关的所有基因功能,并在约l9 000个基因的线虫 蠕虫中,构建了12 000种不同dsRNA文库用于研究其与复杂生命现象相关的基因的功能,如 肥胖、衰老等。RNAi技术为功能基因组的研究提供了一种新的工具,使工作进程大 大加快。 2003年,Kamath等人用与Fraser同样的方法研究了线虫16 757个基因(占线虫全基因组基 因总数的86%)的RNAi表型,共鉴定出1722个基因缺陷表型,其中2/3为首次发现。这是 第1次用RNAi技术大规模高通量研究全基因组基因的功能。Ashrafi等用Kamath等建立的 dsRNA细菌表达文库筛选与脂肪储存有关的基因,发现417个基因与脂肪储存有关,其中 有许多脂肪代谢调节基因与哺乳动物中的同源。Harborth等将体外构建的siRNA分别导人 Hela细胞、大鼠成纤维细胞和3T3细胞,分别抑制了哺乳动物的laminBl、laminB2、NUPl53、 GAS4l、ARC21、cdkl、β-actin及γ-actin等21个不同类型的基因,均获得成功。

1、植物基因功能研究
目前根据拟南芥和水稻测序结果已经得到了大量的基因序列, 研究者们也利用比较基因 组学的方法对其中一些基因的功能进行了预测。利用植物中已知基因的保守序列,通过PCR 扩增的方法也得到了大量可能具有同种功能的候选基因, 这些候选基因的进一步鉴定也可以 用RNAi技术来进行。

2、动物基因功能研究
科学家们在哺乳动物细胞中探索了siRNA在基因组水平上的筛选方法。 他们建立了一个 包含8 000多个基因的siRNA表达框文库阵列, 通过它来高通量筛选NF-kB信号途径中已知的 Unique基因,为建立神经系统的功能缺失模型找到了一些有价值的表型标记;线虫和果蝇的 全部基因组序列已测试完毕,发现大量未知功能的新基因,RNAi将大大促进对这些新基因 功能的研究。 RNAi为系统地抑制RNA分子合成蛋白提供了快速而相对简便的途径。通过在一段时间 内对一个基因RNA信号的抑制,研究者可以深入研究基因功能,进而描绘支配从细胞形态 到信号系统的遗传网络。 由于 RNAi 技术可以利用 siRNA 或 siRNA 表达载体快速、经济、简便的以序列特异方 式剔除目的基因表达,所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。同时 siRNA 表达 文库构建方法的建立, 使得利用 RNAi 技术进行高通量筛选成为可能, 对阐明信号转导通路、 发现新的药物作用靶点有重要意义。

二、RNA干扰在研究细胞转导通路中的应用
由于RNAi能高效特异地阻断基因的表达,可使其成为研究信号传导通路的良好工具。 在线虫体内,胰岛素和受体结合后可以活化Dsod(Mek的类似物),活化的Dsorl可以激活 EekA(ERK的类似物’)。以Dsorl为靶目标的dsRNA可以阻断Dsod的表达,虽然总的ErkA的表 达不受影响,但由于Dsod的表达被抑制,胰岛素刺激后ErkA不能活化。联合利用传统的缺 失突变技术和RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系, Clemensy等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径,取得了与已知胰岛素信息 传导通路完全一致的结果。 RNAi技术较传统的转染试验简单、快速、重复性好,克服了转染试验中重组蛋白特异 性聚集和转染效率不高的缺点,因此认为RNAi技术将可能成为研究细胞信号传导通路的新 途径。

三、RNA干扰在疾病治疗中的应用
RNA 干扰技术和其他生物技术一样,其应用的重点开发环节是治疗疾病。随着分子生 物学和分子病理学的发展, 对疾病机制的研究已经深入到分子水平。 很多疾病的发病机制都 与“致病基因”的表达有关,致病基因包括侵入人体细胞的病原体基因,如各种病毒的 RNA 和 DNA 分子;由于调节失控而过量表达的细胞基因,如各类癌基因等;由于突变而导致细 胞毒性产物积累的基因, 如导致神经元变性的错义 Tau 基因等; 在不适当的时机和细胞内环 境中表达的基因,如急性爆发型肝炎时肝细胞表达的 Fas 基因等等。在这些情况下,如果能 及时有效地抑制致病基因的表达,可以达到预防和治疗疾病的目的。 应用 RNAi 治疗疾病的主要原理是在特定的组织细胞中引入 RNA 干扰机制沉默目标致 病基因。由于长度超过 30 个碱基对的 RNA 双链分子在哺乳动物细胞中会导致非特异的干 扰素反应,造成所有的蛋白表达受抑制而细胞死亡。因此,用于治疗疾病的 RNAi 工具都是 建立在把短的 dsRNA 直接导入或通过载体表达于目标细胞中,特异地抑制致病基因表达的 基础上。目前能用于治疗目的的 RNAi 工具主要有三种:合成的 siRNA、能表达 siRNA 或

短茎环 RNA(shRNA)的质粒 DNA 载体和病毒载体。

1、RNA干扰在感染性疾病中的应用
致病病毒在感染人类细胞后,有的通过表达病毒相关的蛋白,破坏宿主细胞,直接引起 疾病的发生;有的则通过改变宿主细胞的抗原性,激活宿主的免疫系统,用过大量破坏被感 染细胞引起疾病;还有的病毒感染后与宿主细胞“互不侵犯”,但是病毒的基因整合到宿主基 因组内,通过激活原癌基因当导致肿瘤发生。 在制定对抗病毒感染的治疗策略时,一方面可以通过沉默病毒基因,直接消灭病原体, 另一方面可以通过沉默宿主细胞内与病毒感染周期相关的基因来控制病毒的感染。 HIV 是迄今为止发现的最易变的病原生物体之一,通过感染人类的 T 淋巴细胞和单核 巨噬细胞,导致获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的发病,其临床后果非常严重。 HIV 属于 RNA 病毒,目前还没有能彻底根治 HIV 感染的有效方法,因此早期的 RNAi 在临床应用开发研究的主要焦点集中在治疗 HIV 感染上。加州大学洛杉矶分校和加州理工 学院的研究人员研究出出使用 RNAi 技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞的方法(图 3) 。 这个研究小组设计合成的 lenti 病毒载体引入 siRNA,激发 RNAi 使其抑制了 HIV-1 的 coreceptor-CCR5 进入人体外周 T 淋巴细胞, 而不影响另一种 HIV-1 主要的 coreceptor-CCR4, 从而使以 lenti 病毒载体为媒介引导 siRNA 进入细胞内产生了免疫应答,由此使治疗 HIV-1 和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。

图 3 siRNA 干扰 HIV 生活周期示意图

应用siRNA治疗HIV感染的研究大部分都是在细胞培养中完成的,并且获得了非常好的 效果,使人们认识到RNAi是人们期待已久的抗HIV新疗法,即使RNAi不能发展成为独立的 治疗方法,它可以与HARRT疗法结合在一起使用。研究显示,RNAi还可以用于治疗HIV并 发的各种机会性感染的疾病,如根据病毒序列设计siRNA治疗巨细胞病毒视网膜炎和根据 HHV8序列设计siRNA治疗卡波式肉瘤等。

接着,人们开始研究开发抗病毒性肝炎病毒,如HCV和HBV感染的RNA干扰疗法。 丙型肝炎病毒(HCV)是世界上人类非甲型、非乙型肝炎的主要致病因素,也是死亡 和发病的主要原因。 目前, 还没有针对丙型肝炎的有效疫苗或治疗方法, 而全世界至少有1.7 亿人感染丙型肝炎。 这种病程缓慢的疾病通过污染的血液和公用注射针传播, 并且经常导致 肝硬化和肝癌(Cohen,1999) 。据统计,约50%~85%的HCV感染病人不能自身清除病毒, 其中部分会发展为肝细胞癌(HCC) 。丙型肝炎已成为全球性的公共卫生问题,严重影响了 社会和经济的发展。 SHEN等嘲针对HCV基因组设计siRNA,结果表明干扰片段可以抑制病毒特异蛋白的表 达。比阴性对照组低90%,而且这些片段还可保护未感染的Huh-7细胞抵御HCV RNA。Mc Caffrey AP等采用流体动力转染技术(Hydrodynamic transfection)将siRNA导人小鼠体内, 成功 地抑制了人类丙型肝炎病毒NS5B蛋白的表达。Kapadia对个HCV特异性的siRNA转染Huh-7 细胞进行测试,发现对于HCV复制蛋白和HCV RNA有最大抑制效果的是NS3和NS5B区的 siRNA。在siRNA转染细胞2d后,HCV RNA受到抑制,效果持续至少6d,4d后使NS3和NSSB 蛋白受到抑制。这种抑制效果与干扰素和细胞代谢无关。RandⅡ靶序列是5’核心区和NS5B 的siRNA引入复制HCV的肝癌细胞,结果发现98%的肝癌细胞不再表达HCV抗原和HCV RNA复制子。这种抑制现象具有剂量依赖性和特异性。 乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性疾病。发展中国家发病 率高,据统计,全世界无症状乙肝病毒携带者(HBsAg 携带者)超过 2.8 亿,我国约占 1.3 亿。 多数无症状,其中 1/3 出现肝损害的临床表现。乙肝,主要侵犯儿童及青壮年,少数患者可 转化为肝硬化或肝癌。因此,它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病,也是我国当前流行 最为广泛、危害性最严重的一种病。乙型病毒性肝炎无一定的流行期,一年四季均可发病, 但多属散发。近年来乙肝发病率呈明显增高趋势。 Giladi等用siRNA成功抑制了小鼠体内的HBV复制。YANG等根据HBV的s抗原编码区序 列设计了4种siRNA(siHBsAg),其中3种能有效地抑制肝癌细胞株HepG2、Hep3B和非肝癌细 胞株HeLa、293T中HBV基因的表达,提示siRNA介导的HBV基因沉寂可能成为预防和治疗 HBV感染的有效方法。唐霓等通过将构建成功的 pSIHBV/C与1.3倍HBV真核表达质粒 pHBVl.3共转染Hep G2细胞,研究发现HBV核心区siRNA表达载体pSIHBV/C能明显抑制 HBsAg和HBeAg的分泌, 提示乙型肝炎病毒核心区的siRNA具有显著和特异的抗HBV复制和 表达的作用。朱才等用siRNA的质粒载体pSilencer3.1-Hlhygrohe和脂质体Metafectene共转染 HepG22.2.15细胞,研究发现靶向HBV核心区的siRNA能抑制HBV复制,证实了唐霓等研究 结果。唐世刚等研究HBVC蛋白羧基端siRNA抑制HBV cccDNA发现重组体rAAV-siRNA、实 验组HBV cccDNA水平较空白对照组显著降低(P<0.01),HBV DNA的复制水平在实验组亦 明显下降,提示HBV羧基端siRNA能显著降低HBV cccDNA的水平和HBVDNA的复制。 RNAi 还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等,siRNA 已证实介导人类细胞的细 胞间抗病毒免疫, siRNA 对 Magi 细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。 2003 用 在 年全世界约 30 个国家和地区散发或流行的严重急性呼吸综合症(severe acute respiratory syndrome,SARS)的防治研究中,RNAi 也受到了重视。siRNA 在感染的早期阶段能有效地 抑制病毒的复制,病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的 siRNA 所阻断,这些结果 提示 RNAi 能胜任许多病毒的基因治疗,RNAi 将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于 许多严重的动物传染病的防治具有十分重大的意义。

2、RNA干扰在恶性肿瘤中的应用
人类恶性肿瘤的发生和发展过程中涉及到多种基因表达和功能异常。 这些基因同时也存 在于正常的组织细胞,与细胞的生长、分化和死亡有密切的关系。在肿瘤发生的过程中,这 些异常的基因可以表现为功能正常的基因过量表达, 也可以是基因发生突变而产生异常功能

的等位基因,基因功能序列缺失而造成基因失活等。 可见,基因的异常表达在肿瘤的发生和发展中起非常重要的作用,在某种意义上,恶性 肿瘤也可以被视为基因疾病。因此,通过基因手段来治疗恶性肿瘤将是根治癌症的希望。 随着RNA干扰产业的开发,siRNA稳定性的提高和靶向导入siRNA手段的改善,siRNA 将成为以mRNA为目标的新型基因药物,成为抗肿瘤治疗的主要手段之一。RNAi疗法不仅 可以沉默刺激肿瘤细胞增殖的癌基因,还可以沉默发生突变的等位基因。此外,建立RNA 库和高通量RNA干扰技术为筛选肿瘤分子治疗靶点提供了高效手段。 肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果, 传统技术诱发的单一癌基因的阻断不 可能完全抑制或逆转肿瘤的生长,而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源 性很高的保守序列这一特性, 设计针对这一区段序列的dsRNA分子, 只注射一种dsRNA即可 以产生多个基因同时剔除的表现, 也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同 时剔除。 目前已有很多针对不同基因的RNA干扰在体内和体外有效的抑制了肿瘤细胞的生长, 这些目的基因包括:Bcl-2 、survivin、EGFR、VEGF 等。RNA干扰代替传统反义核酸进行 转录后基因沉默,能高效地特异性抑制目的基因。与传统的方法相比,RNA干扰技术设计 更简便、作用迅速、效果明显,其技术优势还在于能根据不同病情,设计个体化治疗方案。 随着RNAi技术的不断成熟,尤其在哺乳动物细胞中应用和载体转染siRNA成功后,对 肿瘤的研究有了前所未有的突破,研究的重点主要在以下几个方面: (1) 癌基因及抑癌基因的敲除: 肿瘤是机体遗传和环境致癌因素以协同或序贯的方式, 引起遗传物质DNA损伤、突变,同时伴随有多个癌基因激活和抑癌基因失活,使正常细胞 不断增生、转化而形成的新生物。因此,如果可以抑制体内原癌基因的激活或者增强抑癌基 因的活性,那么肿瘤的发生率就会降低,甚至可以永久地避免相关肿瘤的发生。 Brummelkamp等用病毒载体将siRNA导入人的胰腺癌细胞, 可特异且稳定地抑制癌基因 K-RASV12的表达,这个癌基因的受抑使肿瘤的生长能力及恶性程度降低Yoshinouchi等向体 外培养的SiHa宫颈癌细胞内导入癌基因E6的siRNA后,发现SiHa细胞的生长受到抑制,且随 着E6癌基因的受抑,E7癌基因的量也下降;而p53蛋白的量增高,Rb蛋白的磷酸化程度也随 之降低,表明抑癌基因也受到了激发。更令人兴奋的是,导入E6基因siRNA的SiHa细胞体内 接种后,较未受抑制的对照组生长明显缓慢,甚至停止生长,这给在体基因治疗奠定了坚实 的基础。Shen等首次应用重组了siRNA的腺病毒载体,在人类乳腺癌细胞和人类肺癌细胞 A549中成功抑制了抑癌基因p53和MCF-7。人类9号和22号染色体的置换使22号染色体上的 BCR基因与9号染色体上的ABL基因融合, 产生的BCR-ABL融合蛋白诱发酪氨酸激酶强激活 而致白血病发生。Druker等在设计干扰基因的位点时选取了融合位点,使白血病细胞出现凋 亡。 对基因的某个部分用siRNA进行特异性敲除也成为研究基因功能的一个重要手段, 敲除 后, 可通过观察细胞或生物基因性状的改变来研究该段基因在生物体内的真正作用。 如神经 元泛肽C末端水解酶L1(neuronal ubiquitin C-terminal hydrolase,UCH-L1)在肺癌的某种细胞 内表达,而在正常的肺组织中却没有该物质。Liu等在研究UCH-L1的作用时选择了用RNAi 来抑制,发现抑制了UCH-L1后肿瘤细胞反而生长旺盛,表明UCH-L1可能抑制肿瘤细胞的 生长。在研究前列腺癌的过程中,Varambally等发现了一种EZH2蛋白,其在已发生转移的 前列腺癌细胞中表达的量比正常组织细胞中高得多, 因此可以作为一种肿瘤的标记物; 而进 一步用siRNA抑制该基因,可以使前列腺癌细胞的生长明显受抑,提示EZH2可以作为肿瘤 的靶点试用于前列腺癌的临床治疗。 bcl-2基因的主要作用是抑制细胞凋亡和延长细胞的存活。Lin等在人的前列腺癌细胞 LNCaP中, 用cDNA和mRNA寡核苷酸混合物D-RNAi抑制blc-2基因导致了基因静默, 并使细

胞凋亡。他们认为,前列腺癌细胞的blc-2高表达可以使肿瘤的抗凋亡能力增强,这为RNAi 可能治疗前列腺癌提供了依据。 对食管腺癌的研究发现, blc-xL基因也与细胞的抗凋亡有关, 食管腺癌细胞表达blc-xL基因的能力明显增强。体外培养的细胞转染siRNA后,blc-xL在 mRNA水平减少了60%,在蛋白质水平减少了50%。因此,细胞的抗凋亡能力也随之下降。 (2)有关肿瘤性疾病信号传导途径的研究:Crans Vargas等用siRNA抑制了环磷酸腺苷 反应元件结合蛋白(cyclic adenosine monophosphate responseelement binding protein,CREB) , 这种蛋白可能在急性白血病的信号传导过程中起作用, 抑制了该基因后, 培养的白血病细胞 生存数量明显减少。我们还可以利用siRNA抑制一些肿瘤信号传导途径中的必要因素,来达 到治疗肿瘤的目的。 ( 3 ) 肿 瘤 免 疫 逃 逸 方 面 的 研 究 : 人 体 自 身 的 细 胞 毒 T 淋 巴 细 胞 ( cytotoxic T lymphocyte,CLT ) 要 杀 伤 肿 瘤 细 胞 必 须 靠 靶 细 胞的 主 要 组 织 相 容 性 复 合体 -Ⅰ ( major histocompatibility complex,MHC-Ⅰ)类分子的识别,如果MHC-Ⅰ类分子在肿瘤的表面表达 下降,自身的CTL就无法识别,从而导致肿瘤的免疫逃逸。前髓细胞白血病(promyelocytic leukemia,PML)基因是肿瘤抑制基因,如果PML可以抑制MHC-Ⅰ类分子的表达,那么这种 白血病分子就可以逃逸体内的免疫系统,而Bruno等的研究发现,PML与MHC-Ⅰ类分子的 表达没有明显关系,用RNAi等方法抑制PML后,预计的MHC-Ⅰ类分子下调并没有出现, 提示在人的PML细胞中并未通过PML下调MHC-Ⅰ类分子来逃逸宿主免疫系统。 实体瘤组织由瘤细胞及间质构成, 而后者主要以新生血管成分为主, 在肿瘤的生长和扩 散中起重要作用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)家族是已知 特异性作用于内皮细胞的生长因子,在血管生成中作用至关重要。Zhang等 在鼠的上皮卵 巢癌细胞中,应用载体介导VEGF的siRNA,有效降低了实验鼠的VEGF提示可以利用VEGF 在肿瘤的血管生长中的重要作用来治疗肿瘤。 RNAi可以特异性抑制肿瘤内的VEGF, 而其他 药物的特异性远不能及。Bertrand等在体外培养的Hela细胞和异种移植的小鼠体内进行了 RNAi与反义核酸抑制的对比实验,结果显示,RNAi的抑制效率远高于反义核酸,而且持续 的时间延长;在小鼠体内反义核酸根本就没有作用发生,而RNAi的活性仍然很高,推测反 义核酸可能被体内的核酸降解系统破坏了。Niu等在血管生成信号传递的过程中,用RNAi 抑制Tie-2后,血管内皮细胞的生存能力下降,而且还导致了Akt信号系统受阻,结果使血小 板反应蛋白的量增加。 血小板反应蛋白是一种内源性抗血管生成物质, 可以调控肿瘤血管的 生成及肿瘤的生长,甚至可以导致内皮细胞的凋亡。 (4)提高肿瘤对化疗及放疗的敏感性:肿瘤化疗失败的主要原因是肿瘤细胞获得了耐 药性,这种耐药性常表现为肿瘤细胞对多种结构不同、作用靶位不同、作用方式不同的抗肿 瘤药物具有抵抗性,称为多药耐药(multi-drug resistance,MDR) 。研究发现,这种耐药性与 肿瘤细胞的某些耐药基因相关,主要的耐药基因是多药耐药基因1(MDR1) ,编码相对分子 质量为170 000的跨膜糖蛋白P-gp/P-170。这种糖蛋白具有药泵的作用,当其表达增高或功能 异常增强时, 能将肿瘤细胞内的药物 “泵” 出细胞外, 使细胞能在高浓度的药物环境中生存。 针对该基因的RNAi可以使MDR1基因的水平下调而进一步提高细胞内的药物浓度,提高肿 瘤 细 胞 对 化 学 治 疗 的 敏 感 性 。 Nieth 等 在 人 胃 癌 细 胞 EPG85-257RDB 和 胰 腺 癌 细 胞 EPP85-188RDP中,应用siRNA成功抑制了MDR1基因及其表达产物,抑制效率达91%,两种 细胞对柔红霉素的耐药性抵抗分别降低了58%和89%。 表明此种siRNA 也可以试用于肿瘤的 治疗,通过提高细胞对抗肿瘤药物的敏感性来达到治疗肿瘤的目的。对于p53基因缺陷的肿 瘤细胞,因其G1期的检查位点缺失,所以可以逃逸体内的免疫。Wang等找到了可以在G2期 激活检测位点的Chk1、 Weel和Myt基因, 用siRNA分别抑制这几个基因以后, 宫颈癌细胞Hela 出现了凋亡,而正常的乳腺细胞却没有出现凋亡。表明Chk1、Weel和Myt基因可以试用于放 疗及化疗,以提高对p53基因缺失的肿瘤细胞的疗效。细胞的DNA修复系统能对放射线所致

的DNA, 损伤予以修复,从而导致肿瘤细胞对放射治疗的抵抗,而双链DNA打开后的修复 错误 可以使肿 瘤细胞对放射 治疗的敏 感性提高。 DNA活化的蛋 白激酶接触 反应多 肽 (PRKDC)参与了DNA双链的修复,如果PRKDC被siRNA抑制,细胞的放射敏感性就能大 大提高,就可以通过减少放射剂量来降低放疗的副作用。 目前,RNAi的体内研究逐步深入。Hasuwaa等在转基因的小鼠及大鼠胚胎细胞中注入 带有siRNA的载体,发现胚胎中的各个器官均广泛地出现了特异性的抑制现象。Sorensen等 通过静脉注射或腹腔注射两种不同的方式分别将带有RNAi的阳离子脂质体植入成年小鼠体 内,达到了抑制内源性及外源性基因的目的,并且认为合成的RNAi可以在体内达到与普通 药物相同的功能。如果RNAi技术将来能应用于临床,将使肿瘤的治疗变得简单方便。

3、RNA干扰在遗传性疾病治疗中的应用
2002 年,美国西北大学的 Carthew R W 和日本基因研究所的 Ishizuka A 等人发现 RNAi 同脆性 X 染色体综合征(与 FMR-1 基因异常有关的导致智力低下的染色体病)之间的关系 密切,揭示了与 RNAi 相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。遗传性疾病的 RNAi 治疗成为当今研究 RNAi 的又一大热点。

四、RNA干扰在药物开发中的应用
药物研发是指寻找对抗人类疾病的确切治疗方法, 这是一个复杂的过程, 需要大量的人 力和财力投入。在后基因组时代,药物研发依照遵照过去建立起来的操作过程,即先确定新 靶点,然后对靶点小分子抑制剂进行鉴定、优化和临床评价,最后将之开发为一个成功的药 物(图4) 。一个新药从研发到投放市场的花费约为9亿美元,前后需要8年时间。RNAi技术 可以应用到药物研发的很多过程中去,同时具有改变药物研发模式的潜力。事实上,作为一 个高效的靶点搜寻和验证工具,RNAi已经广泛地应用于体外研究中,目前正被应用于体内 研究,用于机体靶点验证。除此之外,几个公司正在对可以治疗各种疾病的RNAi复合物进 行临床研究。Sima公司报道了第一个基于RNAi干扰的药物Sirna-027,它针对老年黄斑病变 (AMD),靶向血管内皮生长因子受体(VecFR)-1,减少与AMD相关的病理性血管生长。

RNAi

靶点发现 确认

前导物优化 动物实验 前导物序号 临床试验 检测 图4 在药物研发早期阶段(通常指“体外药物靶点的发现和验证”阶段) ,用一系列标

高通量

准来筛选药物靶标,然后用体外测试模型进行验证。发展起来的高通量试验已被应用于 筛选小分子靶库。研发后期,对最有效的化合物进行优化,进行动物试验检测其活性和 ADMET(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)特征,并进行临床试验评价。

RNAi技术的出现显著影响了科研人员在药物研发早期与晚期的研究方法。 RNAi技术作 为寻找新的药物靶标的工具,可以快速、大规模、高通量的对发现的药物靶基因进行功能分 析。同时。siRNA基因药物具有高度的序列特异性和非常小的毒副作用,利用这个技术可以 用于确定人类细胞中的疾病途径, 为小分子药物筛选靶物质, 以及建立的生物制药方法和诊 断学方法。再者,它还能帮助鉴定药物作用的生化模式,以及其他与此作用相关的基因, RNAi技术已被作为高通量药物靶标识别和确认的工具之一。 经临床前模型验证后,RNAi可以作为一个有效的治疗模式直接进行临床评价,绕过传 统小分子药物或生物制品需要进行的研究过程。RNAi在药物研发过程中的成功运用需要根

据不同疾病的特殊性来满足特定的标准。 RNA干扰的兴起使生物医学技术的发展进入崭新的阶段,后基因组时代进行基因功能 分析已经离不开RNA干扰的应用。目前RNA干扰用于疾病治疗的主要障碍是如何吧siRNA 特异高效地导入目标细胞,使其能沉默致病基因的表达。鉴于该领域的发展速度,相信这个 问题很快就能得以解决,不久的将来我们会看到越来越多的siRNA药物用于临床治疗疾病。

思考题:
1、什么是RNA干扰技术? 2、RNA干扰的作用机制及其特点是什么? 3、简述RNA干扰的潜在应用价值。

必读文献:
1、Akiko E,Bryan R M,Chang Y C,Efficient siRNA delivery into primary cells by a peptide transduction domain—dsRNA binding domain fusion protein,Nature Biotechnology 27. 6 (Jun 2009):567-71; 2、Hare,Pete, RNA interference in three humans,Nature Biotechnology 28. 4 (Apr 2010): 335 ; 3、Li Liande,Chang Shwu-shin,Liu Yi,RNA interference pathways in filamentous fungi, Cellular and Molecular Life Sciences 67. 22 (Nov 2010): 3849-63;

选读文献:
1、 Rossi John J, The Development of RNA Interference Therapeutics, Nucleic Acid Therapeutics 21. 6 (Dec 2011):371-2; 2、Song Y,Dong M-m,Yang H-f,Effects of RNA interference targeting four different genes on the growth and proliferation of nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells, Cancer Gene Therapy 18. 4 (Apr 2011):297-304; 3、Omarov R T,Bersimbai R I,Biochemical mechanisms of suppression of RNA interference by plant viruses,Biochemistry 75. 8 (Aug 2010): 965-70; 4、Abdolhamid Angaji S,Hedayat Sara Sadate,Poor Reihane Hosein,Madani Safoura, Application of RNA interference in treating human diseases ,Journal of Genetics 89. 4 (Dec 2010):527-37; 5、Lu Xiaozhao, Yang Guodong, Zhang Jie, Haiyan , Fu The sense strand pre-cleaved RNA duplex mediates an efficient RNA interference with less off-target and immune response effects, Applied Microbiology and Biotechnology 90. 2 (Apr 2011):583-9。


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