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半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤


半定量 RT-PCR 的实验原理和方法步骤
以下实验步骤仅供参考: 1 样品 RNA 的抽提 ①取冻存已裂解的细胞,室温放置 5 分钟使其完全溶解。 ②两相分离 每 1ml 的 TRIZOL 试剂裂解的样品中加入 0.2ml 的氯仿,盖紧管盖。 手动剧烈振荡管体 15 秒后,15 到 30℃孵育 2 到 3 分钟。4℃下 12000rpm 离心 15 分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上 层。RNA 全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的 TRIZOL 试 剂的 60%。 ③RNA 沉淀 将水相上层转移到一干净无 RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混 合以沉淀其中的 RNA, 混匀后 15 到 30℃孵育 10 分钟后,于 4℃下 12000rpm 离 心 10 分钟。 此时离心前不可见的 RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA 清洗 移去上清液,每 1mlTRIZOL 试剂裂解的样品中加入至少 1ml 的 75% 乙醇(75%乙醇用 DEPCH2O 配制) ,清洗 RNA 沉淀。混匀后,4℃下 7000rpm 离 心 5 分钟。 ⑤RNA 干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使 RNA 沉淀在室温空气中干燥 5-10 分 钟。 ⑥溶解 RNA 沉淀 溶解 RNA 时,先加入无 RNA 酶的水 40μl 用枪反复吹打几次, 使其完全溶解,获得的 RNA 溶液保存于-80℃待用。 2 RNA 质量检测 1)紫外吸收法测定 先用稀释用的 TE 溶液将分光光度计调零。 然后取少量 RNA 溶液用 TE 稀释 (1:100) 后,读取其在分光光度计 260nm 和 280nm 处的吸收值,测定 RNA 溶液 浓度和 纯度。 ① 浓度测定 A260 下读值为 1 表示 40 ?g RNA/ml。样品 RNA 浓度(?g/ml)计算公式为:A260 × 稀释倍数× 40 ?g/ml。具体计算如下: RNA 溶于 40 ?l DEPC 水中, 5ul, 取 1:100 稀释至 495?l 的 TE 中, 测得 A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l 取 5ul 用来测量以后,剩余样品 RNA 为 35 ?l,剩余 RNA 总量为: 35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g ②纯度检测 RNA 溶液的 A260/A280 的比值即为 RNA 纯度,比值范围 1.8 到 2.1。 2)变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g 琼脂糖溶于 72ml 水中,冷却至 60℃,10 ml 的 10× MOPS 电泳缓冲液和 18 ml 的 37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS 电泳缓冲液 浓度 成分 0.4M MOPS,pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入 25 ?l 溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板

放入电泳槽内,加足量的 1×MOPS 电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 ②准备 RNA 样品 取 3?gRNA,加 3 倍体积的甲醛上样染液,加 EB 于甲醛上样染液中至终浓度为 10?g/ml。加热至 70℃孵育 15 分钟使样品变性。 ③电泳 上样前凝胶须预电泳 5min,随后将样品加入上样孔。5–6V/cm 电压下 2h,电泳 至溴酚兰指示剂进胶至少 2–3cm。 ④紫外透射光下观察并拍照 28S 和 18S 核糖体 RNA 的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提 RNA 的物种类 型) ,上面一条带的密度大约是下面一条带的 2 倍。还有可能观察到一个更小稍 微扩散的带, 它由低分子量的 RNA (tRNA 和 5S 核糖体 RNA) 组成。 18S 和 28S 在 核糖体带之间可以看到一片弥散的 EB 染色物质, 可能是由 mRNA 和其它异型 RNA 组成。RNA 制备过程中如果出现 DNA 污染,将会在 28S 核糖体 RNA 带的上面出 现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA 的降解表现为核糖体 RNA 带的 弥散。用数码照相机拍下电泳结果。 3 样品 cDNA 合成 ①反应体系 序号 反应物 剂量 1 逆转录 buffer 2μl 2 上游引物 0.2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dNTP 0.1μl 5 逆转录酶 MMLV 0.5μl 6 DEPC 水 5μl 7 RNA 模版 2μl 8 总体积 10μl 轻弹管底将溶液混合,6000rpm 短暂离心。 ②混合液在加入逆转录酶 MMLV 之前先 70℃干浴 3 分钟,取出后立即冰水浴至 管内外温度一致,然后加逆转录酶 0.5μl,37℃水浴 60 分钟。 ③取出后立即 95℃干浴 3 分钟, 得到逆转录终溶液即为 cDNA 溶液, 保存于-80℃ 待用。 4 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量 PCR ①β-actin 阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为 1011, 反应前取 3μl 按 10 10 9 倍稀释(加水 27μl 并充分混匀)为 10 ,依次稀释至 10 、108、107、106、105、 104,以备用。 ②反应体系如下: 标准品反应体系 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 阳性模板上游引物 F 0.5μl 3 阳性模板下游引物 R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq 酶 1μl

6 阳性模板 DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合,6000rpm 短暂离心。 管家基因反应体系: 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 内参照上游引物 F 0.5μl 3 内参照下游引物 R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq 酶 1μl 6 待测样品 cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合,6000rpm 短暂离心。 ③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:93℃ 2 分钟,然后 93℃ 1 分钟,55℃ 2 分钟,共 40 个循环。 5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的 DNA 模板 ①针对每一需要测量的基因, 选择一确定表达该基因的 cDNA 模板进行 PCR 反应。 反应体系: 序号 反应物 剂量 1 10× PCR 缓冲液 2.5 ul 2 MgCl2 溶液 1.5 ul 3 上游引物 F 0.5 ul 4 下游引物 R 0.5 ul 5 dNTP 混合液 3 ul 6 Taq 聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至总体积为 25ul 轻弹管底将溶液混合,6000rpm 短暂离心。 35 个 PCR 循环(94℃1 分钟;55℃1 分钟;72℃1 分钟) 72?C 延伸 5 分钟。 ; ②PCR 产物与 DNA Ladder 在 2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测 PCR 产 物是否为单一特异性扩增条带。 ③将 PCR 产物进行 10 倍梯度稀释: 将 PCR 产物进行 10 倍梯度稀释: 设定 PCR 产 物浓度为 1×1010,依次稀释至 109、108、107、106、105、104 几个浓度梯度。 6 待测样品的待测基因实时定量 PCR ①所有 cDNA 样品分别配置实时定量 PCR 反应体系。 体系配置如下: 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10 ul 2 上游引物 1ul 3 下游引物 1ul 4 dNTP 1ul 5 Taq 聚合酶 2ul

6 待测样品 cDNA 5ul 7 ddH2O 30ul 8 总体积 50 ul 轻弹管底将溶液混合,6000rpm 短暂离心。 ②将配制好的 PCR 反应溶液置于 Realtime PCR 仪上进行 PCR 扩增反应。 反应条件 为:93℃2 分钟预变性,然后按 93℃ 1 分钟,55℃1 分钟,72℃1 分钟,共 40 做个循环,最后 72℃7 分钟延伸。 7 实时定量 PCR 使用引物列表 引物设计软件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互 补; 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的 位点引发 DNA 聚合反应(即错配)。 8 电泳 各样品的目的基因和管家基因分别进行 Realtime PCR 反应。PCR 产物与 DNA Ladder 在 2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView?染色,检测 PCR 产物是否为单一特异 性扩增条带。 RT-PCR 将以 RNA 为模板的 cDNA 合成同 PCR 结合在一起,提供了一种分析基因 表达的快速灵敏的方法。RT-PCR 用于对表达信息进行检测或定量。另外,这项技 术还可以用来检测基因表达差异或不必构建 cDNA 文库克隆 cDNA。RT-PCR 比其 他包括 Northern 印迹、RNase 保护分析、原位杂交及 S1 核酸酶分析在内的 RNA 分析技术,更灵敏,更易于操作。 RT-PCR 的模板可以为总 RNA 或 poly(A)+选择性 RNA。 逆转录反应可以使用逆转录 酶,以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物(GSP)起始。RT-PCR 可以一步 法或两步法的形式进行。 在两步法 RT-PCR 中, 每一步都在最佳条件下进行。 cDNA 的合成首先在逆转录缓冲液中进行, 然后取出 1/10 的反应产物进行 PCR。 在一步 法 RT-PCR 中,逆转录和 PCR 在同时为逆转录和 PCR 优化的条件下,在一只管中 顺次进行。 实验步骤: Trizol 法 RNA 提取步骤 1、提取总 RNA 2、逆转录反应 3、PCR 反应


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