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RT-PCR原理与实验操作步骤


RT-PCR 原理与实验操作步骤 关键词:RT-PCR 逆转录酶 reversetranscriptase 聚合酶 链式反应 引物设计 DNA 聚合酶 一、知识背景: 1、基因表达:DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制,如一个蚕丝心蛋白基因 104 个丝心蛋白 mRNA (每个 mRNA 存活 4d, 可以合成 105 个丝心蛋白) 共合成 109 个丝心蛋白。因此单拷贝基因的 mRNA 表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2、PCR 技术(olymerase chain reaction):即聚合酶链式反 应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促反应,其特异性由两个人工合成的引物序列决 定。反应分三步: A、变性:通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂,形成单链 DNA; B、退火:将反应混合液冷却至某一温度,使引物与模板结 合。

C、延伸:在 DNA 聚合酶和 dNTPs 及 Mg2+存在下,退火 引物沿 5' 3'方向延伸。 以上三步为一个循环,如此反复。 3、逆转录酶和 RT-PCR 逆转录酶(reverse transcriptase)是存在于 RNA 病毒体内 的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶,至少具有以下三种活性: 1、 依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性: 以 RNA 为模板合成 cDNA 第一条链; 2、Rnase 水解活性:水解 RNANA 杂合体中的 RNA; 3、 依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性: 以第一条 DNA 链为模板 合成互补的双链 cDNA. 二、RT-PCR 的准备: 1、引物的设计及其原则: 1)引物的特异性决定 PCR 反应特异性。因此引物设计是否 合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充 分考虑到可能存在的同源序列,同种蛋白的不同亚型,不同 的 mRNA 剪切方式以及可能存在的 hnRNA 对引物的特异性

的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物,或者在目的 蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 2)引物设计原则的把握:引物设计原则包括 a、引物长度:一般为 15~30bp ,引物太短会影响 PCR 的 特异性,引物太长 PCR 的最适延伸温度会超过 Taq 酶的最 适温度,也影响反应的特异性。 b、碱基分布:四种碱基最好应随机分布,避免嘌呤或嘧啶 的聚集存在,特别是连续出现 3 个以上的单一碱基。GC 含 量(Tm 值):40%~60%,PCR 扩增的复性温度一般是较 低 Tm 值减去 5~10 度。 c、 3'端要求:3'端必须与模板严格互补,不能进行任何修 饰,也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是 A 时错 配的引发效率最低,G、C 居中间,因此引物的 3'端最好选 用 A、G、C 而尽可能避免连续出现两个以上的 T。 d、引物自身二级结构:引物自身不应存在互补序列,否则 会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。 e、引物之间的二级结构:两引物之间不应有多于 4 个连续 碱基互补,3'端不应超过 2 个。

f、同源序列:引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续 8 个的互补碱基存在。 g、 5'端无严格限制: 5'末端碱基可以游离, 但最好是 G 或 C, 使 PCR 产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰(标记、 酶切位点等)等等。 根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如 Primer5.0,Oligo6.0 等对于这些条件都可以自行设置。 2、耗材:实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP 管之类事先都需经过 0.1%DEPC 水浸泡处理, 除去 RNA 酶, 防止操作过程中 RNA 降解。然后经高压灭活(灭菌和灭活 DEPC)。 3、试剂准备:变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、 75%酒精、经 DEPC 处理并高压的水。 三、RNA 的提取方法: RT-PCR 中从细胞分离的 RNA 的质量至关重要, 包括 RNA 的纯度和完整性。RNA 分离的最关键因素是尽量减少 RNA 酶的污染。但 RNA 酶活 性非常稳定,分布广泛,除细胞内 源性 RNA 酶外,环境中也存在大量 RNA 酶。因此在提取 RNA 时,应尽量创造一个无 RNA 酶的环境,包括去除外源

性 RNA 酶污染和抑制内源性 RNA 酶活性,主要是采用焦 碳酸二乙酯(DEPC)去除外源性 RNA 酶,通过 RNA 酶的 阻抑蛋白 Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异 硫氰酸胍抑制 内源性 RNA 酶。 实验操作步骤 一、实验器具与材料: 1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl 2、吸头:1ml、200μl、20μl 3、匀浆管:5ml 4、吸头台:放置 1ml 吸头的一个,放置 20μl 吸头的一个 5、EP 管:1.5ml、0.2ml、100μl 6、试剂瓶:2 个 60ml 的棕色试剂瓶(广口,带盖) 1 个 125ml 的白色试剂瓶(放无水乙醇) 7、量筒:50ml、250ml、500ml 8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml 9、试管架:5ml、1.5ml、20μl

10、盐水瓶:250ml、500ml 各 2 个备用,一个装无水乙醇, 另一个装 DEPC 水 11、铝制饭盒:4 个 12、塑料小饭盒:1 个 13、大瓷缸:2 个 14、锡泊纸:一卷 15、卷纸:2 卷 16、三角烧瓶:带盖,稍大 二、实验器具的处理与准备 1、塑料制品:(包括枪头、EP 管、匀浆管等) 先将 DEPC 水从容量瓶中倒入瓷缸中, 将塑料制品逐个浸泡 其中, 其中小枪头需要吸管打入 DEPC 水, 过夜, 然后高压, 再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP 管) 2、 玻璃制品: 泡酸过夜, 冲洗干净, 蒙锡纸烤干备用 (DEPC 水泡)(洗净后先泡 1‰DEPC 过夜,再烤干)

3、匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需 要泡 DEPC) 三、试剂配制: 1、 DEPC 水: 吸出 1ml 放在 1000ml 双蒸水中配成 1‰DEPC 水,放在 1000ml 容量瓶中静置 4 小时备用。 2、75%乙醇:用无水乙醇 DEPC 水配,然后放-20℃保存 (其中 DEPC 水需先高压) 3、异丙醇:放入棕色瓶中 4、氯仿:放入棕色瓶中 5、琼脂糖 四、几种缓冲液的配制: 1、电泳缓冲液: Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml? pH8.0 蒸溜水 1000ml

5×TBE (贮存液) 再将 5×TBE 稀释 10 倍成 0.5TBE 就可以在电泳时使用(即 工作液浓度),如取 50ml 贮存液 450ml 水--→500ml 工作 缓冲液 2、上样缓冲液: 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青 FF 30%甘油 6×缓冲液,4℃保存 五、琼脂糖凝胶的配制: 1、1.0%: 1.0g 琼脂糖 100ml 电泳缓冲液,微波炉中火 30 秒至沸腾, 熔化的琼脂物冷却至 60℃时加入 10mg/ml 溴化乙锭 2.5μl, 充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温 下放置 30-45min 后现进行电泳。 2、1.5%: 同上,将琼脂糖的量改为 1.5g

六、需购置的 RT-PCR 材料: (生工. Tel. 2236106.) Taq 酶(含 MgCl2 Buffer) 200u 70.00 dNTP: 1 支 Oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega M-MLV: 1 支 250.00 promega (Buffer) RNasin: 1 支 110 -- -20℃ DEPC 5g 110.00 Trizol 100ml/1 瓶 Invitrogen Life technologies -- 4℃ Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威 (1543. 994. 697. 515. 377. 231) 七、引物合成 正义:5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′

反义:5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′ 2、par-4: 正义:5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′ 反义:5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′ 3、退火温度计算 2(A T) 4(G C) 正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃) 4、引物各合成 5 OD,每 OD 一瓶分装好 5、引物稀释: 加 DEPC 水量为(μl) = ? nmol / OD × 管上所标 OD 数×100 是为 10p mol / μl 浓度的引物溶液 八、PCR 产物电泳 先将 1-10μl 左右 PCR 产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复 吸打混匀后进行电泳,一般电流为 10mA,电源 100V,电泳 30 分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。

九、几个注意点: 1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴? 2、Rt 时,先打开 PCR 预热 30 分钟。 3、RNA 抽提前,打开离心机预冷。 TRIzol 法抽提总 RNA 细胞 1×107 组织 100mg ↓ 加 1mlTRIzol 细胞用 1ml 加样器吹至液体澄清且无细胞团块 ↓ 匀浆(要彻底,后转至 EP 管) (组织匀浆量>100mg 时分装 1ml/每 EP 管) ↓ 颠倒混匀 10 下,室温 5 分钟

↓ 加氯仿 1/5 体积(0.2ml)(必须按总体积的 1/5) 颠倒混匀 10 下,室温 5 分钟 ↓ 4℃,离心 12000g,15 分钟 ↓ 转上层水相(约 400μl)于另一 1.5mlEP 管中 ↓ 加等体积异丙醇(约 400μl),混匀室温 10 分钟 ↓ 4℃,离心 12000g,10 分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加冰预冷的 75%乙醇(用 DEPC 水配)1ml

↓ 4℃离心 7500g,5 分钟 ↓ 弃上清,空气干燥 5-10 分钟(不能完全干燥) ↓ 溶于 DEPC 水中至 20μl(10μl-20μl) (可在 55-60℃水中,<10 分钟助溶)

注: 1、 RNA 若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中, 否则 DEPC 溶解 2、 细胞组织加 TRIzol 匀浆后, 可在-60℃放置至少一个月 (甚 至可一年以上) 3、RNA 在 75%乙醇中,2-8℃至少可保存一周,-20℃至少 可保存一年 两步法 RT-PCR

(第一步:逆转录反应) 试剂 浓度 体积 终浓度 RNA 23μl(11.5μl) Oligo(dT)15 0.05μg/μl 4μl(2μl) 0.005μg/μl (稀释 10 倍后用) ↓ 混匀,离心,70℃ 5min ↓ 立即冰水浴,稍离心 ↓ 试剂 浓度 体积 终浓度 M-MLV Buffer 5× 8μl (4μl) 1× dNTP 10mM 2μl (1μl) 0.5mM RNasin 40U/μl 1μl (0.5μl) 20μ M-MLV 200U/μl 2μl (1μl) 200U

总体积 40μl(20μl) ↓ 混匀,离心,42℃ 60min ↓ 95℃ 10min(破坏 MLV) ↓ 4℃保存 两步法 RT-PCR (第二步:PCR 反应) 总体积 20μl(50μl) 试剂 浓度 体积 终浓度 Taq Buffer 10× 2μl (5μl_) 1× MgCl2 25mM 1.2μl (3μl) 1.5mM dNTP 10mM 0.2μl (0.5μl) <200uM 上游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol

下游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol cDNA 模板 X (?) (1-10μl) DEPC 水 20μl-4.3μl-X


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