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2013年细胞分子生物学硕士实验课


分子生物学实验基础

基本实验
?

主要内容包括
?

核酸分离提取和定性定量
? ?

质粒和RNA提取 电泳 PCR技术 细胞转染 荧光素酶报告

?

基因扩增和分析
?

?

转染和报告系统
? ?

核酸制备和分析
最基本的实验技术

一、核酸分离纯化
?

核酸:
?

DNA为双链线性分子,在细胞中都以与蛋白质 结合的状态存在 原核染色体DNA、质粒、细胞器DNA为双链 环状分子 RNA:单链线性分子并具有不同的结构特点, 如真核生物mRNA分子多数在3'端带有 polyA结构。

?

?

分离核酸 应注意降解影响:
? ? ?

化学降解-酸碱环境
物理降解- DNA的双链刚性 生物降解:
?

DNA酶抑制剂
?

金属二价离子螯合剂- EDTA-Na2抑制DNA酶活性(DNA酶需要金属二价离子 Mg2+、Ca2+的激活)

?

RNA酶(RNAase)抑制剂
?

DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)(一过性抑制作用,不能使存
在于核酸中样本中) RNase阻抑蛋白(RNasin)(可在样本中长期维持)

?

核酸提取的主要步骤:
?

一般为破碎细胞,去除与核酸结合

的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子
,去除其他不需要的核酸分子,沉淀核

酸以去除盐、有机溶剂等杂质,最后得
到纯化的核酸。

典型过程 细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸

分离提取核酸的主要步骤
?

细胞的破碎
?

机械处理
?

高速组织捣碎机捣碎

?

玻璃匀浆器匀浆
液氮研磨法

?

? ?

超声波处理
化学处理法(SDS、LDS,吐温80,CTAB等)

分离提取核酸的主要步骤
?

核蛋白的解聚、变性蛋白的去除-将与核酸紧 密结合的蛋白质分开,同时避免核酸降解。常
用方法:
?

浓盐溶液(如NaCl)- 核酸-蛋白质加入NaCl后,破坏静电吸 力,使氢键破坏,核蛋白解聚(核酸依然溶解)
SDS- SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外,还具有使核酸从 蛋白质上游离出来的功能 酚/氯仿抽提- 酚/氯仿混合使用具有去除蛋白的效果,并对核酸酶 有抑制作用(酚:氯:异戊醇=25:24:1)
酸碱度的调整分离DNA和RNA

?

?

?

分离提取核酸的主要步骤
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。

应用:
①改变核酸的溶解缓冲液; ②重新调整核酸的浓度; ③去除溶液中某些盐离子与杂质 。

核酸沉淀-盐法

MgCl2 NaAc KAc

贮存液浓度(mol/L)
1 3 (pH5.2) 3 (pH5.2)

终浓度 (mol/L)
0.01 0.3 0.3

NH4Ac
NaCl LiCl

10
5 8

2.5
0.2 0.8

核酸沉淀-醇类
?乙醇 ? 对盐类沉淀少,乙醇易挥发除去 ? 需要量大,一般要求低温操作。 ?异丙醇 ? 需体积小 ? 异丙醇难以挥发除去 ? 用70%乙醇漂 ?聚乙二醇(PEG) ? 适于微量珍贵样本

二、定量定性分析
?

紫外吸收法
? ?

?

特征 变性与复性中的紫外吸收 DNA与RNA特点

?

荧光染料法
?

通常结合电泳方法

?

核酸电泳定性定量

紫外吸收法

嘌呤和嘧啶在260

nm有特异的吸收峰,这
个性质用于核酸的分 析

DNA分子的变性

DNA双螺旋的有序结构受各种理化因子,如热、酸碱、变性剂、有机 溶剂以及稀释的作用,转变为无规则的线团结构。

变性的特征

增色效应, 黏度和比旋下降,沉
降系数增加,生物学活性丧失

增色效应(hyperchromic effect) 核
酸分子加热变性时,其在260nm处的 紫外吸收急剧增加的现象。

Tm值 :当紫外吸收变化达到最大变 化的半数值时,此时所对应的温度称 为熔解温度(Tm )、变性温度或中 点解链温度。
DNA解链曲线

3.4 复性
复性:变性 DNA分开的两股链在适当条

件下重新生成双链结构的过程

退火( annealing ) : 热变性的 DNA 经缓 慢冷却复性的过程。

测定结果分析
?

?

在波长260nm紫外光下,1 OD值的吸光度相 当于双链DNA浓度为50μg/ml;单链DNA为37 μg/ml;RNA为40 ug/ml。 纯度分析
? ? ? ?

纯DNA样品 OD260/OD280应为1.8 纯RNA样品 OD260/OD280应为1.7-2.0 小于1.6时,表明样品中存在蛋白质或酚污染; OD260/OD230小于2.0时,表明溶液中有残存的 盐和小分子杂质,如核苷酸、氨基酸、酚等。

溴乙锭荧光法
原理:DNA、RNA本身并不产生荧光,但在荧光染料溴乙 锭(EB)嵌入碱基平面之间后,DNA样品在紫外光激发下 ,可发出红色荧光,荧光强度与核酸含量成正比。使 用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照,可比较 出被测DNA溶液浓度。 注意,此法的特点:解决了紫外法无法判断变性和降解 干扰数据的问题(样本保存)。尤其是结合核酸电泳 ,实际判断意义更为重要!

核酸的保存
?

DNA
? ?

DNA样品溶于pH8.0的TE,4 ℃或-20 ℃保存; 长期保存样品中可加入1滴氯仿。

?

RNA
?

RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水 中,-70 ℃保存; 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; 在RNA溶液中,加RNASIN冻贮于-70℃,可保存数年。

? ?

三、核酸电泳
?

凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。 1. 琼脂糖凝胶用于分离大于200~1000bp的片段; 操作简单、快速,且分离范围广 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5-500bp的片段; 效果好、分辨率极高,相差1bp的DNA片断就能分开, 能容纳相对大量的DNA
用于核苷酸多态性的分析,测序

影响DNA在凝胶中迁移速率的因素:
1 2 3 4 5 DNA分子的大小 构象 凝胶浓度 电压 缓冲液

? ? ? ?

?

? ?

琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。

琼脂糖浓度(%)
0.3

线型DNA分子的分离范围 (Kb)
5~60

0.6
0.7 0.9

1~20
0.8~10 0.5~7

1.2
1.5 12.0

0.9~6
0.2~3 0.1~2

仪器和试剂 仪器
– 电泳仪 – 电泳槽 – 灌胶模具等

常用电泳缓冲液
–Tris-硼酸(TBE) Tris-乙酸(TAE) Tris-磷酸(TPE)

上样缓冲液
电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色,一 般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。
作用: ①增加样品比重,以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带,预测核酸电泳的速度和位置。

③使样品呈色,使加样操作更方便。

核酸染色剂
溴化乙锭(EB)
是一种荧光染料,EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间, 在紫外线激发下,发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含 量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 琼脂糖凝胶EB染色,肉眼可见核酸电泳带,其DNA量一般 >5ng。

注意事项:
EB是致癌物质,切勿用手接触,更不要污染环境。

–DNA分子量标准

琼脂糖凝胶电泳的基本过程
?

材料:电泳缓冲液(常用TAE或TBE)、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶
液(核酸显示剂)、加样缓冲液(保证核酸不在加样孔中扩散和用于电泳 时间的指示系统)、水平凝胶电泳装置及制胶系统、直流电源系统。

?

基本过程:制胶 放入电泳槽中并加入电泳缓冲液 取出梳子 将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并 上样于加样孔中 一定电压条件下电泳 合适的时 间后停止电泳 取出凝胶进行溴化乙锭染色 凝胶 成像系统紫外灯下观察并照相保存结果

琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中 DNA Ladder的形成

PCR产物的琼脂 糖电泳

聚丙烯凝胶电泳的银染结果分析

RNA 电 泳
基本过程同DNA电泳一样,但应明确一点的是, 因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感,因此 必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所 有溶液,所有与RNA接触的仪器和装置都要严 格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解;另外, 因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳 结果,因此电泳时应在变性剂存在下进行,常 用的变性剂为甲醛和戊二醛。

PCR技术

?

?

PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作 为引物,通过加温变性-退火-DNA合成这一周期的 多次循环,使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增 产物是以指数形式积累的,经25-30个循环后,扩增 倍数可达106-9。 Dr. Karry Mullis 1985年发明,获1993年度诺贝尔化学 奖;

目的: 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。

PCR的类型
㈠巢式PCR ㈡多重PCR ㈢不对称PCR ㈣共享引物PCR ㈤锚定PCR ㈥彩色PCR - - - - ㈦原位PCR ㈧定量PCR ㈨差异显示PCR ㈩重组PCR (十一)RT-PCR (十二)RAPD - - - - -

基本概念
多重PCR:是指在一个单一反应中同时扩增多个序
列的反应过程,能够节省时间和精力(可彩色)。

定量PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR
终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板 量的定量。用于扩增已知一端序列的目的DNA

基本概念
巢式PCR:利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反
应组成,在第一轮扩增中,外引物用以产生扩增产 物,此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。

RT-PCR:测定RNA

差别显示PCR和RAPD:利用随机引物扩增并进
行样本间比较

(1)DNA模板的热变性
将待扩增DNA加热到940C左右,使双链DNA解开
成为单链,并游离于反应体系中作为模板。

(2)模板与引物的结合(退火或复性)
将体系温度降至合适温度(520C左右),使加 入的引物与模板DNA两端(3ˊ端)碱基序列互补结 合。

(3)引物延伸
将体系温度升到720C左右,Taq聚合酶催化dNTP

按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端,使链延伸,
形成两条与模板互补的新链。

以上为1次PCR循环(变性、复性和延伸) (新合成的链可作为下一轮循环的模板) 按照上述(变性、复性和延伸)3个步骤反复循 环 ,PCR产物呈指数扩增。 模板DNA 扩增倍数T=2n (n: 循环次数)。

2.

PCR各要素及其作用
PCR模板可以是DNA或RNA。 以线性DNA模板为佳,量适中,一般为102?105个拷贝; RNA作为模板时,需要: RNA cDNA PCR, 称此为RT-PCR.

(1) 模板

逆转录
(2)耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)

是从耐热细菌体内提取的一种 DNA 聚合酶,可在 95℃稳定 30
分钟。从而保证PCR在[94℃变性→ 52℃退火→72℃延伸]循环 30次过程中不变性失活。

(3)引物
引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区两
端而设计的一对寡核苷酸小片断,长度一般为

15?30个碱基。

引物是保证PCR扩增产物的大小和特异性的关 键因素,其设计与合成对PCR的成功至关重要。

引物设计原则如下:

引物设计应符合以下基本原则:
① ② 长度适宜,一般为15?30个碱基; G+C含量,一般为40%?60%;


④ ⑤ ⑥ ⑦

4种碱基应随机性分布;
引物自身不应存在互补序列; 两个引物之间不应有多于4个碱基的互补; 引物3ˊ端不应有任何修饰; 引物5ˊ可以修饰。

(4)缓冲溶液与Mg2+
PCR 技 术 常 用 10?50mmol/L Tris-HCl 、 Ph8.3?8.88 、 偏 碱 缓 冲 液 ; 并 含 有 一 定 量 的 Mg2+浓度;

(5)dNTP浓度
PCR一般用50?200μmol/L的dNTP;并且4种

dNTP浓度应相等;
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(6)参数


变性温度与时间
一般选择: 940C, 30秒



退火温度与时间
取决于引物长度、浓度 和G+C含量, 一般选择: Tm - 5℃



延伸温度与时间
一般选择: 70℃ ?75℃



循环次数
取决于模板浓度, 一般循环:30次

PCR操作
各种PCR反应的操作基本相同,只是根据引物与靶序列不同, 选择不同的反应体系和循环参数。 将PCR反应管置于DNA自动化热循环仪上,输入各种循环参数, 使DNA扩增在热循环仪上很方便地完成。 PCR技术优点

特异性强、灵敏度高、操作简便、省时,对样本质量要求不
高,能快速、特异地扩增任何DNA片断。 PCR缺点 由于高灵敏度,使易出现假阴性或假阳性结果。

49

PCR产物分析

凝胶电泳分析法
可用琼脂糖( Agrose )或聚丙烯酰胺( PAGE )凝胶电泳

检测PCR扩增产物的大小。
同时应以标准DNA分子量作平行对照,凝胶中加入溴化乙 锭,电泳后,紫外检测仪下观察结果并拍照。
(在待检靶序列拷贝数多、且仅扩增出一条带时,用此法即可满 足检测要求。)

50

PCR技术的应用
? ? ? ?

基因检测: 基因克隆化 DNA突变 DNA序列分析

实时定量PCR real-time PCR
通过特定设计的PCR仪来实时监测PCR扩 增过程每一轮循环产物的累积数量,可以 很好的推算模板的起始浓度。这种工作方 式就成为实时定量PCR。
实现了PCR从定性到定量的飞跃

两种定量化学 探针标记

–TaqManTM 特定的聚合酶 ?染料染色
–SYBR? Green I

TaqMan探针
? 一条探针,两条引物
引物位于探针的两边

? 一条探针,两个基团
前边是报告基团,后边是淬灭基团
R
5' 3' 5'

Q
3'
5' 3' 5'

5'

? 3'

forward primer
5' 3' 5'

R

probe

Q
3' 5' 3' 5'

1. Polymerisation

reverse primer

Q
5' 3' 5' 3' 5' 3' 5'

2. Strand displacement
R Q
5' 3' 5' 3'

5'
3' 5' 5' 3' 5' 3'

R

Q

3. Cleavage

5' 3' 5'

4. Polymerisation completed R = Reporter Q = Quencher

数量关系
上游引物 TaqMan 探针

3’ 5’

R

Q

5’ 3’
下游引物

R

3’ 5’

Q

5’ 3’

1. 每产生一条DNA链,就切断一条探针

2. 每切断一条探针,就产生一个单位信号
3. 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比

探针法的优点 SYBR Green I
?

是一种DNA小沟结合染料

与DNA结合时发光

游离时不发光

SYBR Green I
?

在PCR过程中染料与DNA结合发光

聚合开始

聚合完成

数量关系
1. 每形成一个DNA双链,就有一定数量的染料结合上去

2. 染料一结合,就产生荧光信号
3. 信号强度与DNA分子总数目成正比

分子生物学技术
基因重组

DNA克隆 也称基因克隆或基因工程是指在体外对 DNA

分子按照既定的目的和方案,对DNA进行剪切和
重新连接,然后把它导入宿主细胞,从而能够扩

增有关DNA片段,表达有关基因产物,进行DNA
序列分析,基因治疗,研究基因表达的调节因子

(如启动子、增强子等),以及研究基因的功能
等。

二、重组DNA技术基本原理及操作步骤

基本原理 目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 DNA导入受体菌

外源基因与载体的连接 重组体的筛选

克隆基因的表达

重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶 功 能

限制性核酸内切酶
DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ

识别特异序列,切割DNA
催化DNA中相邻的5?磷酸基和3?羟基末端之间形成磷酸 二酯键,使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 合成双链cDNA分子或片段连接 ② 缺口平移制作高比活探针 ③ DNA序列分析 ④ 填补3?末端


Klenow片段

又名DNA聚合酶I大片段,具有完整DNA聚合酶I的5??3? 聚合、3??5?外切活性,而无5??3?外切活性。常用于 cDNA第二链合成,双链DNA 3?末端标记等 合成cDNA ② 替代DNA聚合酶I进行填补,标记或DNA序列分析


反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶

催化多聚核苷酸5?羟基末端磷酸化,或标记探针 在3?羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基

载体
功能 克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断 表达载体: 用于一个基因的蛋白表达 整合载体: 把一个基因插入到染色体组中

载体
来源:
质粒载体

噬菌体载体
柯斯质粒载体 真核细胞克隆载体

载体的种类和特征
受体细胞 质粒* 结构 环状 线状 环状 插入片断 〈 8* 9 - 24kb 〈 10 kb 举例 pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列, Λ gt系列 M13mp系列 pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV Pel oBAC系列 PCYPAC1

E.coli E.coli E.coli

λ 噬菌体 丝状噬菌体及噬菌粒

粘粒载体
BAC (Bacterial Artificial Chromosome) PAC (P1-derived Artificial chromosome) YAC (Yeast Artificial chromosome ) MAC (Mammalian Artificial Chromosome)

E.coli
E.coli E.coli
酵母细胞 哺乳类细胞

环状

35- 45kb
≈300 kb

环状 环状 线性染色体

100 - 2000 kb 100 - 2000 kb 〉 1000 kb

线性染色体

病毒载体
穿梭载体

动物细胞
动物细胞 和细菌

环状
环状

SV40 载体,昆虫 杆状病毒载体 pSVK3质粒,PBV, Ti质粒

一、质粒的生物学特性:
1、质粒DNA的构型:
SC型 共价闭合环形DNA(cccDNA) OC型 开环DNA(ocDNA) L 型 线性DNA(cDNA)

2、不同质粒的分子量大小差异相当显著:

106~108D
3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分:
复制基因(replicator)、选择性记号、克隆位


L

OC

SC

6、质粒DNA的复制类型:
低拷贝的质粒(1~3):严紧型复制控制的质粒 (接合型) 高拷贝的质粒(10~60):松弛型复制控制的质粒 (非接合型)

7、质粒的不亲合性
在同一个大肠杆菌细胞,一般不能同时含有两种 不同的。也称为质粒的不相容性。 是指在没有选择压力的情况下,两种亲源关系密 切的不同质粒,不能够在同一个寄主细胞系中稳定 地共存的现象。 质粒的不亲合性分子基础,主要是由于它们在 复制功能之间的相互干扰造成的。

质粒的拷贝数
质粒拷贝数一般与其分子量成反比关系: 质粒拷贝数=质粒DNA量/染色体DNA量×MWc/MWp

质粒的不相容性(incompatibility)
在没有选择压力的条件下,两种不同质粒不能 共存于同一宿主细胞内的现象。 不相容质粒携带复制子基本相似,复制系统也 ? 相同,在复制和分配到子细胞的过程中相互竞争。

克隆载体(cloning vector)

为使插入的外源 DNA序列被扩增而特意
设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源 DNA 序列可转录 、 进而 翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载 体。

2、质粒的拷贝数及分子的大小 插入分子量大的外源DNA会引起质粒 拷贝数的下降。

(4)表达型的质粒载体
表达载体: 按特殊设计构建的, 能使克隆在其中特定位点的外源 真核基因的编码序列,在大肠杆 菌细胞中正常转录并转译成相应 蛋白质的克隆载体。

主要包括:大肠杆菌的启动子、及操 纵位点序列、多克隆位点、转录及转 译信号、质粒载体的复制起点及抗菌 素抗性基因。 待表达的真核基因编码序列被克隆 在紧挨于启动子下游的多克隆位点上, 而且必须是其编码的蛋白质氨基酸末 端这一头靠近启动子方向插入,才能 在启动子控制下进行有效的转录。

目的基因
5? 3? 5? 限制酶或机械剪切 3? 5? λ-核酸外切酶 3? 5? 5? 3? 5?

载体DNA
限制酶 3? 5? λ-核酸外切酶 5?

3?

3? 5? 3? A(A)nA

末端转移酶 + dATP A(A)nA 3? 3? T(T)nT 5?

3?

末端转移酶 + dTTP T(T)nT 3? 5?

T4 DNA连接酶 15? C

重组体

(四)重组DNA导入受体菌
受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection)

感染 (infection)

转化(transformation) 转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于 感受态的宿主细胞,并使其获得新的表型的过程。 转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。大肠杆菌悬浮 在CaCl2溶液中,并置于低温(0~5℃)环境下

一段时间,钙离子使细胞膜的结构发生变化,通
透性增加,从而具有摄取外源DNA的能力,这 种细胞称为感受态细胞(competent cell)。

质粒载体筛选方法

插入失活 α-互补:IPTG,X-GAL 直接筛选:抗生素 表达筛选(抗体筛选) Probe筛选

质粒载体缺点

CaCl2转化效率低
克隆片段小于10kb 大量筛选时需要细胞裂解

4. DNA重组体的鉴定
外源 DNA片断是否插入载体构成重组 DNA分子,而插入片断大小,是 否突变及插入位置,顺序及方向则关系到构建载体是否扩增,我们所需要的 基因或表达,表达相应的产品,所以需要进一步鉴定DNA重组体 (1) 酶切鉴定是必需的,基于下述: A. 限制性图谱个体特异性,不同的载体或DNA分子物理图谱不同,酶切 后片段大小不一样,电泳图谱不一样。 B. 同一载体连接不同的 DNA片断,不同的载体连接同一片段(片段上也 有位点)酶切图谱是不同的 。 C. 插入法(单酶单切点)或替代法(双酶双位点)酶切,一般来说用3种限 制酶切: ①可鉴定载体及 ②插入片段的大小 , 方向, 切后并电泳分析 , 以确定是否 得到预期的rDNA。

( 2 )若构建 DNA 重组体是为了克隆某个基因,可进行 在序列测定。

(3)若构建表达载体,可进行表达产物鉴定。

蓝-白筛选(α互补)
许多载体(如M13系列、pUC系列、pGEM系

列)都含有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列
和氨基端145个氨基酸的编码信息。这个编码区中插 入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码β-半 乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体 编码的片段各自均无酶活性,但它们可以互补形成

具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为α互补。

α 互 补 的 检 测

α-互补蓝白筛选

原 位 杂 交

实验十二 DNA的连接与转化

1.DNA分子的体外连接 2.DNA的转化及转化子的筛选

一.实验目的及背景
?

?

当我们已经获得目的基因片段,选择好 适当的克隆(或表达,转化)质粒载体 , 并确定重组方案后,下面要进行的就 是DNA片段之间的体外连接,从而获 得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对 目的基因的扩增以及目的基因表达(如 现代基因工程药物的生产),还可用于 序列分析和转基因等重要生物技术的研

1、DNA分子的体外连接
?

DNA分子的体外连接就是在一定条件 下, 由DNA连接酶催化两个双链DN A片段组邻的5’端磷酸与3’端羟基 之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程, DNA分子的连接是在酶切反应获得同 种酶互补序列基础上进行的。

连接反应中值得注意的几个问题 :
1.DNA连接酶 ? 常用的DNA连接酶有两种: (1)来自大肠杆菌的DNA连接酶 (2)来自噬菌体的T4DNA连接酶。 ? 二者的作用机理类似。
?

T4DNA连接酶作用机制
? ?

?

?

T4连接酶作用分三步: 1.T4DNA连接酶与辅助因子AT P形成酶-AMP复合物。 2. 酶-AMP复合物结合到具有5’ -磷酸基和3’-羟基切口的DNA上 ,使DNA腺苷化。 3.产生一个新的磷酸二酯键,把缺口 封起来.

2.连接反应的温度
?

?

DNA连接酶的最适反应温度为37℃ , 但在此温度下, 粘性末端的氢键结合很 不稳定,折衷方法是12℃过夜。

3. DNA的平未端和粘性末端
?

?

由于内切酶产生的DNA末端有平未端和 粘性末端,因而连接反应中就有平未端 连接和粘性末端连接。 二者连接效率不 同。 粘性末端效率高,因而在底物浓度,酶 浓度选择上是有差异的,

4.碱性磷酸酶处理质粒载体
?

为了提高连接效率,一般采取提高DN A的浓度,增加重组子比例。这样就会 出现DNA自生连接问题, 为此通常选 择对质粒载体用碱性磷酸酶处理,除去 其5’末端的磷酸基,防止环化, 通过 接反应后形成的缺口可在转化细胞后得 以修复。见下图。

5.连接反应的检测
?

?

连接反应成功与否,最后的检测要通过 下一步实验,转化宿主菌, 阳性克隆的 筛选来确定。 我们下面的实验从粘性末端为例操作。

2.DNA的转化及转化子的筛选
? ?

一.实验目的及背景 体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的 重组质粒,选用转化和筛选技术, 可获得含重 组的阳性克隆。在此阳性克隆中,DNA可在 生物体系中大量扩增,繁殖, 保存以及表达目 的基因的产物,这是PCR体外扩增DNA所 不能替代的。配合DNA重组技术,所获得的 ,不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研 ,医药生产和生物发酵等领域。

1.抗生素筛选法

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?

菌株为某种抗生缺陷型, 而质粒上 带有该抗性基因(如氨苄青霉素, 卡 拉霉素等)这样只有转化子才能在含该 抗生素的培养基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。

2互补法
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现在使用的许多载体(如PUC系列)有含有一个大 肠杆菌DNA的短区段,其中含有β-半乳糖苷酸基因 (lacZ)的调控序列和头146个氨基酸偏码区。这 个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌则含编码β-半乳糖苷酶C端aa的序列。当 外源基因插入时,二者溶为一体后,有β-半乳糖苷酶 表达, 在生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β- D-半乳糖苷(x-gal)培养基中形成兰色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点,从而造成插入失 活,而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色 不同而区分重组子和非重组子。

脂质体转染实验与荧光素酶活 性检测

目的
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了解转染过程。 学习荧光素酶报告基因的原理、检测方 法。

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报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质 的基因,通过它的表达产物来标定目的基 因的表达调控。该技术的主要优点是高灵 敏度、可信性及检测方便且适合大规模检 测。

什么是报告基因?
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所谓的报告基因(reporter gene),是一 种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,也 就是说,是一个其表达产物非常容易被鉴 定的基因。该基因的表达与插入基因的表 达有关。 该技术的主要优点是高灵敏度、可信性及 检测方便且适合大规模检测。

理想的报告基因
内源性低
Reporter

细胞内其它的基因产物 不会干扰报告基因的检测

报告基因编码产物的检测应该 快速、简便、灵敏度高并且重复性好

荧光素酶报告基因载体
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常用的萤光素酶报告基因载体: 萤火虫萤光素酶报告基因载体 海肾萤光素酶报告基因载体 pGL2 , pGL3 , pGL4 萤火虫荧光素酶报告基因:萤火虫luc以其高度的 灵敏性和很宽的线性范围而成为哺乳动物细胞中 使用最多的报告基因。 本次所用载体: promega公司的pGL3-promoter 所用质粒: pGL3-promoter-ERE(雌激素应答元件)

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与配体结合的ER发生构型改变,被激活形成二聚体,激活的ER二聚体与雌激 素应答元件(estrogen response element, ERE)结合, ER- ERE复合物促使转录 起始复合物形成并诱导转录。

荧光素酶报告基因简单实验流程:
1、构建载体把调控序列连入到含有萤火虫

萤光素酶(luc)或海肾萤光素酶(Rluc) 的载体中 报告基因载体 2、转染
3、提供刺激 4、检测荧光

报告基因检测试剂

转染原理
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脂质体也称人工细胞膜,是由脂质双分子层组成的。 在水中可以自动生成闭合的双层膜,最初 ,人们只是运 用脂质体模拟生物膜 ,研究膜的构造及功能 ,从而发现 了膜的融合及内吞作用 ,因而可用作外源物质进入细胞 的载体。
现商品化的脂质体通常都是阳离子脂类和中性脂类的 复合体。其中以阳离子脂类起主要作用,阳离子脂质 体既能与DNA可以通过静电作用形成脂-DNA复合物 ,也能被表面带负电荷的细胞膜吸附。从而引导DNA 进入细胞。中性脂类可促胞内释放DNA。

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(一)转染步骤:

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培养好的细胞接种细胞孔板,37℃的CO2培养箱培养,待 细胞密度为50~80%,约24h后取出细胞孔板,每孔加入 0.5ml培养基,待用。 1.待转染质粒ERE(雌激素应答元件质粒)、ER(雌激素受体 质粒)与脂质体混合物制备(下列数据均为每孔加入量) : a. 取1.5ml离心管,加入无血清OPTI-MEM培养基中 100μL ,然后加入ER和ERE质粒各0.2μg。 b.向a中离心管里加入0.4μLPLUS试剂混匀,室温放置 3min; c.向b中离心管里加入LTX转染试剂2μL,室温放置30min( 该混合液在30min~6h内稳定)。 2.到时间后,将100μL混合物加入细胞中轻轻混匀,37℃的 CO2培养箱培养。

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(二)加刺激

6小时后加入植物雌激素刺激,实验设2 组:实验一组即空白组(加DMSO5μL) 、实验二组(每孔加1mM 植物雌激素 5μL)
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(三)单光子测定

萤光素酶报告基因技术检测原 理
Luciferase

Luciferin + ATP

Light

02

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1.转染24h后,细胞用PBS洗涤2~3次 2.取出荧光素酶分析试剂盒的所有试剂置于冰上避光溶解 。 3.在24孔培养板的每个孔里加入100μl 1×溶解缓冲液 (Reporter Lysis 1×Buffer)/ 孔混匀,将培养板放入-70oC 冰箱冷冻约10分钟,取出放入37oC融解。反复冻融循环数 次直至细胞全部裂解。 4.将培养板中的细胞裂解液收集至新的1.5 ml Eppendorf 管中,10000rpm离心1分钟。 5.将单光子仪(Bioscan Lumi-scint)参数设置为:测量时 间为10秒,延迟时间为2秒。 6.将25μl的荧光素酶分析试剂(Luciferase Assay Reagent) 加入测量管(Luminometer)中。取5μI的细胞裂解液加入测 量管中,轻轻吹打2~3次混匀。 7.将测量管置于单光子仪中,测量读数。

荧光素酶活性检测


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