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融合PCR


融合PCR

(一)融合PCR的定义
(The definition of fusion PCR)

融合PCR技术( fusion PCR)采用具有互补末端的引物, 形 成具有重叠链的PCR产物, 通过PCR产物重叠链的延伸, 从 而将不同来源的任意DNA 片段连接起来, 此技术在不需要 内切酶消化和连接酶处理的条件下实现DNA片段的体外 连接, 为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。

(二)融合PCR的原理
(The experiment principles )

P2、P4为具有末端互补的引物 P1、P4为两端引物

①引物设计 ②对连接片段进行扩增并回收
③将连接片段混合进行PCR扩增 ④验证

图(a)1:Marker、2~4:未融合片段、5:融合后片段 图(b)1:Marker、2~5:未融合片段、6:融合后片段

(三)融合PCR的其他应用
(The other application of fusion PCR) 目标片段的缺失

在片段的左右两端设计末端互补的引物

进行融合

基因片段的缺失

总结

融合PCR是一种高效体外连接目的片段和定点缺失目的基因的有效方法之一。

参考文献:

[1]李敏,杨谦.一种高效构建同源重组DNA片段的方法融合PCR[J]中国生 物工程杂志. 2007, 27( 8): 53~ 58.

引物设计原则 1、长度:15—30BP,其有效长度[LN=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38,否则PCR的最适延伸温度 会超过TAQ酶的最佳作用温度(74度),从而降低产物的特异性。 2、G十C含量:应在40%一60%之间,PCR扩增中的复性温度一般是较低TM值引物的TM值减去5— 10度。引物长度小于20时,其TM恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。 3、碱基分布的随机性:应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连 续G或C,否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。 4、引物自身:不能含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构。 5、引物之间:两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体,尤应避免3’ 端的互补重叠。 6、上下游引物的互补性:一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。 7、3’末端:如果可能的话,每个引物的3‘末端碱基应为G或C。 8、引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。


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