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小分子干扰RNA


小分子干扰 RNA
摘要 : RNA 干扰是指转录后的基因沉默现象 ,可使基因沉默的小分子干扰 RNA ( siRNA)治 疗提供了又一个选择。本文对 siRNA 的化学修饰,siRNA 在基因治疗和肿瘤治疗中的研究 做了介绍。 关键词:RNA 干扰,siRNA,化学修饰,基因治疗,肿瘤治疗。 RNA 干扰 (RNAi) 是 Fire 等[1 ]于 1998 年首次发现并命名的 ,指双链 RNA (dsRNA) 在细胞内特异性诱导与之同源的 mRNA 降解或翻译抑制 ,使相应基因表达关闭 ,从而引发 基因在转录后水平沉默。目前已知 RNAi 是一种古老的可以调节异染色质形成、蛋白合成 与 RNA 降解的序列特异性基因调控机制[2 ]。 小分子干扰 RNA ( siRNA) 是发挥 RNAi 基因沉默作用的功能分子 , 是 dsRNA 被 Dicer 酶加工识别后形成的具有 21 ~25 个核苷酸长度的短双链 RNA,这些短 dsRNA 具有 明显的 RNase 加工特征 :具有 5′磷酸端和 2 个核苷酸突出的 3′端。形成的 siRNA 与解 旋酶、 ATP 及多个蛋白组成 RNA 诱导沉默复合体 (RNA2induced silencing complex, R ISC) 。 R ISC 特异性地与细胞内同源 mRNA 结合后 ,随即被内切酶切割 ,于是 mRNA 片段 由于缺少聚腺苷酸尾或稳定的帽子结构而很快被降解 ,最终导致基因沉默[3~5]。从发现至 今 ,在短短几年中 ,对 RNAi 的研究取得了突飞猛进的发展 ,目前已经成为基因功能研究和 基因治疗研究的热点 ,特别是广泛应用于多种肿瘤及病毒感染性疾病诊断和治疗的临床前 研究。 【1】毕煌垒 , 何军林 , 刘克良 小分子干扰 RNA 分子化学修饰研究进展 国际 药学研究杂志 2008 年 12 月 第 35 卷 第 6 期 siRNA 的作用机制 目前,主要有 3 种核酸分子用于诱导基因沉默,它们分别是反义寡核苷酸、核酶以及 siRNA,它们的作用机制不同。反义寡核苷酸是短的单链 DNA 分子_4J,一般包含约 20 个 核苷,通过与 pre.RNA 或 mRNA 杂交来形成核糖核酸酶 H(Rnase H)的底物,通过 Rnase H 的作用特异性地使同寡核苷酸结合的 RNA 链降解,从而抑制对应基因的表达 15j。核酶是 能够特异性切割 mRNA 的 RNA 分子_4J,与 pre.RNA 或 mRNA 作用后,会催化目标 RNA 分子的磷酸二酯键骨架发生水解作用,从而使对应基因沉默不表达 15J。在自然中发现的 siRNA 分子是长双链 RNA 分子在胞质中 Dicer 酶(Rnase.Ⅲ的一种)的作用下生成的。Dicer 酶将长双链 RNA 分子切割成 21。28 bp 的 siRNA 双螺旋分子,参与 RNA 干扰作用的分子 会特异性识别 siRNA 双螺旋结构, 并将双螺旋中的一条单链整合进被称为 RNA 诱导沉默复 合体(RNA.inducedsilencing complex,RISC)的蛋白复合物中,RISC 可以切割同 siRNA 具 有完全互补序列的 mRNA 分子或阻断目标 mRNA 的翻译过程, 从而抑制对应基因在细胞内 的表达。 【2】温爱萍,徐小,薇“,李大魁 小分子干扰 RNA 用于基因治疗的研究进展 中 国药学杂志 2006 年 12 月第 41 卷第 23 期 siRNA 的化学修饰的研究 裸 siRNA (未修饰 siRNA)半衰期短、稳定性差、易被核酸酶降解;所带负电荷以及较强 的亲水性 ,使之不易与带同样电荷的靶细胞接触 ,更不易透过由脂质双分子层构成的细胞膜 进入细胞内与 mRNA 发生作用。 因此出现了各种改善 siRNA 的转运和稳定性的策略 ,其中 载体转运和化学修饰是目前用于改善 siRNA 药学性质的主要研究方法 ,为克服 siRNA 的这 些缺点提供了可能性 ,下面分别简要介绍这两种方法的研究进展。 【1】 1 针对 siRNA 转运的载体修饰 为了克服 siRNA 在细胞内存在时间短的问题 ,最初通过构建 siRNA 表达载体来持续

产生沉默作用。常用的表达载体有质粒、腺病毒、逆转录病毒等传统载体。但这种转运方式 不能透过血脑屏障。 虽然已经证明它是 siRNA 转运至细胞的有效途径 ,但仍存在诸多弊端。 而非病毒载体介导的 siRNA 在转导到病变组织的过程中不会引起免疫反应 , 而且 ,脂质体 的定向传递作用提高了 siRNA 药物在靶器官或组织中的浓度 ,进而增加药效 ,同时 ,另外 一些器官或组织中的药物浓度很低 ,从而降低了药物的毒性。这在靶向应用药物的有效性上 有很大的优势。 目前主要采用脂质体转运的方式。 常用修饰 siRNA 的脂质体主要有胆固醇、 聚乙二醇 (PEG)、石胆酸及月桂酸等。 2 化学修饰 siRNA 化学修饰也是用来改善核酸的酶稳定性的主要手段之一 ,其在反义核酸的修饰中得到 了深入的研究。 对于 siRNA 的化学修饰 ,可能起到提高抗核酸酶降解和延长半衰期的作用 , 但因为 siRNA 的沉默效应涉及到多种酶的参与 ,首先需要评价这些化学修饰对 siRNA 的 基因沉默效应的影响。 另外 ,化学修饰对于改善药代动力学性质和降低细胞毒性等方面的作 用也有待评估。化学修饰 siRNA 的一些最新研究进展如 siRNA 链端修饰,核糖和碱基的修 饰,对磷酸二酯键的修饰等。 【1】毕煌垒 , 何军林 , 刘克良 小分子干扰 RNA 分子化学 修饰研究进展 国际药学研究杂志 2008 年 12 月 第 35 卷 第 6 期 siRNA 在基因治疗的研究 有望使用 siRNA 治疗的疾病 使用 siRNA 治疗疾病的思路是根据病原体的致病基因序列以及生物体内与疾病发生相 关的基因序列,设计和制备与这些基因序列具有同源性的 siRNA ,然后通过某种方式将 siRNA 转移到动物体内使有关疾病基因发生沉默, 从而达到治疗的目的。 其优势在于只抑制 疾病相关蛋白的表达, 而不损伤正常细胞功能, 其序列特异性及基因抑制作用的强大性是其 他药物难以匹敌的 E6J。理论上,siRNA 可用于治疗任何由于基因发生突变或过度表达引起 的疾病,只要确定了与疾病相关的靶点,就可以通过 siRNA 特异性地使靶基因沉默 E11I。 目前的研究大都处于细胞水平及动物(主要是啮齿类动物)研究阶段,主要是研究基因表达下 调后,对一系列细胞生命过程,诸如信号传导、细胞凋亡以及细胞生命周期的影响,从而确 定 siRNA 用于疾病治疗的潜在靶点,进一步研究其用于基因治疗的可能性。 传染病 目前, 传染病的治疗方法大多仍依靠抗生素, 然而抗生素的滥用以及耐药菌株的大量产 生, 是摆在医疗工作者面前十分严峻的问题。 如果具有强大基因抑制功能以及高度特异性的 siRNA 能够用于传染病的治疗,将是传染病治疗史上的一大突破。有望治疗的传染病有:1 由病毒及细菌引起的传染病, 由寄生虫引起的传染病。 【2】 温爱萍, 徐小, 薇 “, 李大魁 小 分子干扰 RNA 用于基因治疗的研究进展 中国药学杂志 2006 年 12 月第 41 卷第 23 期 肿瘤 肿瘤基因治疗主要是利用 RNAi 的高特异性抑制肿瘤细胞中原癌基凶的表达。 本文主要 介绍在转录、转录后、翻泽等不同水平实现 RNAi 的特异效应作用机制。 1.1 转录水平该调控主要通过小分子干扰核糖 核酸(siRNA)与互补 DNA 直接结合而发挥作用,激发同源 DNA 甲基化的加强,使目的 基因转录受限,表达关闭,进而加强基因沉默。如果甲基化出现在启动子区域,则转录不能 进行,若甲基化出现在编码区,则转录进行,但在转录后水平上沉默。 1.2 转录后水平 转录后水平的 RNAi 机制主要分为 2 个阶段:起始阶段和效应阶段。起始阶段主要包括 双链核糖核酸(dsRNA)的导人和切割,导入主要包括外源性导入或由转基因、转座子、病毒

感染等多种方式引入的 dsRNA;切割则是指 dsRNA 在细胞内被切酶(dicer)切割成 2l~23 nt 长度的 siRNA。效应阶段是在 siRNA 反义链指导下,双链 siRNA 与 1 个 RNA 酶结合形成 沉默复合体(RNA inducedsi.1encing complex,RISC)Ls],之后 siRNA 双链解旋,正义链释 放, 激活 RISC, 激活后的 RISC 通过碱基配对识别互补的靶 mRNA, siRNA 反义链与 mRNA 复合体换位,并在距 siRNA 3’末端的 12 nt 处切割靶 mRNA,从而实现对 mRNA 的降解。 降解位点多为尿嘧啶。 1.3 翻译水平 翻泽水平上的 RNAi 是抑制相应 mRNA 的翻译,使相应的蛋白质表达受阻,其中起重 要作用的是小时序 RNA(smMltemporalRNA,stRNA),它是由长度约 70 nt 的 RNA 形成的茎 环样前体经 dicer 酶作用后形成长约 2l~23 nt 的 dsRNA, 通过 RISC 结合在相应 mRNA 的 3 末端非翻译区上,进而阻断 mRNA 的翻译。 RNAi 技术在体外抗肿瘤方面的研究如肝癌,乳腺癌,肺癌以及在其他癌症基因治疗的 研究。 【3】 陈芳芳,李晓军 RNA 干扰在肿瘤治疗上的研究进展 医学研究生学报 第 22 卷第 8 期 2009 年 8 月 结语 siRNA 已经被广泛应用于功能基因组研究,确定了大量潜在的药物作用靶点,同时,也 证实了其作为新一代基因治疗药物的可能性。 限于篇幅, 笔者仅介绍了相关研究中的一小部 分。研究表明,它对于其他疾病,诸如呼吸系统疾病、心血管疾病以及糖尿病等同样具有应 用潜力。由 siRNA 介导的 RNA 干扰现象的发现为人类疾病的基因治疗提供了新的方法,尽 管其在新药开发领域的应用仍然处于起步阶段, 但是一些生物技术公司和制药企业已经在致 力于研发用于疾病治疗的 siRNA。人们对 siRNA 的认识还在不断发展,相信随着我们对疾 病以及 siRNA 的作用机制的认识越来越深入,随着 siRNA 转移系统的不断改进以及更多的 人类疾病相关基因靶点的发现, siRNA 在科学研究领域发挥的作用将会越来越大, 其在基因 治疗领域的发展前景也会越来越广阔。 参考文献 【1】 毕煌垒 , 何军林 , 刘克良 小分子干扰 RNA 分子化学修饰研究进展 国际药学 研究杂志 2008 年 12 月 第 35 卷 第 6 期 【2】温爱萍,徐小,薇“,李大魁 小分子干扰 RNA 用于基因治疗的研究进展 中 国药学杂志 2006 年 12 月第 41 卷第 23 期 【3】 陈芳芳,李晓军 RNA 干扰在肿瘤治疗上的研究进展 医学研究生学报 第 22 卷第 8 期 2009 年 8 月


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