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分子生物学实验指导(2013)


分子生物学实验技术
Laboratory Protocol of Molecular Biology

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实验内容

实验一、从动物组织及血液中制备基因组 DNA 实验二、鸡 MC1R 基因 PCR 扩增与 PCR-RFLP 检测 实验三、鸡 TYR 基因 PCR 扩增与 PCR-RFLP 检测

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实验一、从鸡组织及血液中制备基因组 DNA
1.仪器
手术剪刀、眼科剪刀、酒精灯、台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、微量移液器、 凝胶成像系统、恒温培养箱、恒温水浴锅、电子秤量器、摇床、离心管、枪头、 乳胶手套等

2.材料
鸡冷冻肌肉组织、鸡全血样品,GL2000 分子量标记。

3.溶液及试剂
1)化学试剂 TE 缓冲液(含 RNA 酶) 、Tris 饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、70%乙醇 2)酶类 蛋白酶 K、RNA 酶 4)电泳类试剂 1×TBE 电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙锭溶液(EB) 、琼脂糖凝胶

4.操作步骤
1.取样 a)组织样品:用剪刀剪取鸡冰冻肌肉组织 0.2~0.5g 于 1.5ml 离心管内。 b)血液样品:用微量移液器取 10 ul 鸡全血样品于 1.5ml 离心管内。 2. 立即加入 700ul STE 液 (含 RNA 酶) 同时加入 77ul 10%SDS 液 , (总体积 1/10) , 用眼科剪刀剪碎组织样品。 3.加入 20ul 蛋白酶 K(20mg/ml),指弹混匀。 4.70℃消化 20 分钟。 5.加 700ul Tri 饱和酚,置脱色摇床抽提 10 分钟。 6.12000rpm 离心 1 分钟,取上清液于另一 1.5ml 离心管中。 7.加 700ul 酚氯仿(1:1)于离心管中,置于脱色摇床抽提 10 分钟。 8.12000rpm 离心 1 分钟,取上清液于另一 1.5ml 离心管中。 9.加 700ul 氯仿-异戊醇(24:1) ,置于脱色摇床抽提 10 分钟。 10.12000rpm 离心 1 分钟,取上清液于另一 1.5ml 离心管中。
3

11.加 750ul 异丙醇充分摇匀沉淀 DNA。 12.8000rpm 离心 3 分钟沉淀 DNA。 13.倒掉上清液,加入 1ml 70%冷乙醇指弹洗涤 DNA 沉淀。 14.12000 rpm 离心 2 分钟充分沉淀 DNA,倒掉上清液,室温自然干燥 DNA 沉淀。 15.待 DNA 沉淀完全干燥,加 200ul TE 液(含 RNA 酶)溶解 DNA,室温 30min 后 放入 4℃保存备用。若要长期保存,放入-20℃冰箱冻存。

5.电泳检测
1)1%琼脂糖凝胶的配制 称取 1g 琼脂糖,置于三角瓶中,加入 100ml TBE 工作液,混匀后将该三角瓶 置于微波炉加热煮沸 10sec,加入 20ul(约一滴)溴化乙锭(1mg/mL) ,混匀后 室温降温至 50℃左右。用挡板封住胶板,在固定位置放上梳子,将凝胶缓慢倒 入胶板,室温下静止 30min 左右,待凝胶凝固后,轻轻拔出梳子。拔掉挡板,将 凝胶板放入含有 TBE 缓冲液的电泳槽中。 1)点样 取 5ul 提取的动物基因组 DNA,分别与适量的溴酚篮(样品的 1/5)混匀后, 点入凝胶孔内。同时将分子量标记 5ul(DGL2000)也点入凝胶第一孔位置内。 注: DGL2000 分子量标记分别是: 2000bp, 1600bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp。 2)电泳 接通电源后,将电泳仪的电压调至 100V,电泳 1 小时左右,溴酚篮移动距 点样孔 2cm 左右,停止电泳。 3)观察和拍照 将凝胶从凝胶板上取下,放到紫外观察箱中,打开紫外观察灯 254nm,可见 到大分子量的动物基因组 DNA。凝胶 DNA 的拍照采用凝胶成像仪。

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实验二、鸡 MC1R 基因 PCR 扩增与 PCR-RFLP 检测
1.仪器
台式高速离心机、PCR 基因扩增仪、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系 统、离心管、枪头、乳胶手套等。

2.材料

鸡基因组 DNA(15ng/ul) 。

3.溶液及试剂
1))引物 PCR 扩增鸡 MC1R 基因 上游引物 MC1R-F: 下游引物 MC1R-R: 扩增片段约 750bp 2)化学试剂 10×PCR buffer,dNTPs(10mM) ,石蜡油 3)Taq 酶 5U/ul 4)电泳类试剂 1×TBE 电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙锭溶液(EB) 、琼脂糖凝胶

4.操作步骤 1) PCR 扩增
① 按以下顺序配制 PCR 反应混合物(总体积 25ul)
dH2O 10×Buffer 1× 16.8 4 0.75 0.75 0.5 0.2 23 2× 33.6 8 1.5 1.5 1 0.4 46 5× 84 20 3.75 3.75 2.5 1 115 12× 201.6 48 9 9 6 3 276

MC1R-F (10uM) MC1R-R (10uM)
dNTP (10 mM) Tag (5U/ul) 合计

按每管 23ul 分装后,分别加模板 DNA 2ul (约 30ng)。最后每管加一滴石蜡油覆 盖反应混合物,防止液体挥发。

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② PCR 反应条件

预变性:94℃ 3min 变性:94℃ 45sec 退火:58℃ 45sec 延伸:72℃ 60sec 后延伸:72℃ 5min ③ 电泳检测 用 1%的琼脂糖胶检测(胶的配制及电泳方法与实验一相同) ,取 5ul PCR 产 物与适量溴酚篮(1ul)混匀后电泳。 电泳条件:电压 100V, 时间:30min 左右 拍照:在紫外凝胶成像仪上拍照。 35 cycles

2)PCR-RFLP 检测 酶切反应 按以下顺序配制酶切反应混合物(反应总体积 20ul) 反应物 灭菌水 10×酶解缓冲液 Taq I (10I/ul) 合计 1× 13ul 2ul 1ul 16ul 2× 26ul 4ul 2ul 32ul 10× 130 ul 20 ul 10 ul 160 ul

按每管 16ul 分装,分别加 PCR 产物 4ul(约 100ng)。 3)酶切反应条件 在水浴锅 65℃ 酶解 4h 以上。 4)电泳检测 用 1.5%的琼脂糖胶检测 (胶的配制及电泳方法与实验一相同) 取全部 20ul , 酶切产物与适量溴酚篮(4ul)混匀后电泳。 电泳条件:电压 100V, 时间:1h 左右

拍照:在紫外凝胶成像仪上拍照,保存。

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实验三、鸡 TYR 基因 PCR 扩增与 PCR-RFLP 检测
1.仪器
台式高速离心机、PCR 基因扩增仪、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系 统、离心管、枪头、乳胶手套等。

2.材料

鸡基因组 DNA(15ng/ul) 。

3.溶液及试剂
1))引物 PCR 扩增鸡 MC1R 基因 上游引物 TYR-F: 下游引物 TYR-R: 扩增片段约 1300bp 2)化学试剂 10×PCR buffer,dNTPs(10mM) ,石蜡油 3)Taq 酶 5U/ul 4)电泳类试剂 1×TBE 电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙锭溶液(EB) 、琼脂糖凝胶

4.操作步骤 1) PCR 扩增
① 按以下顺序配制 PCR 反应混合物(总体积 25ul)
dH2O 10×Buffer 1× 16.8 4 0.75 0.75 0.5 0.2 23 2× 33.6 8 1.5 1.5 1 0.4 46 5× 84 20 3.75 3.75 2.5 1 115 12× 201.6 48 9 9 6 3 276

TYR-F (10uM) TYR-R (10uM)
dNTP (10 mM) Tag (5U/ul) 合计

按每管 23ul 分装后,分别加模板 DNA 2ul (约 30ng)。最后每管加一滴石蜡油覆 盖反应混合物,防止液体挥发。

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② PCR 反应条件

预变性:94℃ 3min 变性:94℃ 45sec 退火:60℃ 45sec 延伸:72℃ 1.5 min 后延伸:72℃ 8min ③ 电泳检测 用 1%的琼脂糖胶检测(胶的配制及电泳方法与实验一相同) ,取 5ul PCR 产 物与适量溴酚篮一滴(约 1ul)混匀后电泳。 电泳条件:电压 100V, 时间:40min 拍照:在紫外凝胶成像仪上拍照。 左右 35 cycles

2)PCR-RFLP 检测 酶切反应 按以下顺序配制酶切反应混合物(反应总体积 20ul) 反应物 灭菌水 10×酶解缓冲液 1× 13ul 2ul 2× 26ul 4ul 2ul 32ul 10× 130 ul 20 ul 10 ul 160 ul

Hind III (10I/ul) 1ul 合计 16ul

按每管 16ul 分装,分别加 PCR 产物 4ul(约 100ng)。 3)酶切反应条件 在水浴锅 37℃ 酶解 4h 以上。 4)电泳检测 用 1.5%的琼脂糖胶检测 (胶的配制及电泳方法与实验一相同) 取全部 20ul , 酶切产物与适量溴酚篮(4ul)混匀后电泳。 电泳条件:电压 100V, 时间:1.5 h 左右 拍照:在紫外凝胶成像仪上拍照,保存。
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