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遗传学实验(汇总)


遗传学实验指导

山东农业大学遗传学教研室 二 OO 五 年

目 录
实验一 植物花粉母细胞减数分裂的染色体观察 实验二 植物花粉母细胞减数分裂制片技术 实验三 植物根尖压片技术 实验四 染色体组型分析 实验五 基因的分离、独立分配和互作 实验六 连锁基因的遗传分析 实验七 果蝇的形态鉴别和饲养管理 实验八 辐射对植物染色体的诱变作用 实验九 植物 DNA 的提取与定量分析 实验十 植物的 RAPD 分析

实验一 植物花粉母细胞减数分裂的染色体观察

一、实验原理
减数分裂是性母细胞在分裂形成配子过程中一种特殊的细胞分裂方式。在这个过程中,染色 体复制一次,细胞分裂两次,最终形成的配子染色体数目比母细胞减少一半。雌雄配子受精结合 后代又恢复正常的染色体数目,从而保持了物种在遗传上的稳定性;同时由于减数分裂中同源染 色体的非姊妹染色单体的交换为后代的变异提供了基础。 减数分裂包括减数第一次分裂和减数第二次分裂两个连续变化的阶段。每个阶段根据细胞和 染色体的变化特点分为前期、中期、后期和末期四个时期。由于减数第一次分裂的前期较长,染 色体变化也比较复杂,所以又常常将前期 I 分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变(浓缩) 期。 染色体是遗传物质的载体,在减数分裂中的行为对遗传物质的分配和重新组合具有重大影响, 因此了解染色体在减数分裂中所表现的特殊变化,可以从细胞学水平加深对遗传学基本规律的理 解。本实验通过在光学显微镜下对供试材料永久制片的观察熟悉性母细胞和染色体在减数分裂过 程中各个时期的变化特点,对减数分裂的具体过程和意义有深刻的了解。

二、实验材料和实验用品
玉米、小麦等花粉母细胞减数分裂的永久制片和照片,以及显微镜、擦镜纸等。

三、实验内容与步骤
利用玉米、小麦等花粉母细胞的减数分裂永久制片,参考减数分裂各个时期的显微照片,在 显微镜下进行系统地观察,掌握各个时期的特点。 减数分裂各个时期的主要特点简述如下: 1.前期 I (1)细线期:细胞核内开始出现细而长交织成一团的线状物,难以找到两端,无法计数,这 是初期形成的染色体。核仁和核膜清晰可见。 (2)偶线期:同源染色体配对联会形成“二价体” 。由于此时每条染色体已经复制,因此每 个二价体包含四条染色单体。由于同源染色体联会的行为在光学显微镜下看不到,并且这一时期 时间较短,染色体又很细长,难以同细线期明显区分开来。这一时期核仁和核膜仍清晰可见。 (3)粗线期:染色体进一步螺旋化呈粗线状。染色体的个体性逐渐明显。非姊妹染色单体之 间的“交换”就发生在该时期,但“交换”的行为不能直接在显微镜下观察到。核仁和核膜在这 一时期仍然可以看见。 (4)双线期:染色体进一步缩短变粗,每个二价体的一对同源染色体相互排斥,并开始彼此 分开。但由于非姊妹染色单体的交换,每个二价体出现了数目不定的交叉结使二价体仍然维持在 一起而不完全分开。该时期核仁和核膜仍然可见。
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(5)终变期:染色体高度浓缩,交叉结端化,每个二价体只在末端相连,核仁和核膜仍然可 见。此时所有二价体分散在整个核内,可以进行染色体计数,某生物有多少对染色体此时就有多 少个二价体。 2.中期 I:核仁和核膜的消失,标志着前期的结束,中期的开始。此时,所有二价体排列在 纺锤体的赤道面上。每个二价体两条染色体的着丝点分别趋向纺锤体的不同极。如果从纺锤体的 一极向赤道面观察,仍可计数染色体。由于一对同源染色体两个成员的着丝点朝向细胞的哪一极 完全是随机的,因此在不同性母细胞中,此期染色体的排列具有多种可能性。 3.后期 I:每个二价体的两条染色体都以着丝点为先导,由纺锤丝牵引分别向细胞的两极移 动。结果细胞的每一极只分到了一对同源染色体中的一条,从而使每一极分到的染色体数只有原 来的一半。此时分到每一极的每条染色体的两条姊妹染色单体仍然由共同的着丝点连在一起。 4.末期 I:染色体到达细胞两极后,细胞的每一极又重新形成核膜和核仁,随之胞质分裂(有 的植物此时胞质不分裂) ,形成两个子细胞,称为“二分子” 。 减数第一次分裂结束后,经过一个短暂的间期,很快进入减数第二次分裂,第一次分裂是染 色体数目减半的过程。 5.前期 II:细胞核内又重新出现染色体。每个染色体的两条姊妹染色单体仍由同一个着丝粒 连在一起,但两臂已彼此分开。 6.中期 II:每个子细胞内的染色体都以自己的着丝点排列在细胞的赤道面上,染色单体的两 臂自由地散开。 7.后期 II:每条染色体的着丝点纵裂,两条姊妹染色单体在两极纺锤丝的牵引下,相背移向 两极。 8.末期 II:染色体分到两极后,细胞的每一极又重新形成核仁和核膜,然后胞质分裂。整个 减数分裂过程使原来的一个母细胞分裂成四个子细胞,每个子细胞内只含有母细胞染色体数目的 一半。分裂刚完成时四个子细胞彼此靠在一起,称为“四分子” 。

四、思考题
1.玉米的体细胞中有 10 对染色体,中期Ⅰ时可能的排列方式有多少种? 2.以玉米为例说明在减数分裂过程中,染色体数目怎样从 2n=20 变为 n=10。

五、作业
绘制减数分裂粗线期、终变期、中 I、后 I、中 II、后 II 的图像。

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实验二 植物花粉母细胞减数分裂制片技术

一、实验原理
减数分裂是生物在性母细胞成熟形成配子过程中发生的一种特殊有丝分裂,它包括连续两次 的细胞分裂,第一次分裂是减数的,第二次是等数的。第一次分裂的前期较长,染色体变化较复 杂,可细分为 5 个时期,即细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期。染色体在减数分裂的行 为对遗传物质的分配和重组产生重大影响。 高等植物在形成雄配子的过程中,花药内的小孢子母细胞(2n) ,经过减数分裂最终产生四个 小孢子。每个小孢子内的染色体数目已减半为 n。以后每个小孢子进一步发育为花粉粒。由于植物 花药取材容易,操作方便,一般作为减数分裂制片材料。在适宜的时期采集植物的花蕾,经固定 液杀死固定,使细胞保持活体时形态。然后进行压片染色等处理,制成减数分裂玻片标本,在显 微镜下进行观察,可以看到小孢子母细胞的减数分裂过程(即染色体由双倍变为单倍体的过程) , 研究染色体在形态和数量上的动态变化特点。

二、实验材料和实验用品
1.实验材料 2.实验用品 显微镜、解剖针、载玻片、盖玻片、镊子、培养皿、酒精灯、吸水纸、纱布、刀片、滤纸、 火柴、等。 3.实验药品 无水乙醇、95%乙醇、重铬酸钾、浓盐酸、浓硫酸、冰醋酸、二甲苯、加拿大树胶和洋红(或 苏木精) 。 玉米雄花序

三、实验方法与步骤
1.取材:选取适当大小的花蕾,是观察花粉母细胞减数分裂的关键性步骤。不同植物取材时 期不同。 玉米:在抽雄前两周左右(大喇叭口期) ,用手指从喇叭口处向下挤捏叶鞘,触到有松软感处, 即是雄花序所在部位。在该处用刀片纵向划一切口,用镊子取出花序分枝。此时雄花序先端小穗 颖长 4mm 左右,花药长 2~3mm,每一分枝中上部小穗发育最早。 取材时间一般在上午 9 时~10 时,不同材料间稍有差异。 2.固定:取下的材料应立即放入固定液中杀死固定。在 4~15℃条件下,一般固定时间为 24 小时。固定后的材料先用 95%酒精漂洗至无醋酸气味,再移到 70%酒精中置于冰箱内保存。常用 的固定液是法氏固定液,在使用这种固定液时应注意现配现用,固定时不要在阳光下暴晒。 3.染色和压片:先将已固定的材料置于培养皿内并倒入少许保存液。用镊子摘取一个适当大 小的小穗或花蕾放在吸水纸上吸掉多余的酒精, 然后放在载玻片中央。 用解剖针挑出 2~3 个花药,
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并立即滴醋酸洋红或醋酸铁矾苏木精染色液于花药上。用解剖针将花药横向切断,并从一端向切 口轻轻挤压花药,使花粉母细胞从切口处逸出。然后用镊子除尽花药壁等杂物。这是压片优劣的 关键步骤之一,如不去净残渣,则不容易把分裂的细胞压平,使染色体不容易分散开,并且在制 作永久片的过程中,细胞会从载玻片上大量脱落。去净残渣后,在低倍镜下进行初步镜检,如果 花粉母细胞处于减数分裂时期,即可加上盖玻片。加盖玻片时,先使盖玻片的一边放在载玻片上, 待染液布满整个边缘时,左手握镊子顶住盖玻片,右手握解剖针托住盖玻片轻轻放下。加上盖玻 片以后,如有多余染色液,可用吸水纸吸去;如染色液不能布满盖玻片,则在盖玻片一边稍加染 色液,然后在酒精灯上烤片。烤片时,用手平持片子在酒精灯上方来回移动,并经常将片子放在 手背上试温,以片子不烫手为宜,可反复进行多次。烤片是制片过程中的一项很重要的步骤。通 过烤片可使细胞质颜色变浅,而染色体能得到充分鲜明的着色。烤片以后可在盖玻片上加一小块 吸水纸,以拇指或用带橡皮头的铅笔轻压盖片。应注意不要使盖片移动。如果镜检发现染色体染 色太浅,可在盖玻片周围稍加染色液再烤;如果染色太深,可从盖玻片一边滴加 45%冰醋酸,在 另一边用吸水纸吸,让冰醋酸从盖玻片下流过直至细胞质颜色较浅而染色体着色明显清析为止。 4.制作永久片:要使片子能长期保存应用,可制成永久片。永久片的制作主要包括分片、脱 水透时和封片三个步骤。首先用培养皿(内置 U 型玻璃管或一根短玻棒)若干套编号,配制多级 脱水剂(常用脱水剂见附录二) 。 (1)分片:准备制成永久片,首先使其翻转让盖玻片朝下浸入第一级培养皿内分片。让载玻 片的一端搭在短玻棒上,另一端和皿底接触,使盖玻片自然脱落,并标记载玻片和盖玻片原来相 对应的方向和位置。 (2)脱水透明:用一端劈开的去磷头火柴棒夹住盖玻片(方向不变,材料朝上) ,放入第二 级培养皿中。而载玻片要翻转使有材料的一面朝上。然后依次逐级脱水,一般每级约 1~2 分钟。 如用第三种脱水剂每级约 20~30 秒钟。为了防止在脱水过程中细胞从片上脱落,在制片时可先在 盖玻片上涂一层蛋白甘油胶,在酒精灯上烘烤至冒出轻烟后,稍凉片刻盖在有材料的载玻片上。 (3)封片:片子从最后一级培养皿内取出后稍凉,于载玻片上原来加盖玻片的位置中间滴一 滴完整的加拿大树胶,然后翻转盖玻片(使有材料的一面朝下) ,按原来的方向和位置轻轻盖在树 胶上。要使盖玻片随着胶的扩展自然下沉,不要施加压力或移动盖玻片。然后平放在阴凉处晾干 再镜检。对于镜检符合要求的片子,在载玻片右端贴上标签,注明标本名称,制片日期。 [附]冷冻分片法: 这种方法快速简单。 对准备制作永久片的玻片, 先用液态二氧化碳干冰冷冻, 或用冰冻致冷器进行冷冻,待完全冷冻结冰后,用刀片将盖玻片同载玻片分开,将载玻片和盖玻 片放在 37℃左右的温箱内烘干。取出后放在二甲苯内浸泡 10~20 分钟,滴加树胶封片即可。

四、作业和思考题
1.写出制片步骤流程图。 2.制作两张质量较好的临时片(有条件可制作永久片) ,并绘出自己所制作片子的分裂相, 说明其时期和特点。

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实验三 植物根尖压片技术

一、实验原理
有丝分裂是植物细胞分裂、体细胞增殖的主要方式,在有丝分裂过程中,细胞核内染色体准 确地复制,并有规律地、均匀地分配到两 个子细胞中,使子细胞和母细胞具有同样 数目和形态结构的染色体,保证了植物细 胞的遗传性状的一致。各种生长旺盛的植 物组织中,如根尖组织、茎尖组织、居间 分生组织、愈伤组织等,细胞常进行着旺 盛的有丝分裂。在细胞分裂的适当时期取 材,通过对供试材料进行一定的处理,就 可以在显微镜下观察染色体的变化特点和 染色体的形态特征,并进行染色体计数。 由于在有丝分裂的中期染色体具有典 型的形态特征,并易于计数,因此为了获 得更多的中期染色体图像,可以采用药物 处理或冰冻处理的方法,阻止纺锤体的形 成,使细胞分裂停止在中期。同时通过处 理还可使染色体缩短,易于分散,便于进行观察研究。另外,通过对细胞组织进行酸性水解或酶 处理除去细胞之间的果胶层,并软化细胞壁,使细胞容易彼此散开,有利于压片和染色。

二、实验材料和实验用品
1.材料:圆葱、大蒜、黑麦、玉米、小麦和蚕豆。 用品:显微镜、恒温箱、冰箱、水浴锅、分析天平、剪子、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、 滤纸、量筒、培养皿、烧杯、滴瓶、酒精灯、切片盒、标签等。多媒体系统(附显微演示) 。 2.药品:无水乙醇、95%乙醇、冰醋酸、蒸馏水、碱性品红、苏木精、秋水仙素、饱和对二 氯苯溶液、0.002mol/L 8-羟基喹啉、1mol/L 盐酸、4%铁矾水溶液、2%醋酸洋红染色液、2.5%纤 维素酶和 2.5%果胶酶混合液。

三、实验内容和实验步骤
1.取材:可在室内培养根尖,也可以直接从田间挖取刚长出的幼嫩根尖。室内培养的方法是: (1)圆葱和大蒜根尖:发根前先将圆葱以根部向上在光下晒两天,然后置于盛清水的小烧杯 口上, 使根茎部与水接触,或将圆葱半埋于湿沙内。 20~25℃光照条件下培养 2~3 天, 在 待根长 1~ 2cm 时,选健壮根自尖端约 1cm 处剪下备预处理用。大蒜作材料可先将蒜瓣扒去皮,然后用细铁
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丝串起放在盛清水的培养皿内培养,其它要求同上。剪取根尖的时间以上午 10 时左右为好。 (2)玉米(或黑麦、小麦、蚕豆)根类:先将种子浸泡一天,待吸水膨胀后再转移到铺有几 层滤纸(或吸水纸)的培养皿内,加水湿润,然后将种子均匀地摆放在滤纸上,盖上盖。放在 18~ 20℃黑暗条件下培养,待根长到 1~2cm 时,选健壮根尖于上午 10 时左右取下备用。 田间从植株上直接取根的方法适用于大部分禾本科植物,例如在麦类作物生长季长出的大量 不定根,比种子萌发的根更健壮,是观察有丝分裂的很好材料。 2.预处理:为了阻止纺锤体的活动,获得更多的中期分裂相,同时使染色体相对缩短,便于 染色体分散和计数,可对根尖进行预处理。如果只是为了观察有丝分裂各期染色体动态,可以不 进行预处理。 预处理的方法有冰冻预处理和药物预处理两种。 (1)冰冻预处理:将根尖浸泡在蒸馏水中,置于 1~4℃冰箱内或盛有冰块的保温瓶中冰冻 24 小时。这种方法对染色体无破坏作用,染色体缩短均匀,效果良好,简便易行,各种作物都适 用。 (2)药物预处理:常用的药物有 0.05~0.2%秋水仙素溶液、饱和对二氯苯溶液、0.002mol/L 8 -羟基喹啉等。预处理时,将根尖直接浸泡在药液中,在适宜的温度下处理一定的时间(表 1) 。 这些药物都能使染色体缩短,但同时对染色体也有一定破坏作用。使用时应注意处理的时间,小 麦、黑麦、大麦、圆葱和大蒜等处理 4 小时左右,棉花和水稻等处理 2 小时左右。处理的时间长 短同温度有很大关系。

表1
药 品 条 件

常用药液预处理时间
圆 葱 15 4 室温 4 18 玉 米 室温 3 小 麦 25 2 室温 4 室温 4

温度(℃) 0.1% 秋水仙素溶液 处理时间(小时) 温度(℃) 饱和对二氯苯溶液 处理时间(小时) 温度(℃) 0.002mol/L 8-羟基喹啉 处理时间(小时)

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3.固定或前低渗:固定的目的是利用化学药品将生活细胞迅速杀死,并使构成染色体的核蛋 白变性和沉淀,以保持染色体的固有形态和结构。固定液一般采用卡诺氏固定液,配配制方法为 无水酒精:冰醋酸=3:1,也可用 95% 乙醇代替无水乙醇。 操作时将预处理后的根尖用蒸馏水冲洗两次 (约 5 分钟) 然后转移到卡诺氏固定液中。 4~ , 在 15℃条件下固定 20~24 小时,即可进行观察。如果需要长期保存,可先用 70%酒精冲洗 2 次然后
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转入 70%酒精中保存。 4.解离:解离的目的是使细胞壁之间中层的果胶物质以及部分细胞质分解,而使细胞易于分 散。同时也可使细胞壁适度软化而易于压片。解离的方法主要有以下几种。 (1) 将根尖用蒸馏水冲洗 2 次, 然后放入已经在 60℃水浴锅中预热的 1mol/L 盐酸中。 60℃ 在 恒温条件下处理 10~15 分钟,当根尖透明呈米黄色时取出。 (2)将根尖置于 95%酒精和浓盐酸的等量混合液中处理 2~10 分钟。或将根尖放在 5ol/L 盐 酸内处理 5~10 分钟。 (3)将根尖置于 2.5%果胶酶和 2.5%纤维素酶等量混合液中(PH 5~5.5) ,在室温 18~28℃ 条件下处理 2~3 小时。 5.后低渗:将根尖放在蒸馏水中冲洗 2~3 次(约 10 分钟) 。酶解后的根尖可浸泡 10 分钟, 然后再冲洗一次。根尖一定要冲洗干净,否则影响染色。低渗后的根尖放入 70%酒精中备用。 6.染色与压片:染色与压片的方法常用的有以下几种。 (1)醋酸洋红染色法:取一根尖放在吸水纸上吸去多余的保存液,然后放在一张干净的载玻 片中央。用刀片将根尖分生组织切下,将其切成薄片(越薄越好) ,滴 1 滴 2% 醋酸洋红染色液, 盖上盖玻片,进行压片。压片时用一手固定盖玻片,另一手用镊尖或解剖针柄轻敲盖玻片,使材 料溃散。用火轻烤载玻片背面,然后继续轻敲,待材料呈云雾状即可镜检。加热的目的是使染色 体充分染色和软化,以及破坏细胞质的染色。如发现有较理想的分裂相,可再轻烤一下片子,然 后在盖玻片上盖一张吸水纸,用大拇指用力压片(不可使盖玻片移动) ,然后镜检。 也可以采用十字交叉压片法。即:取根尖放在吸水纸上吸去多余的保存液,然后放在干净的 载玻片中央。用刀片将分生组织切下,将其切成薄片。取另一张干净的载玻片,呈十字形交叉盖 在放有材料的载玻片上。在载玻片上盖一张吸水纸,并用大拇指压片,使材料压成一薄层。然后 将两载玻片分开,各滴加 1 滴染色液进行染色。稍停片刻后加上盖玻片,在酒精灯上轻烤一下片 子,一手固定盖玻片,另一手用铅笔橡皮头对准材料轻轻敲打,使根尖细胞分散均匀。 (2)改良卡宝品红染色压片法:将根尖置于干净的载玻片中央,切下根尖分生组织,将其切 成薄片,滴一滴改良卡宝品红染色液,盖上盖玻片压片。 。 (3)铁矾苏木精染色压片法:先将根尖放入 4%铁矾水溶液中媒染 2~4 小时。然后流水冲洗 20 分钟,再将根尖放入 0.5%苏木精染液中避光染色 40~120 分钟,取出后放入蒸馏水中备用。其 制片方法,取一染色后的根尖放在干净载玻片的中央。用刀片将根尖分生组织切下,将其切成薄 片(越薄越好) ,滴 1 滴 45%冰醋酸,加盖玻片,具体压片方法同上。 7.镜检:压好的片子先在低倍镜下镜检,找到分裂细胞后转换高倍镜观察。如果染色体分散 较好,图象清晰,就可以脱水封片,制成永久片。

四、思考题和作业
1.在你所观察的根尖中,哪些分裂时期最多,为什么? 2.解离的目的是什么?固定液的作用是什么? 3.对于一些不易取到根尖的材料,如何观察它们的有丝分裂和染色体数目? 4.制作两张合格的有丝分裂玻片。 5.绘出在显微镜下观察到的各期有丝分裂图象。
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实验四 染色体组型分析
一、实验目的
分析植物细胞有丝分裂中期染色体数目、大小、着丝粒位置和随体等形态特征,学习染色体 组型分析的方法。为物种起源和进化提供依据,为遗传育种研究提供细胞学证据。

二、实验原理
各种生物染色体的形态,结构和数目都是相对稳定的。每一生物细胞内特定的染色体组成叫 染色体组型。染色体组型分析也称核型分析。通过一定的方法制得染色体有丝分裂的玻片标本, 经显微照相,冲洗放大等步骤获得染色体照片。从染色体玻片标本和染色体照片的对比分析,进 行染色体分组,并对组内各染色体的长度,着丝点位置,臂比和随体有无等形态特征进行观测和 描述,从而阐明生物的染色体组成,确定其染色体组型,这种过程称为染色体组型分析。

三、实验材料
蚕豆(Vicia faba, 2n=12) ,洋葱(Alliums cepa, 2n=16) ,大麦(Hordeum sativum 2n=14) , 黄麻(Tiliaceae Corchorus, 2n=14) 。

四、实验仪器及用具
显微镜,显微照相系统,相片冲洗放大整套设备,目镜测微尺,镜台测微尺,4 放大纸,135 黑白胶卷,计算器,透明尺,剪刀,坐标纸,胶水以及制作有丝分裂玻片所需的用具。


五、药品和试剂
制作有丝分裂玻片所需的药品和试剂(见实验一)以及显微摄影冲洗放大所需的药品和试剂: 米吐尔,无水亚硫酸钠,几奴尼(对苯二酚) ,无水碳酸钠,溴化钾,硫代硫酸钠,硼酸,钾矾(硫 酸铝钾) ,28%醋酸

六、实验方法与步骤
(一)染色体标本玻片的制作 染色体组型分析一般用有丝分裂中期的分裂细胞,通常采用植物根尖细胞。有丝分裂中期的 染色体具有典型的形态特征,便于进行分析,具体制作方法见实验一。 (二)镜检和测量 当染色体玻片制好后,放在显微镜下观察,选出符合染色体组型分析要求的细胞,这些细胞 是处于有丝分裂中期,染色体分散良好,没有重叠,数目完整,随体和着丝点明显,没有断裂, 着色鲜明,形态清晰,且各条染色体处于同一平面上。 选择染色体较平直的一条或几条,用目微尺(目镜测微尺)测量其长度。 (三)显微照相、冲洗和放大 将在显微镜下选定的符合要求的细胞进行显微照相(可用 10×100 倍的油镜) ,然后冲洗,选
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取图像清晰的底片,放大、洗印出染色体形态清晰的照片。在显微照相的同时,对镜台测微尺进 行同样倍数(油镜 10×100 倍)拍摄,放大,然后根据照片上的实际长度,计算放大倍数。 (四)测量和计算染色体的照相长度 1.测量 在放大的照片上用透明尺准确地量出各条染色体的总长度和每条染色体两臂的长度(分别量 到着丝点的中部) ,并将结果填入表 15。随体的长度可计入或不计入染色体长度之内,但应注明。 染色体弯曲不能用直尺测量时,可先用细线量取染色体相等的长度,再用尺量出细线的相应长度。 2.计算: (1)放大倍数的计算:计算放大倍数是利用在显微镜下直接测得的某平直染色体的实际长度 (μ) ,除以放大照片上的相应染色体的照相长度(μ) 。
放大倍数 = (2)绝对长度计算: 放大照片上的某染色体 的照相长度( ?) 目镜测微尺测定的实际 长度( ?)

某染色体(或臂)的绝对长度 =
(3)相对长度的计算

某染色体(或臂)的照相长度(?) 放大倍数

某染色体(或臂)的相 对长度 =
(4)臂比的计算

某染色体(或臂)的长 度( ? ) 染色体组内全部染色体 的总长度( ? )

臂比 =

长臂的长度( ? ) 短臂的长度( ? )

(五)染色体形态测量数据表
染色体 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 9 放大相片长度(mm) 长臂 短臂 全长 绝对长度(μ) 长臂 短臂 全长 相对 长度 臂 比 染色体 类型 备注

(六)剪贴和配对 将放大照片上的各条染色体剪下,根据目测和染色体的相对长度、臂比、着丝粒位置、次缢 痕的有无和位置、随体的有无和形态大小等特征,进行同源染色体配对。 (七)排列和粘贴 将配对好的染色体按照由大到小的顺序依次排列起来。排列时把各对染色体的着丝粒排在一 条直线上,并且使短臂在上,长臂在下。等长的染色体,把短臂较长的染色体排在前面。随体染 色体排在最后,性染色体和额外染色体单独排列。 已排好的同源染色体按染色体编号先后顺序粘贴在绘图纸上,粘贴时着丝粒要处在同一直线 上。 (八)分类 根据着丝点的位置,确定染色体的形态类型,臂比是反映着丝点在染色体上的位置。
臂 比 染色体类型 正中着丝粒染色体 中着丝粒染色体 近中着丝粒染色体 近端着丝粒染色体 端着丝粒染色体 符号 M m sm st t

1.0 1.0~1.7 1.7~3.0 3.0~7.0 7.0 以上

具随体染色体(sat)用*标出。 (九)绘图和翻拍 将剪贴排列的染色体组型图用座标纸绘制成染色体模式图并进行翻拍。

七、实验作业
1. 提交植物染色体组型剪贴图 2. 植物染色体组型的模式图 3. 染色体形态测量数据 4. 简述本实验的染色体组型结果。

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实验五 基因的分离、独立分配和互作
一、实验原理
孟德尔定律包括“分离定律”及“独立分配定律”。 根据分离规律, 位于一对同源染色体上的一对 等位基因在减数分裂形成配子时,要彼此发生分离,互不干扰地分到不同的配子中去。因此对于 一对基因的杂合体,在完全显性条件下,其自交子代和测交子代的表现型分离比例分别为 3:1 和 1:1。独立分配规律(自由组合规律)进一步揭示了位于非同源染色体上的多对独立遗传基因分离 和组合的关系。按照这个规律,位于非同源染色体上的两对基因在减数分裂的过程中,每一对基 因都分别按照分离规律进行分离,两对基因之间又可以发生自由组合,结果产生的四类配子比例 相等。因此对于两对基因的杂合体,在完全显性条件下,其自交子代和测交子代的表现型分离比 例分别为 9:3:3:1 和 1:1:1:1。 基因互作研究的是位于非同源染色体上的两对或两对以上独立遗传共同控制一对相对性状的 基因,互作的方式有互补、重叠、积加、上位、抑制作用等。上述互作方式尽管表现型的分离比 例不同,但基因分离和组合仍然遵循独立分配规律。 玉米曾经是遗传学研究的重要材料,籽粒性状的遗传是玉米遗传研究的一项基本内容。通过 具有各种籽粒相对性状的玉米杂交,对于籽粒进行遗传分析,有助于我们对分离、独立遗传规律 和不同的基因互作方式更深入的理解。 玉米籽粒由果皮、胚乳和胚三部分组成(如图1所示) 。它们的世代和遗传基础都不相同,果 皮是由子房壁形成的果皮和珠被形成的种皮愈合而成,是母体组织的一部分,为二倍体(2n) ,基 因型与母本相同。胚乳和胚是双受精产物,胚为二倍体(2n) ,胚乳是三倍体(3n) ,分为糊粉层 和淀粉层。果皮、糊粉层和淀粉层均呈现一定的颜色,最终影响籽粒的颜色。

图1

玉米种子外形和解剖图

玉米糊粉层色素的形成涉及以下几对基因:花青素基因 Alal、A2a2、A3a3;糊粉粒色基因 Cc、 Rr、PrPr 以及色素抑制基因 Ii 所控制。这几对基因控制籽粒颜色的机制为:只有当显性基因 Al、 A2、A3、C、R 同时存在、而抑制基因又呈隐性纯合 ii 时,色素才能形成;而色素形成的类别是由 Prpr 决定的,当显性基因 Pr 存在时,呈现为紫色,当隐性基因纯合 prpr 存在时则表现为红色。当
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显性基因 A1、A2、A3、C、R 中缺少任何一个或所有这些色素基因均为显性,但当显性抑制基因 I 存在时,均表现为无色。 淀粉层的颜色有黄色与白色之分,黄对白为显性,受一对等位基因的控制。 上述与胚乳的糊粉层和淀粉层有关的性状常表现花粉直感现象。直感现象是显性性状在籽粒 上的一种表现,当父本花粉含有显性基因时,它所控制的性状在当代杂种的籽粒上就可能表现出 来,而果皮则因与受精无关故不表现直感现象。

二、实验材料与实验用品
杂交处理后的不同类型的玉米果穗、计算器。

三、实验内容与步骤
取不同杂交组合的玉米果穗,分别观察、统计不同表现型籽粒的数目,将统计结果填入第四 项实验结果计算中的表格。 1.一对遗传性状的分析:紫色×白色杂交后代 F1 自交果穗和测交果穗。 2.两对独立遗传性状的分析: 紫色饱满×白色皱缩籽粒的玉米杂交 F1 自交果穗。 3.基因互补作用的遗传性状分析: 紫色×白色籽粒的玉米杂交 F1 自交果穗。

四、实验结果计算
1.将一对遗传性状的分析结果填入表 1,并说明实际观察结果与理论推断是否符合。

表1
项目 表现型 果穗 自交 观察值 (O)

一对遗传性状的分析结果表
(O-E)2/E X2=Σ[(O-E)2/E] P 值(与 0.05 比较)

理论值 (E)

O-E

测交

2.将两对独立遗传性状的分析结果填入表 2,并说明实际观察结果与理论推断是否符合。

表2
项目 表现型 果穗 自 交 果 穗 观察值 (O)

两对独立遗传性状的分析结果表
(O-E) (O-E)2/E X2=Σ[(O-E)2/E] P 值(与 0.05 比较)

理论值 (E)

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3.将基因互作的分析结果填入表 3,并给出合理解释。

表3
项目 表现型 果穗 显 性 互 补 观察值 (O) 理论值 (E)

基因互作性状分析结果表
(O-E)2/E X2=Σ[(O-E)2/E] P 值(与 0.05 比较)

(O-E)

五、思考题
1.基因型为 AaBbCcDd(各对基因独立遗传,显性完全,无互作)的个体自交后代中与亲本 表型完全相同的占多大比例?与亲本基因型完全相同的占多大比例? 2. 在玉米粒色的遗传中, 一个基因型为 CcPrpr 的个体自交后代的表型和比例如何?IiCc 个体 自交后代表型如何?

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实验六 连锁基因的遗传分析
一、实验原理
连锁遗传规律阐明了位于一对同源染色体上的连锁遗传基因分离和组合的关系。由于连锁遗 传基因在分离和组合过程中的相互影响,致使杂合体所产生的各类配子比例不等,其自交和测交 子代表现型的分离比例也因重组率的不同而异,但总是重组型少、亲型多。由于基因在杂色体上 的位置和距离不同,基因之间的连锁强度也不相同。 基因在染色体上的相对距离可以用重组率表示。决定玉米胚乳性状的某些基因有连锁遗传现 象,可以采用两点或三点测验法获得分离果穗,然后通过对籽粒性状的观测分析求得重组率,从 而获得基因在染色体上的排列顺序和遗传距离。 已知控制果蝇某些性状的基因位于 X 染色体上, 雄果蝇的 Y 染色体上不带有同 X 染色体上相 对应的基因。因此,在雄果蝇中表现为完全连锁遗传。通过野生型和突变型果蝇杂交,再使其杂 种同隐性纯合亲本测交,根据对测交子代的分析也可以确定基因的位置和距离。

二、实验材料和实验用品
1.材料:玉米紫色、饱满籽粒自交系与褐色、凹陷籽粒自交系的杂种一代(F1)果穗以及杂 种一代(F1)同褐色、凹陷亲本的测交果穗;野生型和具有白眼(w) 、小形翅(m) 、卷刚毛(sn) 的突变型果蝇。 2.用品:双筒解剖镜、放大镜、解剖针、计算器、粗头毛笔、白瓷板、培养瓶、麻醉瓶等。 3.药品:乙醚。

三、实验方法和实验步骤
1.玉米胚乳性状连锁基因重组率的测定:当两对基因为连锁遗传时,F2 和测交子代的分离比 例明显不同于独立遗传,表现为亲型个体数明显多于理论值,而重组型个体数明显少于理论值。 可见重组型的产生并不是非同源染色体自由组合的结果,而是同源染色体上连锁基因间发生交换 重组而产生的。在玉米中,决定糊粉层色泽紫色与褐色、籽粒形状饱满与凹陷的基因都位于第九 染色体上,表现为连锁遗传。使紫色、饱满(BzSh/BzSh)的个体与褐色、凹陷(bzsh/bzsh)个体 杂交,F1 为紫色、饱满(BzSh/bzsh) 。使其与隐性亲本测交,根据测交后代的表现型种类和比例就 可以确定这两对基因间的距离。 (1)观察杂合体(BzSh/bzsh)同隐性亲本的测交果穗,区别不同的表现型,计数各类籽粒的 数目。 (2)计算 bz-sh 之间的重组率。 (3)将连锁遗传的分析结果填入表 1。

表1
表现型 基因型 观察数 重组率(%)

玉米果穗两对性状连锁遗传分析结果表
总数

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2.果蝇连锁基因的三点测验 (1)使白眼、卷刚毛、小形翅突变型处女蝇与野生型雄蝇交配,每瓶 5 对。待化蛹后除去亲 本成蝇,羽化后鉴定杂种蝇。F1 的雌蝇应该为红眼、直刚毛、长翅,而雄蝇表现为白眼、卷刚毛、 小形翅。 (2)将 F1 雌蝇同突变型雄蝇交配,7~8 天后移出亲本蝇,以测交子代成虫出现开始,每两 天观察一次,将结果填入表 2。 (3)分析计算 ①根据实验结果确定三对基因的遗传关系。即三对基因是独立遗传还是连锁遗传,或一对独 立两对连锁。 ②确定各类交换类型和亲型。 ③确定三对基因的排列顺序,分析双交换类型,如果有两对性状出现了还原为亲本的组合类 型,则决定第三对性状的基因必在中间。 ④计算重组率:

表2
类别 + w 单交换 I w + 单交换 II + w 双交换 w + 基因型 + sn + sn + sn + sn + m + m m + m +

果蝇三对性状连锁遗传分析结果表
表现型 红眼 白眼 白眼 红眼 红眼 白眼 白眼 红眼 直刚毛 卷刚毛 直刚毛 卷刚毛 直刚毛 卷刚毛 直刚毛 卷刚毛 长翅 小翅 长翅 小翅 小翅 长翅 小翅 长翅 个体数 每组 合计 每组占 总数% 交换 情况

亲型

单交换I (%) =

单交换I个体数 + 双交换个体数 × 100 总个体数

单交换II (%) =

单交换II个体数 + 双交换个体数 × 100 总个体数
双交换个体数 × 100 总个体数
实际双交换值 理论双交换值

双交换(%) =

符合系数 =
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⑤绘制连锁图:以 1%作为一个距离单位,按照基因的排列顺序,绘出连锁图。

四、思考题和作业
1.相引相和相斥相杂交后代计算交换值有何不同? 2.将玉米和果蝇的实验结果写成实验报告。

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实验七 果蝇的形态鉴别和饲养管理
一、实验原理
普通果蝇(Drosophila melanogaster)在分类上属昆虫纲、双翅目、果蝇属。它作为遗传学研 究的材料是因为它具有以下几个优点: 1.饲养简单:凡能发酵的东西都可以作为饲料。 2.生活周期短,繁殖快:在 25℃时由卵到成虫只需 10 天左右,并且易于获得较大的后代群 体。一对果蝇交配后可以产生 400~500 个甚至上千个卵。 3.染色体数目少(2n=8) :第一号染色体为性染色体,第二、三号染色体是两对近等臂染色 体,第四号是粒状染色体。 4.能够经常见到突变个体,且多为形态性状突变,比如白眼、残翅、黑檀体等,易于观察。 5.幼虫的唾腺染色体具有体细胞联会的特点,并且唾腺染色体是一种巨型多线染色体,可比 正常染色体大 100~200 倍。在普通光学显微镜下就能看到染色体上具有不同的带纹,是研究染色 体结构变异的好材料。 由于果蝇的以上特点使其在现代生物学研究中已成为一种模式生物,对于它的发育、基因组 结构等的研究已经日益深入。所以,掌握果蝇的饲养管理以及形态鉴别对于利用该类模式生物进 行遗传学研究必不可少。

二、实验材料与实验用品
饲养的野生果蝇和几种常见突变型果蝇、双筒解剖镜、放大镜、镊子、解剖针、麻醉瓶、培 养瓶、白瓷板、粗头毛笔、乙醚、70%酒精、琼脂、玉米粉、蔗糖、酵母(新鲜的或干粉)等。

三、实验内容与步骤
1.果蝇的饲养管理 培养时多使用广口瓶培养,在装培养基前要进行高温灭菌处理。 酵母菌是果蝇的主要食物,凡能发酵的物质都可以用来培养它。几种饲料配方见表 1,其中常 用的为玉米饲料。

表1
类 原 料 水(毫升) 琼脂(克) 蔗糖(克) 香蕉浆(克) 玉米粉(克) 米粉(克) 麸皮(克) 酵母粉(克) 丙酸(毫升) 型 玉米饲料 150 1.5 13 - 17 - - 1.4 1

果蝇饲料配制表
米粉饲料 100 2 10 - - 8 8 1.4 1 17 香蕉饲料 50 1.6 - 50 - - - 1.4 0.5~1

下面以玉米饲料为例,说明果蝇培养基的配制方法。 按配方将琼脂破碎放入约为总量 2/3 的水中煮溶, 加入蔗糖搅拌溶解煮沸, 将玉米粉同余下的 1/3 水调成糊状倾入正在煮沸的琼脂—蔗糖液中并不断搅拌,煮沸几分钟直到成粘稠均匀的糊状为 止。然后加入丙酸和酵母搅匀分装到已经灭菌的培养瓶中,每瓶 1~2 cm 厚即可。装饲料瓶时应 注意避免饲料沾到瓶口和瓶壁上。待饲料冷却后,用酒精棉球擦干净饲料瓶内壁,再插入消毒后 的吸水纸(纵向折叠或卷成筒状插入,便于成虫栖息和幼虫化蛹) ,最后用灭菌的纱布棉塞好瓶口 备用。 当饲料瓶装好后,最好过 1~2 天再移进果蝇。在果蝇的饲养过程中应避免日光直晒,当瓶内 果蝇繁殖到相当数量后,或饲料发霉干枯时应及时将果蝇转移。对于留种的果蝇原种可放在 10~ 15℃条件下培养,使生活周期加长,减少转移次数,并且注意防止混杂。 2.果蝇的生活周期观察 果蝇的一生经过卵一幼虫一蛹一成虫四个阶段。 生活周期的长短受温度影响很大, 一般以 20~ 25℃为适宜。当温度低于 10℃时,生活周期延长,而且生活力明显下降。温度高于 30℃时则引起 不育和死亡。 生活周期与饲养温度的关系可见表 2。

表2
温 时 期 卵-幼虫 幼虫-成虫 57 天 度 10℃

果蝇生活周期时间表
15℃ 20℃ 8天 18 天 6.3 天 25℃ 5天 4.2 天

在 25℃条件下,果蝇各发育阶段所需时间大致是: 羽化成虫 12 小时后交配,2 天产卵(培养基表层) 天一龄幼虫,1 天二龄幼虫,1 天三龄 ,1 幼虫,3 天化蛹(贴在瓶壁上) ,3~4 天成虫(成虫可活 15 天左右,低温时可活一个月左右) 。 3.形态观察 (1)转移和麻醉 为便于细致地观察或鉴别并为以后的自交实验打基础,需要将果蝇进行麻醉处理。麻醉时可 使用专用的麻醉瓶(注意不可直接在培养瓶内麻醉) ,也可以用适当大小的广口瓶代替,用纱布包 裹棉团作塞子。 转移时,先取下麻醉瓶塞,然后取过培养瓶,轻拍瓶壁,使果蝇落在培养瓶底部,用右手两 指取下培养瓶的棉塞(夹在指间不要放下) ,迅速把麻醉瓶口同培养瓶口严密对接。用左手握紧两 瓶接口翻倒过来,使培养瓶在上,麻醉瓶在下,右手轻拍培养瓶将果蝇震落麻醉瓶内,迅速盖好 两个瓶塞。也可以使培养瓶在下,麻醉瓶在上,去塞对接瓶口后用黑纸遮住培养瓶,使果蝇因趋 光而移入麻醉瓶,当达到一定数量后迅速将两瓶口盖好。 当果蝇进入麻醉瓶后,轻拍瓶壁并迅速取下瓶塞,在瓶塞上滴 3~5 滴乙醚(注意乙醚不要直 接滴到瓶内) ,然后迅速塞紧瓶口。在经过大约半分钟果蝇便被麻醉。果蝇被麻醉后,可将其倾倒 在用酒精擦过的白瓷板上进行观察鉴别。观察过程中如果发现果蝇开始苏醒,可用一张吸水纸滴 加几滴乙醚放在培养皿内,然后将培养皿盖住,果蝇将再次被麻醉。如果观察的果蝇还要继续培
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养利用,应注意不要将其麻醉过度,如果蝇翅外展同身体呈 45°角则表明已麻醉致死。麻醉观察 后的果蝇如再培养可先将培养瓶平放桌上,取下瓶塞,在果蝇苏醒前用粗头毛笔将其转移进瓶内。 应注意可先将果蝇放在倾倒的瓶壁上,然后塞好瓶口待其苏醒后再将培养瓶竖起(防止果蝇粘在 培养基上导致死亡) 。 (2)性别鉴定:成虫的雌雄鉴别很明显,可以用放大镜或直接进行观察鉴别。它们的主要特 点如表 3 所列。

表3
观察性状 体型 腹部性状 腹部背面 腹部腹面 第一对前足 雌蝇 较大

雌雄果蝇性状比较表
雄蝇 较小 似圆筒状,末端钝圆 3 条黑色条纹,前两条细,后一条宽而延伸至腹 面,呈一明显的黑斑 4 个腹片 有性梳

似椭圆形,较膨大,末端尖 5 条黑色条纹 6 个腹片 无性梳

一般只需用肉眼对体型和上述腹部的三个特点进行观察,就可以把雌雄区别开。但是对刚羽 化出的成虫或个别难以区别的成虫有时必须用解剖镜观察性梳的有无。所谓性梳(Sexcombs)是 指雄性果蝇第一对足的跗节基部的一撮黑色鬃毛状物。 雌、雄果蝇的外部形态及雄蝇的性梳见图 1、图 2。

图 1 雌(右)雄(左)果型外部形态

图 2 雄性果蝇性梳 左:雄性果蝇左前足 中:雄果蝇左前足跗节基部的性梳 右:雌果蝇左前足跗节基部无性梳 1.基节 2.转节 3.腿节 4.胫节 5.跗节

(3)几种常见突变型的观察:实验用的突变果蝇常见类型及其形态特征见表 7。

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表4
名 白眼(White) 棒眼(Bar) 黑檀体(Ebony) 黑体(Black) 黄体(Yellow) 残翅(Vestigial) 焦毛(Singed) 称

果蝇常见类型及其形态特征
性状特征 复眼白色 复眼横条形,小眼数少 身体呈乌木色,黑 体黑色比黑檀体深 全身呈浅橙黄色 翅明显退化,部分残留,不能飞 刚毛卷曲如烧焦状

基因符号 w B e b y vg sn

四、思考和作业题
1.配制果蝇培养基时有哪些需要注意的问题? 2.果蝇的性梳有何作用? 3.绘制雄果蝇性梳。 4.比较雌、雄果蝇的区别。

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实验八 辐射对植物染色体的诱变作用
一、实验目的
通过对植物的辐射,了解物理因素对遗传物质的诱变作用。

二、实验原理
物理射 线的电离辐射,具有非常短的波长以及相应的较大频率,其穿透力很大,在空气中γ -射线,射程可达几百米,速度为 30 万公里/秒。因此,对植物给予一定剂量的照射,很容易引起 基因突变和染色体畸变,常见的有染色体粘着,着丝点区域断裂,破坏纺锤丝形成,染色体或染 色单体的断裂等细胞学现象。可通过细胞分裂观察到这种现象。 在实际工作中,选择合适的剂量是很重要的。一般要求尽量减少对植物的生理损伤,提高遗 传方面的效应,以有效地选择优良的变异类型和个体。

三、实验材料和实验用品
1.材料:圆葱、大蒜、 。 用品:显微镜、恒温箱、冰箱、水浴锅、分析天平、剪子、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、 滤纸、量筒、培养皿、烧杯、滴瓶、酒精灯、切片盒、标签等。多媒体系统(附显微演示) 。 2.药品:无水乙醇、95%乙醇、冰醋酸、蒸馏水、碱性品红、苏木精、秋水仙素、饱和对二 氯苯溶液、0.002mol/L 8-羟基喹啉、1mol/L 盐酸、4%铁矾水溶液、2%醋酸洋红染色液、2.5%纤 维素酶和 2.5%果胶酶混合液。

四、实验内容和实验步骤
1.处理和发根:将园葱、大蒜鳞茎分别用 1000 伦琴、2000 伦琴、3000 伦琴处理。 处理后的园葱置于盛清水的小烧杯口上,使根茎部与水接触,或将圆葱半埋于湿沙内。在 20~ 25℃光照条件下培养 2~3 天,待根长 1~2cm 时,选健壮根自尖端约 1cm 处剪下备预处理用。处 理后的大蒜瓣去皮,用细铁丝串起放在盛水的培养皿内培养,其它要求同上。剪取根尖的时间以 上午 10 时左右为好。 2.预处理:为了阻止纺锤体的活动,获得更多的中期分裂相,使染色体缩短,便于染色体分 散和计数,对根尖需进行预处理。如果只是为了观察有丝分裂各期染色体动态,可以不进行预处 理。预处理的方法有冰冻法和药物法两种。 (1)冰冻预处理:将根尖浸泡在蒸馏水中,置于 1~4℃冰箱内或盛有冰块的保温瓶中冰冻 24 小时。这种方法对染色体无破坏作用,染色体缩短均匀,效果良好,简便易行,各种作物都适 用。 (2)药物预处理:常用的药物有 0.05~0.2%秋水仙素溶液、饱和对二氯苯溶液、0.002mol/L 8 -羟基喹啉等。预处理时,将根尖直接浸泡在药液中,在适宜的温度下处理一定的时间(实验 3) 。 这些药物的作用能使染色体缩短变粗,便于对染色体的观察。 3.固定或前低渗:为保持染色体的固有形态和结构,预处理后的根尖用蒸馏水冲洗两次(约
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5 分钟)后要进行及时固定。固定液采用卡诺氏固定液,用无水酒精:冰醋酸=3:1, 或用 95% 乙 醇代替无水乙醇。固定液要现配现用。固定 20~24 小时后即可进行观察。如果需要长期保存,可 先用 70%酒精冲洗 2 次然后转入 70%酒精中保存。 4.解离:解离的方法有: (1) 将根尖用蒸馏水冲洗 2 次, 然后放入已经在 60℃水浴锅中预热的 1mol/L 盐酸中。 60℃ 在 恒温条件下处理 10~15 分钟,当根尖透明呈米黄色时取出。 (2)将根尖置于 95%酒精和浓盐酸的等量混合液中处理 2~10 分钟。或将根尖放在 5ol/L 盐 酸内处理 5~10 分钟。 5.后低渗:将解离后的根尖放在蒸馏水中冲洗 2~3 次(约 10 分钟) ,放入 70%酒精中备用。 6.染色与压片:染色与压片的方法有以下几种: (1)醋酸洋红染色法:取一根尖放在吸水纸上吸去多余的保存液,然后放在一张干净的载玻 片中央。用刀片将根尖分生组织切下,将其切成薄片(越薄越好) ,滴 1 滴 2% 醋酸洋红染色液, 盖上盖玻片,进行压片。压片时用一手固定盖玻片,另一手用镊尖或解剖针柄轻敲盖玻片,使材 料溃散。用火轻烤载玻片背面,然后继续轻敲,待材料呈云雾状即可镜检。加热的目的是使染色 体充分染色和软化,以及破坏细胞质的染色。如发现有较理想的分裂相,可再轻烤一下片子,然 后在盖玻片上盖一张吸水纸,用大拇指用力压片(不可使盖玻片移动) ,然后镜检。 也可以采用十字交叉压片法。即:取根尖放在吸水纸上吸去多余的保存液,然后放在干净的 载玻片中央。用刀片将分生组织切下,将其切成薄片。取另一张干净的载玻片,呈十字形交叉盖 在放有材料的载玻片上。在载玻片上盖一张吸水纸,并用大拇指压片,使材料压成一薄层。然后 将两载玻片分开,各滴加 1 滴染色液进行染色。稍停片刻后加上盖玻片,在酒精灯上轻烤一下片 子,一手固定盖玻片,另一手用铅笔橡皮头对准材料轻轻敲打,使根尖细胞分散均匀。 (2)改良卡宝品红染色压片法:将根尖置于干净的载玻片中央,切下根尖分生组织,将其切 成薄片,滴一滴改良卡宝品红染色液,盖上盖玻片压片。 。 (3)铁矾苏木精染色压片法:先将根尖放入 4%铁矾水溶液中媒染 2~4 小时。然后流水冲洗 20 分钟,再将根尖放入 0.5%苏木精染液中避光染色 40~120 分钟,取出后放入蒸馏水中备用。其 制片方法,取一染色后的根尖放在干净载玻片的中央。用刀片将根尖分生组织切下,将其切成薄 片(越薄越好) ,滴 1 滴 45%冰醋酸,加盖玻片,具体压片方法同上。 7.镜检:压好的片子先在低倍镜下镜检,找到分裂细胞后转换高倍镜观察。如果染色体分散 较好,图象清晰,绘出镜下畸变染色体的染色体类型并计数。

五、思考和作业题
1. 不同剂量射线处理的材料其染色体畸变率的变化如何?为什么? 2. 解离的目的是什么?固定液的作用是什么? 3. 制作两张具有不同热染色体畸变类型的玻片。 4. 绘出在显微镜下观察到的各类染色体畸变类型的图象。

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实验九 植物 DNA 的提取与定量分析

一、实验原理
幼嫩组织的细胞处于旺盛的分裂阶段,细胞核较大而细胞质较少,核酸浓度高,且内含物少, 次生代谢产物少,蛋白质及多糖类物质相对较少,在 SDS 或 CTAB 物质存在时,经机械研磨,使 细胞破裂释放出内含物,提取的 DNA、RNA 的产量高,纯度好。 提取 DNA 所用的提取液、吸头、离心管等需要高压灭菌以灭活 Dnase。 DNA 定量分析可采用紫外光谱分析法。原理是 DNA 分子在 260nm 处有特异的紫外吸收峰, 且吸收强度与 DNA 的浓度成正比。此外,还可以通过琼脂糖凝胶电泳上显示的 DNA 带的亮度来 分析,因为 EB 作为一种荧光染料,能插入 DNA 的碱基对平面之间而结合于其上,在紫外光的激 发下产生荧光,DNA 分子上 EB 的量与 DNA 分子的长度和数量成正比。在电泳时加入已知浓度 的 DNA Marker 作为 DNA 相对分子质量及浓度的参考, 样品 DNA 的荧光强度就可以大致表示 DNA 量的多少。这种方法的优点是简便易行,可结合琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 样品的完整性来进行, 缺点是不太准确。

二、实验材料和实验用品
植物幼嫩组织(如幼叶、花器、幼根等) 。 离心机、离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液 氮罐、电子天平、pH 计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩、电泳仪及电泳槽。 CTAB 提取液:2%CTAB(m/V), 100mmol/L Tris-HCl pH8.0, 20mmol/L EDTA pH8.0, 1.4mol/L NaCl, 2% PVP(灭菌后加入 2% PVP, 使之充分溶解)。在研磨植物幼嫩组织前加入 1%(V/V)β-巯基 乙醇。 TE(pH8.0):称取 1.211 g Tris, 0.372 g EDTA-Na2, 先用 800 mL 蒸馏水加热搅拌溶解,用盐酸 调 pH8.0,再用蒸馏水定容至 1000 mL。高压灭菌 20 min。 氯仿/异戊醇(24:1, V/V): 将氯仿和异戊醇按体积 24:1 的比例混匀,置棕色瓶中,4℃保存。 酚/氯仿/异戊醇(25:24:1): 按饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为 25:24:1 比例混匀,置棕色瓶 中,4℃保存。 10 mg/L 的 EB 贮存液:在 100 mL 蒸馏水中加入 1g EB, 在磁力搅拌器上搅拌数小时,使其 完全溶解, 转至棕色瓶中避光 4℃保存。 是强诱变剂, EB 称量时要戴手套和口罩。 一旦接触了 EB, 立即用大量水冲洗。 1X TAE 电泳缓冲液: TAE 浓缩贮存液含 Tris 碱 242 g, 50X 冰醋酸 57.1 mL, pH8.0 的 0.5 mol/L
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EDTA 100mL, 加 600 mL 蒸馏水,在磁力搅拌器上搅拌,最后加蒸馏水定容至 1000 mL。 6X 凝胶加样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青 FF,40%(m/V)蔗糖水溶液,4℃保存。 3M NaAc(pH5.2)

三、实验内容和实验步骤
1.提取 DNA (1)提取 DNA 所用的提取液、吸头、离心管等需要在高压灭菌锅中 121℃(约 1.1 kg/cm2) 高压灭菌 20 min。 (2) 用液氮将 50mg 幼嫩叶片研磨成细粉, 置于 1.5ml 离心管中加入预热至 65℃的 600μl 的 CTAB 提取液,轻摇混匀。 (3)65℃水浴 1 小时,其间轻摇混匀。 (4)12000rpm 离心 10min,取上清转移至另一 1.5ml 离心管中。 (5)向上清液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1) ,轻轻混匀 10min,然后 12000rpm 离心 10min,再转移上清入新管。 (6) 向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇 (24: , 1) 轻轻混匀 10min, 然后 12000rpm 离心 10min, 再转移上清入新管。 (7)向上清液中加 1/10 体积的 3M NaAC (pH5.2),等体积的冷异丙醇,小心混匀。12000rpm 离心 10min,弃上清。 (8)用 70%乙醇洗涤沉淀一次,12000rpm 离心,弃上清。 (10)将沉淀在超净工作台上吹干,加 50μl TE (pH8.0)室温溶解。 电泳检测或用紫外分光光度计检测 DNA 的浓度和质量。 2.浓度测定 (1)琼脂糖电泳法检测 DNA 根据上样管的数量和电泳槽的大小估算琼脂糖胶的体积,称取琼脂糖干粉用 1xTAE 缓冲液配 制 1%的琼脂糖凝胶,配制时在电炉上加热使琼脂糖充分溶解,待温度降至 60℃,加入 EB, 使 EB 的终质量浓度为 1 μg/mL,摇匀,倒入带有梳子的胶床中,避免产生气泡,室温下约 30 min,胶 自然凝固。 把琼脂糖胶放入电泳槽中,倒入 1X TAE 电泳缓冲液使液面高出胶面约 0.5 cm。 移液器插上 10μl 吸头,吸入 DNA 样品和上样缓冲液的混合液后,尖端插入加样孔底部,缓 慢把 DNA 样品加入到加样孔中。 加样完毕后,正确连接电泳槽和电源,黑线接阴极。红线接阳极,打开电源,正确设定电压 及时间,时间的选择取决于胶的长度和电压大小。一般不高于 5 V/cm 的电压,电泳约 2 h,待溴 酚蓝离胶边约 1-1.5cm 时停止电泳。
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小心取出凝胶,置于紫外透射仪上,紫外灯下检测扩增片段的有无及分离情况,在凝胶成像 仪上照相。 用λDNA 做相对分子质量大小的 Marker,如果带型不弥散,在与 Marker 20kb 的带的相应位 置出现整齐明亮的条带,说明基因组 DNA 完整,没有降解。 (2)紫外分光光度法测定 DNA 的浓度 取少量待测的 DNA 样品,用 TE 或蒸馏水稀释 50 倍(或 100 倍) 。 用稀释液做空白,在 260 nm、180 nm 、310 nm 处调节紫外分光光度计的读数至零。 加入待测 DNA 样品在上述 3 个波长处读取 OD 值。 纯 DNA 样品的 OD260/OD280 值大约为 1.8,高于 1.8 有可能有 RNA 污染,低于 1.8 有蛋白质 污染;

四、实验结果和计算
根据 OD 值计算 DNA 浓度或纯度: [SSDNA]=33 X (OD260 - OD310 )X 稀释倍数 [dSDNA]=50 X (OD260 - OD310 )X 稀释倍数

注意事项:
轻轻操作 DNA 溶液和快速冷冻植物组织对减轻机械剪切力和核酸酶切非常重要,不要振荡。 EB 为强诱变剂,酚、氯仿、CTAB 具腐蚀性或毒性,使用含有上述药品的溶液时,必须戴手 套,盛有酚和氯仿的离心管要集中处理或丢弃。

五、思考题
1.提取 DNA 之前为什么要先进行高压灭菌? 2.提取 DNA 的步骤主要有哪些?需要注意哪些问题? 3.如何检测、评价提取的样品的纯度? 4.如何确定 DNA 的浓度?

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实验十 植物的 RAPD 分析
一、实验原理
RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA)意为随机扩增多态性 DNA,是利用 PCR 技术进 行随机扩增, 把扩增的 DNA 片段进行琼脂糖凝胶电泳, 根据 DNA 条带的多态性来反映模板 DNA 序列上的多态性。RAPD 分析只需要一个引物,其长度一般为 10 个核苷酸,其序列是随机的,引 物已商品化。 是研究植物系谱关系、起源和进化、遗传多样性及分子标记辅助育种的简单易行的方法;此 外,外源基因转化后,转基因植株与非转基因植株相比,外源基因插入的部位导致基因组 DNA 序 列不同或重排,当引物适宜时,扩增条带的长短就会不同,RAPD 技术可以检测出对照植株和转 化植株 PCR 产物带型的区别。

二、实验材料和实验用具
植物基因组 DNA。 PCR 仪、1μl、10μl、20μl、100μl 微量移液器及吸头、PCR 管(200μl 或 500μl)及管架、 1.5 mL 离心管及管架、离心机、记号笔、磁力搅拌器、电泳仪、电泳槽、电炉、三角瓶、紫外透 射仪及凝胶成像系统。 10 核苷酸引物。 DNTP. 琼脂糖。 耐热 DNA 聚合酶(Taq DNA 聚合酶,附带 10X PCR Buffer 和 10 mg/mL MgCl2) 。 10 mg/mL 的 EB 贮存液:在 100 mL 蒸馏水中加入 1g EB, 在磁力搅拌器上搅拌数小时,使其 完全溶解, 转至棕色瓶中避光 4℃保存。 是强诱变剂, EB 称量时要戴手套和口罩。 一旦接触了 EB, 立即用大量水冲洗。 1X TAE 电泳缓冲液: TAE 浓缩贮存液含 Tris 碱 242 g, 50X 冰醋酸 57.1 mL, pH8.0 的 0.5 mol/L EDTA 100mL, 加 600 mL 蒸馏水,在磁力搅拌器上搅拌,最后加蒸馏水定容至 1000 mL。 6X 凝胶加样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青 FF,40%(m/V)蔗糖水溶液,4℃保存。

三、实验内容和实验步骤
1.实验所用的提取液、吸头、离心管等需要在高压灭菌锅中 121℃(约 1.1 kg/cm2)高压灭菌 20 min。 2.PCR 反应物的混合 所用反应体系为:25μl 反应体系中, 10 X PCR Buffer 2.5μl, 2.0 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L dNTP, 引物 0.1μmol/L, Taq DNA 酶 1.5 U, 各品种 DNA 模板浓度为 20~50 ng, 加蒸馏水 (ddH2O) 补充到 25μl。 按照反应体系,先在 1.5 mL 离心管中冰浴混合除模板外的各成分,充分混匀,稍离心,分装 到各 PCR 管中,然后把各品种的基因组 DNA 分别加入到各管中,盖严管盖,做标记,放入 PCR
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仪中。 3.PCR 扩增 在 PCR 扩增仪中进行,所用程序为:94℃预变性 4 min, 94℃变性 30 s, 36℃退火 30 s, 72℃ 2 min, 44 个循环后 72℃延伸 10 min。反应结束后, 取出离心管, 向离心管中加上样缓冲液,备电泳。 4.电泳 根据上样管的数量和电泳槽的大小估算琼脂糖胶的体积,称取琼脂糖干粉用 1xTAE 缓冲液配 制 1%的琼脂糖凝胶,配制时在电炉上加热使琼脂糖充分溶解,待温度降至 60℃,加入 EB, 使 EB 的终质量浓度为 1 μg/mL,摇匀,倒入带有梳子的胶床中,避免产生气泡,室温下约 30 min,胶 自然凝固。 把琼脂糖胶放入电泳槽中,倒入 1X TAE 电泳缓冲液使液面高出胶面约 0.5 cm。 移液器插上 10μl 吸头,吸入 DNA 样品和上样缓冲液的混合液后,尖端插入加样孔底部,缓 慢把 DNA 样品加入到加样孔中。 加样完毕后,正确连接电泳槽和电源,黑线接阴极。红线接阳极,打开电源,正确设定电压 及时间,时间的选择取决于胶的长度和电压大小。一般不高于 5 V/cm 的电压,电泳约 2 h,待溴 酚蓝离胶边约 1-1.5cm 时停止电泳。 5.检测和照相 小心取出凝胶,置于紫外透射仪上,紫外灯下检测扩增片段的有无及分离情况,在凝胶成像 仪上照相,图片保存于计算机中,待分析。

四、实验结果计算及条带分析
把 RAPD 每个反应重复两次。以两次重复中稳定出现的亮带作为统计对象,有电泳带记为 1, 无电泳带记为 0,录入计算机 Excel 表格中。利用 STATISTIC 软件,采用 UPGMA 方法(非加权 类平均法:Unweighted Pair Group Method using Arithmetric Averages)对所用品种进行聚类分析。S 为两样品间的遗传相似度,D 为遗传距离,S=2NXY/(NX+NY), D=1-S, NXY 为两个样品共有的 RAPD 标记数,NX、NY 分别为 X 样品和 Y 样品分别具有的 RAPD 标记数。

注意事项:
1.EB 为强诱变剂,使用时,必须戴手套。 2. 在进行大量扩增前需要对该品种确定扩增的优化体系, 尤其是没有文献报道过的植物种类, 如镁离子浓度、TaqDNA 聚合酶的用量、退火温度等,通过检测扩增带的稳定性和亮度来确定优 化的反应体系。 3.对电泳结果中弱带的取舍主要看其重复出现的几率,可进行重复实验。

五、思考题
1.RAPD 分析的基本原理是什么?主要有哪些应用? 2.对于一种植物材料,进行 RAPD 分析的主要步骤有哪些?

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