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藏鸡生长激素基因SNP多态检测及其与产蛋性状的关联分析


? 遗传育种与繁殖 ?

当代畜牧

2006 年第 6 期

藏鸡生长激素基因 S NP 多态检测 及其与产蛋性状的关联分析
张会刚
中图分类号: S831.2 摘要

山东省淄博市沂源县畜牧局 ( 256100)
文献标识码: B 文章编号: 1002-2996-(2006)06-0024-03

以藏鸡为材料检测了生长激素基因第 4 内含子 PCR-SacI-

影响的孙宪如、 卢一凡等指出, 由马立克攻毒试验, 说明基因型对 T 淋巴细胞活性有明显影响。这就构 建出了 GH 基因作用于 MD 抗病力上的方式和途径。 本研究选取藏鸡为材料, 对其 cGH 的第 4 内含 子进行 PCR-SacI-RFLP 的多态检测, 并与该群体的 产蛋量进行了关联分析, 为鸡的分子育种提供分子 标记。

RFLP 的多态,并分析了该位点与 32 周龄至 56 周龄的产蛋量的关 系。 结果发现, 在藏鸡中存在 AA 和 AB 两种基因型, 不同基因型间的 产蛋数存在显著差异, 型的产蛋量明显高于 AA 型的。 AB

关键词

藏鸡

GH 基因

产蛋数

PCR-RFLP

鸡生长激素(Chicken Growth Hormone, cGH ) 基因位于 1 号染色体的长臂末端 lq4 区域, 全长约 4 kb, 5 个外显子和 4 个内含子组成。 由 其表达产物 是垂体前叶合成与分泌的一种由 190 个氨基酸组 成的多肽类激素,是鸡体内重要的内分泌激素, 调 控整个机体, 对鸡的生长发育、 脂肪沉积、 产蛋量和 抗病力都有影响。 Lamb 等 1988 年首先报道, 基因的 cDNA 应 cGH 由编码 25 个氨基酸的末端前体片段和编码 191 个 氨基酸的成熟脱辅蛋白片段构成。 Tanaka 等完成了 cGH 基因全序列的测定,发现它由 5 个外显子和 4 个内含子组成, 内含子远远大于外显子。 Fotouhi 等 在肉鸡上找到 3 个 MspI 多态性位点和 1 个 SacI 多态性位点,发现对腹脂的选择影响了基因频率; Kuhnlein 等验证了上述结果, 并发现抗病性选择影 响了基因频率。李宁等也测定了肉鸡 cGH 的 cDNA 核苷酸序列, 发现与 Lamb 等报道的序列高度同源。 李宁等的研究表明,cGH 基因的 5’侧翼区高度保 守,他们推测 cGH 基因的表达可能受到内含子或 3’ 端侧翼序列的影响。 May 等报道, 基因与鸡马立克氏病和禽白血 cGH 病的抗性等都有关。 马立克氏病(Marek disease MD) 是由疱疹病毒引起的一种淋巴组织增生性疾病, 也 是唯一可用疫苗免疫来防治的病毒诱导的肿瘤性 疾病,一直也是遗传抗性研究的主要疾病。Bulow (1984)指出, 在抗马立克氏病上, 机体主要有两种 21 形式, 其一是 B , 其二就是 T 淋巴细胞, 而后者起着 主导作用。 Jahn 等(1985)研究 4 个品系及其杂交一 代对马立克病的抗性, 发现杂交一代比父母代有较 高的抗性。国内较早深入研究 GH 与抗病力的关联
? 24 ?


1.1

材料与方法
材料

藏鸡血样采自西藏农牧学院鸡场。采用苯酚 - 氯仿抽提法提取基因组 DNA, 溶解后, TE -20℃保存, 备用。 1.2 试验方法 1.2.1 目的基因的 P CR 扩增 1.2.1.1 引物的设计及合成 根据已发表的 cGH 基因的碱基序列, 设计引物。 正向引物: -ACC TGG AAG AAG GGA TCC AAG-3’ 5’ 反向引物: -GGC CGT CGT GGA GCT GTG AGC-3’ 5’ 1.2.1.2 实际最佳退火温度的确定 依据 Tm 值计算公式: G+C) ( A+T) 得到 ( 4 +2 , Tm PL) ( =57.6℃, PR) Tm ( =65.4℃。 结合引物设计给定 Tm 值, 进行梯度 PCR 试验, 根据梯度 PCR 的结果筛选实际的 Tm 值 66.0℃。 1.2.1.3 P CR 反应体系 PCR 反应体系中各成分:引物、 dNTP、 Taq DNA 聚合酶、 Buffer 内含 Mg 离子和模板 DNA) 各成分 ( , 见表 1。 1.2.1.4 P CR 扩增程序 预变性: 94℃ 5 min; 35 个循环: 94℃变性 30 s, 66℃退火 30 s, 72℃ 延伸 40 s; 最后 72℃, 延伸 5 min。 1.2.1.5 P CR 产物的检验和试验结果的记录 a.将 2%琼脂糖凝胶胶板放入电泳槽, 保证 1×

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2006 年第 6 期
表1

? 遗传育种与繁殖 ?
2.2 P CR- S a cI- RFLP 结果 PCR 扩增产物,经 SacI 限制性内切酶酶切, 2% 琼脂糖凝胶电泳判定存在两种基因型: 显示两条带 ( 600 bp, bp) 的杂合型基因 GHAB,显示一条带 400 酶切结果见图( 图 2 ( 1 000 bp) 的纯合型基因 GHAA。 AB AA 2 中 1 道为 GH 型, 3 道为 GH 型) 2, 。
M 1 2 3

P CR 反应各组分比例
体积 μ ( L) 14.7 2.0 0.6 0.6 0.3 0.3 1.5 20 0.3 μ mol/L 0.3 μ mol/L 150 μ mol/L 1.5U >50 ng 终浓度





ddH2O 10× Buffer(含 Mg2+) 引物 PR 引物 PL dNTP Taq DNA 聚合酶 模板 DNA 总体积

TAE 电泳缓冲液稍许超出胶面。 b. 用枪(微量移液器)取 5 μ 的 PCR 产物, L 加 1 μ 的 Loading Buffer,点入 2%的琼脂糖凝胶中 L ( 注意加样速度的同时也要注意保护胶版,不要将 样点飞或点漏) 另点入 2 μ 左右的 Marker 分子 , L ( 量标记—100 bp DNALadder) 标记。 c.接通电源, 恒压电泳。确定点样向阳极一侧 泳动。待溴酚蓝迁移到适当位置时停止电泳。 d.先关电源, 取出凝胶, 再在凝胶成像仪上检查 电泳结果, ( 对应编号, 记录 记录试验时间) 拍照。 、 1.2.2 P CR 产物的 S a cI 酶切 1.2.2.1 酶 切 的 步 骤 以 PCR 扩增产物为底物, 加入限制性核酸内切酶 SacI 及其缓冲液,放入 37℃恒温箱内酶切。 1.2.2.2 酶 切 体 系 总 体 系 10 μ 包 括 : 底 物 L ( PCR 扩增产物) 5.0 μ L,内切酶 SacI 1.0 μ , L 内 切酶 Buffer 2.0 μ L。 1.2.2.3 酶切的时间 酶切时间控制在 5 h 左右。
1 kb 600 bp 400 bp

图2

cGH 基因第 4 内含子 P CR- S a cI- RFLP 分析

M 表示标准分子量; GHAB; 3: AA 1: 2, GH 2.3
基因型统计分析结果

经 PCR-RFLP 分析了 210 个藏鸡样本的 cGH 基 因, 结果发现其中只有两种基因型, 杂合型 AB 型和 一种纯合型 AA 型。其中 AA 基因型共有 153 个, AB 基因型共有 57 个。其基因型频率分别为 0.729(AA 型)、 ( AB 型) 基因频率分别为 0.864 A 型) 0.271 , ( 和 0.136 B 型) ( 。
表2
品种 藏鸡 样本含量 210

基因频率和基因型频率分析
基因型频率 AA 0.729 AB 0.271 等位基因频率 A 0.864 B 0.136
2 χ

266.83

2.4

生产性状的关联分析


2.1

结果与分析
P CR 扩增结果的检测

从藏鸡血液细胞中提取 DNA,进行 cGH 基因第 4 内含子 PCR 扩增, 扩增产物长度为 1 000 bp。图 1 所示 3 个不同藏鸡的血液 DNA cGH 基因第 4 内含 子 PCR 扩增产物。 M 表示标准分子量; 2, 表示 PCR 扩增产物。 1, 3
M 1 2 3

在 210 个样本中, 拥有对应的 32 周龄至 56 周 龄产蛋量记录的共有 79 个样本, 其中 AA 型的有 55 个, 型的有 24 个。 AB
表3 鸡 GH 基因 SacI- RFLP 基因型与部分生产性状的关联分析
基因型 AA AB 样本含量 55 24 平均观测值 68.80± 1.50 72.33± 1.36 T 检验 t>t0.05 性状 产蛋数

关联分析结果表明, 和 AB 型基因差异显著 AA ( t> t0.05) AB 基因型鸡的产蛋量高于 AA 基因型。 ,


1 kb

讨论
关于 P CR- RFLP

3.1

图 1

cGH 基因第 4 内含子 P CR 结果

PCR-RFLP 是近年试验中主要的检测碱基突变 和 DNA 多态性的方法之一, 它主要有 3 个环节: ①靶 基因 PCR 扩增。②扩增的 DNA 片段限制性酶切图谱 ( 长度多态性) 。该技术应用 PCR 将目的基因片段
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扩增百万倍以上,即使被测样品核酸量小于 pg 水 平, 也能被扩增出来, 这不仅大大提高了基因分析 的灵敏度,而且无需标记或放射性探针杂交过程。 PCR-RFLP 主要用于核酸变异性分析与比较, DNA 当 或 RNA 分子由于单碱基突变或序列重排, 使某个酶 切位点增加, 减少或消失, 导致限制性酶切片段发 生改变, 就产生了限制性片段长度多态性。由于限 制性内切酶在 DNA 分子上有特异的酶切位点, 根据 其识别序列的位置和数量, 可以把大小相似而序列 有差异 DNA 片段分离而显出其长度多态性 片断的 ( 大小) 。PCR-RFLP 与其它方法相比, 具有经济实惠、 方法简单、 易于操作等优点。 3.2 关于 P CR 条件 PCR 扩增是基因检测的基础,所以 PCR 扩增的 实际操作显得非常重要。PCR 扩增的客观原理简单 明了, 在条件合适时便会得到非常有效的扩增。对 于 PCR 反应条件的优化, 笔者认为以下几个问题非 常重要: 引物浓度一般为 0.1~ μ 0.5 mol/L, 尽量避免高 浓度使用。引物浓度过高会增加错误启动延伸的数 量, 导致非特异扩增。但是引物的量太低又会直接 影响扩增效率。引物的退火温度影响着引物的效 率, 结合引物浓度和退火温度进行梯度测试, 最终 确定最佳的引物浓度和退火温度。 Mg 离 子 直 接 参 与 TaqDNA 聚 合 酶 活 性 发 挥 ( TaqDNA 聚合酶通过 Mg 离子介导与模板 DNA、 引物

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及 dNTP 结合) 。Mg 离子浓度的改变将直接影响引 物的退火、 模板与 PCR 产物的解链温度、 产物的特 异性、 引物二聚体的形成、 酶活性及特异性。通常进 行 PCR 扩增时, 离子浓度为 0.5~ m mol/L。Mg Mg 2.5 离子浓度过高将引起非特异扩增产物多及精度下 降; 反之, 过低则导致产量的降低。 3.3
关于酶切结果的检验

对于酶切结果的检测, 由于点样量较大(>10 μ L), 要确保胶板胶孔的均匀、 整齐; 点样要充分、 及时。 尽 量杜绝由于加样操作失误而影响整个试验结果。 3.4
关于关联分析

在本试验中, 对藏鸡群体样本 cGH 第 4 内含子 进行了 PCR-SacI-RFLPs 多态分析。确定存在 AA 和 AB 两种基因型,并对这两种基因型与生产性状进 行关联分析。 分析结果表明, 和 AB 型基因差异显 AA 著 t> t0.05) AB 基因型鸡的产蛋量高于 AA 基因型。 ( , 根据 Liu HC 等的试验,确定 cGH 第 4 内含子与 MD 抗性相关在 Liu HC 等的试验中,是以白来航商品 鸡作为样品, 检测分析了 cGH 与 MD 抗性相关。结合 本试验与生产性状的关联分析,可以初步确定 cGH 第 4 内含子不但与 MD 的抗性相关,同时也对产蛋 性能有着影响。 本试验中由于试验群体的有限, 由遗传漂变等 造成的误差很有可能会对结果产生影响。我们还要 考 虑 所 取 样 品 不 符 合 遗 传 平 衡 定 律 (Hardy- Weinberg Equilibrium)的原因。

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2005 年第 4 季度全国兽药抽检不合格产品目录( 一)
产品名称 / 商品名 生产批号 生产厂家 不合格项目 抽检单位

硫酸镁 安痛定注射液

20050321 新疆乌鲁木齐金牧实业有限公司 50118 陕西天喜药业有限公司

安乃近注射液 20050413 陕西省汉中市天汉制药厂 磺胺嘧啶钠注射液 / 磺胺嘧啶钠注 50112 陕西省汉中市天汉制药厂 射液 安痛定注射液 复方磺胺间甲氧嘧啶钠注射液 / 红 链弓效注射液 复方黄芪多糖 / 圆环净 烟酸诺氟沙星可溶性粉 / 氟哌酸 穿心莲注射液 / 高效畜宝康注射液 磺上磺 复方磺胺二甲嘧啶钠可溶性粉 / 球 虫粉 磺胺嘧啶钠注射液 盐酸环丙沙星可溶性粉 / 卵巢卵管 大肠杆菌必杀
? 26 ?

含量: 42.4%, 检查。 新疆兵团所 巴比妥含量 89.7%,安替比林含量 新疆所 82.3% 鉴别 宁夏所 PH 值,含量:29.7% 鉴别; 含量: 氨基比林 16.0%,巴比 妥 2.11% 无批准文号 产品剂型与质量标准不符 含量 68.4% 鉴别(1) 含量 556.8% 磺胺二甲嘧啶钠含量 166.4%, 性状 青海所 甘肃所 河南所 江西所 新疆所 贵州省所 新疆所 新疆所 新疆兵团所 宁夏所 山西所

50510

陕西省汉中市天汉兽药厂

20050101 广东瑞泰动物药业有限公司 20040401 20050628 20041023 50802 504262 湖南株洲市神龙动物药业有限公司 乌鲁木齐博恩绿色生物科技有限公司 四川鼎尖动物药业有限公司 广州白云山宝神动物保健品有限公司 广州拓普思动物药业有限公司

20050312 四川省资中润泽动物药业有限责任公司 鉴别, 性状。 20050726 西安爱丽丝畜牧有限公司 40301 西安爱丽丝畜牧有限公司 鉴别、 含量为标示量的 132.1% 含量 174.3%


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