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RNA干扰技术的原理与应用


RNA 干扰技术的原理与应用
 

RNA 干扰( RNAinterference , RNAi )是通过小干扰 RNA ( small

interference RNA, siRNA ) 造成目的 mRNA 特异性降解, 从而使基因 转录后沉默的一种现象。这一现象广泛存在于自然界, 是生物体进化 过程中抵御外来基因侵害的一种机制, 为稳定基因组发挥了重要作 用。由于 RNAi 可以作为一种简单、 有效的代替基因剔除的遗传工 具,正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命, 并将加快这个领域 的研究步伐。

1 RNAi 现象的发现及发展 1995 年, Guo 等用反义 RNA 阻断秀丽新小杆线虫的 part  1 基因 的实验中发现, 正义和反义 RNA 都阻断了该基因的表达,这与传统 上对反义 RNA 技术的解释相反。 1998 年 2 月卡耐基研究院的 F i re 等将双链 RNA ( double stranded RNA, ds RNA)转入细胞内,发现靶 基因的 mRNA 发生了降解,证实高度纯化的 ds RNA 可以高效特异 的阻断相应的基因表达,而且效率比单链 RNA 至少高 2 个数量级,首 次揭示了 Guo 等遇到的现象,即为 RNAi。 随后研究发现, RNAi 现象广泛存在于各种生物中,是一种古老 的重要保护机制, RNAi 技术作为一种重要的研究手段大大加速了基 因组学的研究进程,现已成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。 在短短几年中,对 RNAi 的研究取得了突飞猛进的发展, 许多令人 振奋的报道相继出现, 2001 年首次报道了在哺乳动物细胞培养中成功

应用 RNAi 技术抑制基因表达, 开创了 RNAi 技术应用于高等生物 基因功能研究的先河; 2002 年, K ay 研究小组首次报道了应用 RNAi 技术在哺乳动物整体水平进行基因表达沉默的实验研究;2004 年哺乳 动物全基因组范围 RNAi 研究也取得了重要进展,先后报道了用酶法 构建全基因组 siRNA 文库新技术和应用基因组 siRNA 文库,从全基 因组水平对高等动物基因功能进行高通量 RNAi 研究。 这些研究成果 愈来愈表明, 生物体基因转化的最终产物不仅仅是蛋白质,还包括相 当一部分 RNA。

2 RNAi 的作用机制 细胞中 ds RNA 的存在是 RNAi 形成的先决条件。ds RNA 可以 通过多种途径在细胞核或细胞质中产生。 通过对 RNAi 所进行的遗传 学和生物化学的研究,现已初步阐明了其作用机制。 RNAi 的作用机制 可分为三个阶段:起始阶段、 效应阶段和级联放大阶段。 起始阶段: 由 RNA 病毒入侵,转座子转录,基因组中反向重复序列转录等所产生 的 ds RNA 分子在细胞内被一双链 RNA 酶!型内切酶也叫 Dicer 酶 或 Dicer 核酸酶同源物剪成 21~ 23 nt siRNA, 3’ 端带有 2 个碱基突 出的黏性末端, 5’ 为磷酸基团,此结构对于 siRNA 行使其功能非常关 键。 剪切位点一般在 U 处, 具特异性。 效应阶段: RNAi 特异性的核酸 外切酶、 核酸内切酶、 解旋酶、 辅助识别同源序列蛋白和其他一 些蛋白与 siRNA 结 合 成 RNA 诱 导 沉 默 复 合 体 R I SC

( RNA inducing silence complex , R I SC)识别靶 mRNA,其中的反义

链与靶 mRNA 互补结合,正义链则被置换出来。继而, R I SC 复合物 中的 RNase(可能是 Dicer)在靶 mRNA 与 siRNA 结合区域的中间将 其切断。 级联放大: 在 RNA 依赖性 RNA 聚合酶的作用下,以 mRNA 为模板, siRNA 为引物,扩增产生足够数量的 dsRNA 作为底物提供给 Dicer 酶,产生更多的 siRNA, 从而使效应阶段反复发生,一个完整的 mRNA 被降解成多个 21~ 23 nt 的小片段, 从而导致相应的基因表达 沉默。在这一过程中的多个步骤都需要 ATP , 如 R I SC 复合体的形 成、 siRNA 与靶 mRNA 的配对、 靶 mRNA 的切割。 另外,在 dsRNA 复制过程中,两条链的分离可能也需要一个依赖 ATP 的 RNA 解旋 酶。 dsRNA 可通过细胞微管在细胞间传递, 实现 dsRNA 在整个个体 中的散布。RNAi 在植物、 线虫、果蝇等低等模式生物中,都可由 dsRNA 诱导,在哺乳动物细胞中, > 30 bp 的 dsRNA 会引起干扰素效 应和非特异性基因抑制, 导致 mRNA 非特异性降解,是医疗上应用 RNAi 的一大障碍,随后发现合成双链的只有 19~ 21 nt 的 siRNA 却可 以避免这种效应, 特异性发挥 RNAi 作用, 并发现在哺乳动物细胞中 转入双链 RNA ( dsRNA )后导致转录后基因沉默比用核酶或反义 RNA 更彻底、 更有效。E lbash i r 等通过瞬时转染体外合成的 21 nt 双链 siRNA 成功诱导出了哺乳动物细胞的 RNA , i 且避免了 ds RNA 引起的非特异性反应,这为 RNAi 技术在基因治疗领域的研究铺 平了道路。

3 RNAi 的作用特点 3 . 1 高特异性 RNAi 是转录后水平的基因沉默机制,有高度的序 列特异性, 19 nt 的 dsRNA 几乎可以完全抑制基因的表达,而其中的 1 n t 突变后, 它对基因的抑制作用就消失了, 这种高度的序列特异性能 够使 ds RNA 非常特异地诱导与之序列同源的 mRNA 降解, 避免降 解与目的 mRNA 同家族的其他 mRNA,从而实现对目的基因的精确 沉默。因此, RNAi 具有重大的医学价值。 3 . 2 高效性 RNAi 存在级联放大效应, 由于 Dicer 酶切产生的 siRNA 与同源 mRNA 的结合并降解后者,产生新的 siRNA;新产生 的 siRNA 可再次与 Dicer 酶形成 RISC 复合体,介导新一轮的同源 mRNA 降解的多次利用,如此循环,使相对很少量的 dsRNA 分子 (数 量远远少于内源 mRNA 的数量 )就能产生强烈的 RNAi 效应 (每个 细胞仅需几分子 siRNA 就可产生 RNAi 效应) ,并可达到缺失突变体 表型的程度。 相比普通的 siRNA, 具有短发卡结构的双链 RNA 产生 的 RNAi 效应更强。 3 . 3 高稳定性 ds RNA 可被细胞内的特异性核糖核酸酶家族成 员 Dicer 酶切割为 21~ 23 nt 的 siRNA。切割后的 siRNA 由于 3’端 悬垂 TT 或 UU 碱基, 化学性质稳定,使其不再需要进行任何的修饰 就能避免细胞内核酸酶类降解而较稳定的存在。 3 . 4 浓度时间依赖性  RNAi 效应存在时间、 浓度双重依赖性: 干扰效应常出现注射 ds RNA 的 6 h 后,在注入 ds RNA 的 2~ 3 d 后 的作用最强,可持续效应 72 h 以上; 而其干扰强度则随着浓度的增高

而增强。只有连续注入 ds RNA, 沉默效应才能持续下去, 否则将产 生短暂的沉默效应, 而且这种效应的强度与初始 dsRNA 的浓度有 关。另外, RNAi 还具有对靶 mRNA 的切割位点确定性高、 对细胞 调控系统无影响、 作用快速、 穿透性高及操作简便等优点。 3 . 5 可传播性 Fire 等观察到将 dsRNA 注射入线虫体内,这些 ds RNA 可以从注射处的细胞扩散到体内其他细胞, 引起其他细胞的基 因沉默, 表明了 RNAi 作用的可扩散性。 3 . 6 可遗传性 siRNA 介导的 RNAi 具有一定的可遗传性。Fi re 等将 dsRNA 注射入秀丽新线虫的性腺后,在其第 1 代中也诱导出了 同样的基因抑制现象, 即证明了它的遗传性。 3 . 7 靶基因位点的高选择性  外源性 dsRNA 的传入只对成熟 mRNA 产生作用,对 mRNA 前体没有或很少具有影响,以内含子或启 动子构成的外源 ds RNA 无法引起 RNAi 效应。 4 RNAi 的应用 4 . 1 基因功能的研究 人类已经进入后基因组时代, 需要大规模 高通量的研究基因的功能, RNAi 技术具有高效特异阻断基因的表达 等特征, 也就责无旁贷地成为研究基因功能的强大工具, 已有若干实 验室运用 RNAi 技术进行大规模的基因组筛选。 其基本原理就是针对 一基因组不同的部分设计对应的 ds RNA,构建 dsRNA 文库,分别导 入不同个体细胞内, 通过蛋白表达的改变来筛选基因并确定基因功 能。 有研究利用离体和活体 RNAi 方法来沉默根节线虫的编码一种保 守的 RKN (根节线虫)分泌肽基 16D10 ,并且证实这种寄生基因在根

节线虫的植物寄生过程中起到关键作用。目前, 哺乳动物中非特异性 RNAi 效应的克服和新型表达载体的问世,为哺乳动物基因功能的研 究提供了一种高效的途径, 其与基因芯片等技术结合,可高通量分析 各基因的功能。 4 . 2 基因表达调控 在基因组学的研究中, 基因表达调控是研究 基因功能的一个重要部分, 而基因功能缺失策略在基因表达调控中 具有特殊重要地位。RNAi 技术对于建立基因剔除动物模型具有相当 大的应用前景。 i m 等将 siRNA 运用于鼠卵母细胞和植入前胚胎中, K 利用针对内源性的 Oct3 /4 和 cmos 基因的 siRNA, 成功地清除了内 源性的 O ct3 /4 和 Mos 产物, 结果产生了与 Oct3 /4 和 cmos 基因剔 除相类似的表型,证明了 siRNA 对小鼠早期发育的分子生物学研究是 一个非常有用的工具。 Dubouzet 等在 2005 年报道了用 RNAi 技术抑 制黄连中异喹啉生物合成途径中金黄紫碱甲基转移酶基因,使该酶的 表达水平明显降低。A llen 等用 RNAi 技术一次性抑制罂粟中可待因 酮还原酶基因家族中所有基因的表达,结果也产生了预期的效果。 RNAi 转基因小鼠的出现,使得在哺乳动物整体水平研究基因的剔除 成为可能。 4 . 3 基因治疗  siRNA 的特异性有效保证了哺乳动物细胞中 RNAi 效应的特异性,结合已有的高效基因导入系统,使得 RNAi 在那 些由于基因表达异常增高而引起的疾病(如肿瘤、 病毒感染)中的作 用优于目前以抑制基因表达为目的而采用的反义技术和核酶等方法。 人们正在探索利用 siRNA 来治疗肿瘤、 病毒感染核免疫缺陷等重

大疾病, 并且取得了一定成果。Z immermann 等针对为猕猴的阿朴蛋 白 B 编码的基因施用 siRNA, 成功降低阿朴蛋白 B、 血清胆固醇和 低密度脂蛋白的水平。这是首次在非人类灵长类动物中有关 RNAi 的全身用药, 是 RNAi 在药物治疗方法上重要进展。 研究人员首次通 过利用 siRNA 能够有选择地抑制 PI 3K 路径的成分并抑制实验动物 中移植的人类结肠癌细胞的扩散。 RNAi 可以特异性的抑制基因表达, 所以可用于基因病, 病毒感染、 癌症的治疗。同一基因家族的多个 基因具有一段同源性很高的保守序列, 设计针对这一区段序列的 ds RNA 分子引发 RNAi,那么只注射一种 dsRNA 即可以产生多个基 因同时剔除的表现, 也可以同时注射多种 ds RNA 而将多个序列不相 关的基因同时剔除。Turner 等针对人类免疫缺陷病毒 1 基因组的 LTR ( long ter m i nal repeate , LTR )、v i f 和 nef 设计了 siRNA,将 siRNA 转染进人类免疫缺陷病毒后,这些基因的水平降低了 95 %。运 用 RNAi 方法对比观察了低氧诱导因子 1 和低氧诱导因子 2 ,均 有一定程度的调节血管生成基因的作用。 4 . 4 药物筛选 RNAi 还应用于鉴定药物靶位和筛选药物方面。 RNAi 的应用明显地缩短了从鉴定到认识药物靶基因功能的时间, 有 助于药物开发过程中对已知靶基因功能的高通量分析。利用 RNAi 技术使丘脑下部一种豚鼠相关肽的表达量减少了 50 %。豚鼠相关肽 使代谢率提高而不减少摄食量,从而减轻肥胖,为肥胖的治疗提供了一 个靶点。 5 结  语

虽然人们对 RNAi 的研究只有短短的十几年时间,但进展却极为迅 速。 可以认为 RNAi 是个以小分子 RNA 为中心的真核细胞基因表达 调控系统,它可以在多个层面调节基因表达和细胞的增殖分化,通过对 RNAi 的研究将会使人们对生命现象的认识更加深入。但 siRNA 技 术也存在一定的缺陷, 如对靶 mRNA 以外同源序列的非特异性抑制, 各种载体和 siRNA 本身所诱导的免疫反应。此外, 过量导入 siRNA 可能干扰细胞内其他正常 RNAi 介导途径,甚至诱导体内原癌基因异 常表达, 导致肿瘤发生。目前 siRNA 技术的疗效及安全性还有待于 进一步证实, 大多数研究工作仅限于基础领域,临床应用仅有少量报 道。有理由相信, 随着基因工程技术日臻完善, siRNA 技术将为基因 功能和基因治疗的研究开辟新的领域。

Small interfering RNA (siRNA):是一种小 RNA 分子(21-25 核苷酸),由 Dicer (RNAase Ⅲ家族中对双链 RNA 具有特异性的酶)加工而成。SiRNA 是 siRISC 的 主要成员,激发与之互补的目标 mRNA 的沉默。


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