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RNA干扰技术的应用新进展


2009 年 2 月 第 17 卷   1 期 第

中国实验动物学报
ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICA

February ,2009 Vol . 17   1 No.

综述? 进展

RNA 干扰技术的应用新进展
李曙芳 , 刘田福
( 山西医科大学实验动物中心 ,太原   030001)

   【摘要】 RNA 干扰 ( RNA interference , RNAi) 被发现十年来在生物研究领域已经得到了长足的发展 ,并且已经   初步显示出了巨大的潜力 。本文综述了介导 SiRNA 方法的研究及其在基础研究 、 疾病模型建立和药物研究中的最 新应用进展 。 【关键词】 RNA 干扰 ; 应用   【中图分类号】R349162    【文献标识码】    A 【文章编号】100524847 (2009) 0120076204 【 Key words】 RNAi ; Application  
LI Shu2fang , LIU Tian2fu

Recent Advances in the Application of RNA Interference Techniques
(Laboratory Animal Center of Shanxi Medical University , Taiyuan 030001 , China)

【Abstract】 RNA interference ( RNAi) has made considerable development in the biology research area during the ten years  
since it was discovered. It has been demonstrated its huge potential initially. This article summarizes the mediating methods of SiRNA and the newest application progress of RNAi in basic research , disease model building and medicinal research.

  上世纪 90 年代 , 科学家发现了由小的非编码 RNA 导致的基因沉默途径 , 该发现开创了生物科学 研究领域的新纪元 , 成为最广泛研究和应用的技术 之一 。RNA 干扰 ( RNA interference ,RNAi ) 的早期研 究集中于转录后水平 ,通过特异降解靶 mRNA ,阻断 靶基因的表达 。随着研究深入 , 发现 RNAi 的作用 是在转录水平 、 转录后水平 、 翻译水平等多个不同的 水平上实现的 。可能通过诱导靶基因的染色质结构 改变 ,使靶基因的转录受阻 ; 或者抑制靶 mRNA 的翻 [1 ] 译 ,使靶蛋白表达受阻 。RNAi 可高效特异地阻断 基因表达 ,在进化上保守 ,并广泛存在于生物界 。 近年来 ,研究者主要集中于利用模式生物 ( 如 秀丽阴杆线虫 、 果蝇等 ) 、 植物细胞和哺乳动物细胞 进行该机制的探讨研究 ,其中对由 27 个成员组成的 [2 ] argonaute 基因家族研究最多 。在其机制不断被 阐明的同时 , 许多科研及临床工作者也将 RNAi 作 为一种工具应用到很多方面 。
[ 作者简介 ]   李曙芳 (1983 - ) , 女 , 在读硕士研究生 。研究方 1631com

1  介导 SiRNA 方法的研究进展
   在哺乳动物细胞中 ,由小干扰 RNA ( siRNA) 介 导的 RNAi 能够启动特异基因序列沉默 , 它可以为 人类疾病治疗提供新的方法 。siRNA 通过 RNAi 可 以发挥抵抗病毒入侵 、 抑制转座子活动 、 防止自私基 因序列过量增殖等作用 , 但在将其应用于基因治疗 方面还存在问题 : 诸如脱靶效应和 siRNA 基因转 导
[3 ]

,将 siRNA 有效转运到靶组织仍然是该技术能

否用于 基 础 研 究 及 临 床 治 疗 的 主 要 障 碍 。为 使
siRNA 最大量的被转染入靶细胞 , 最有效地与靶基

因结合 ,研究者正在不断地改进各种转染方法 。目 前 siRNA 的转运主要通过非病毒载体和病毒载体两 种途径来介导 RNAi 。 最新 体 内 研 究 报 道 显 示 , 用 不 同 的 载 体 将

siRNA 介导的 RNAi 治疗方法在多种疾病模型动物

的治疗实验中体现出良好的治疗效果 , 并且被有效 地应用于体外和啮齿类动物传染性疾病的治疗中 , 而且在灵长类动物抗病毒治疗中也显示出其可行 性
[4 ]

向 : 人类疾病动物模型 。Tel : 035124135774 ; E2mail : lishufang821 @
[ 通讯作者 ]   刘田福 (1954 - ) , 男 , 硕士生导师 , 教授 。研究方



向 : 实验动物学 。Tel : 035124135305 ; E2mail : ykdltf @yahoo. com. cn

111   病毒载体介导

病毒载体凭借它转染效率高的优点 , 首先在基

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因载体领域中占有一席之地 , 但是在将它应用到研 究实践中存在安全性和免疫原性等问题 。研究用病 毒须经过改良 ,去除其病原性的同时保留其高效的 基因转染性 。近年研究成果显示 ,腺病毒 、 腺相关病 毒和慢病毒作为 siRNA 载体已经被较为成功地应用 于多种疾病的动物实验研究中 。
11111   腺病毒载体介导 : 腺病毒载体具有载体包装

病毒做载体的 siRNA ,从而使突变基因表达下调 ,导 致 SOD1 沉默
[10 ] [11 ]

, 进而防止神经退行性变和延长存

活期 。G odfrey

通过慢病毒载体转导 shRNA , 在体

内和体外实验中均能抑制病毒复制 , 从而抑制原发 性渗出性淋巴瘤 ( PEL ) 生长 , 为 RNAi 治疗病毒导 致的人类癌症提供思路 。Ren 通过慢病毒转导抗 腺苷激酶 (ADK) 的 miRNA ,使人间充质干细胞 ADK 移植后下调 ,可以使患者自体移植细胞相容性很好 。 病毒载体经过不断的改进 , 在非人类体外和体 内实验中达到较好的治疗效果 ,但由于其免疫原性 、 靶向性 、 种属特异性等潜在的危险性 ,对于能否将其 应用到人类疾病基因治疗中 , 仍然是不容忽视的重 要方面 。
112   非病毒载体介导
[12 ]

能力强 、 细胞毒性反应低等优点 ,成为近年来基因治 疗领 域 研 究 的 重 点 。目 前 , 利 用 腺 病 毒 载 体 将
[5 ]

siRNA 传递到组织细胞内以干扰相关疾病治疗靶基

因的表达已经取得了较好的效果 。Pan 等 将溶瘤

细胞的腺病毒作为载体 , 使 siRNA 到达过度表达的

致癌基因 ,在肿瘤微环境中发挥干扰作用 ,使病毒癌 细胞溶解 ,并且能将对正常细胞的损害降到最低 ,进 而产生抗肿瘤效果 。 Wang 构建包含抵抗热休克蛋 白247 ( HSP247) 的 siRNA 的腺病毒 , 将它导入创伤 动物模型 ,结果显示 HSP247 的表达在 mRNA 和蛋白 不断地发展改进 。 特性已被广泛应用 。Machida 以重组联合腺病毒 ( rAAV) 为载体 ,将 siRNA 转导到亨廷顿病 ( HD) 病
[7 ] [8 ] [6 ]

由于非病毒载体具有安全 、 易于大量制备和较

高的基因包裹能力等优点 , 近年研究者对其发展给 予更多的关注 。非病毒载体介导的 siRNA 在转导到 病变组织过程中不会引起免疫反应 , 这在靶向应用 药物的有效性上和 siRNA 的各种用法的许可上都有 很大的优势 。

质水平都受到抑制 ,抑制 I 型胶原和瘢痕组织形成 。 虽然目前的腺病毒载体具有许多优点 , 但还存在着 缺乏靶向性 、 治疗基因表达持续时间较短 、 外源基因 表达的可控性差等问题 , 因此腺病毒载体系统也需

11112   腺相关病毒载体介导 : 腺相关病毒具有可定

点整合 ,携带的外源基因长期持续稳定表达 ,并可调 控 ;人群感染率高 , 但无致病性 , 且免疫反应轻微等

11113   慢病毒载体介导 : 慢病毒作为一种特殊的逆

初发的模型小鼠的纹状体 , 相关的神经病理性损害 ( 如不溶蛋白积累 、 DAPRPP232 表达下调 ) 都得到了 改善 。 Chen 通过使用双链伴随腺病毒28 假模标本 载体 ( dsAAV2Π ) 来转运 shRNA 到 HBV 转基因小 8 中 HBV 蛋白 、 mRNA 、 复制型 DNA 抑制在一个稳定 水平 。 研究的热点 。近年来对其基础生物学特性 、 载体改 方面也卓有成效 。Raoul 对 SOD1 基因突变导致肌 萎缩侧索硬化症 (ALS) 的动物模型 ,脊椎注射以慢
[9 ]

鼠 ,结果表明该方法能长期有效地将该模型肝细胞

转录病毒 ,与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒 载体比较 ,具有高效整合 、 高效转录 、 高效表达和宿 主范围广的特点 , 因此它是真核系统基因转移的有 力工具 ,已成为当前基因治疗和转基因动物中载体 造及其应用等研究均取得了较大进展 , 在疾病治疗

猴 ,用于抵抗与 HCV 关系密切的 G 病毒 B ( G 2 B BV B) ,结果显示 G 2B 的表达下调程度与投药量呈剂 BV 量依赖关系 , 表明 RNAi 系统用药对灵长类抗病毒 的可行性
[14 ]

11211   脂质体介导 : 脂质体类似细胞结构 , 有生物

膜的特性和功能 ,它可与基因通过静电作用 、 磷脂分 研究表明 ,脂质体可与被转运的 siRNA 形成复合物 , 不但延长了 siRNA 的作用时间 ,起到长效作用 ,复合

子间的疏水作用及其他的引力和斥力形成复合物 。 使被包埋在脂质体中的 siRNA 在细胞中缓慢释放 , 物还可保护 siRNA 不被核酸酶降解 。Y okota 等通过 将阳离子脂质体包被的 siRNA ( CL2siRNA) 给予狨 。 体 。李伟等
[13 ]

11212   阳离子聚合物介导 : 阳离子聚合物与 siRNA

可以只靠静电作用形成复合物 , 可保护 siRNA 不被 核酸酶降解 。近年来 , 研究者通过对阳离子聚合物

的结构修饰来改变他的理化性质 、 提高转然效率 、 增 加稳定性和靶向释放 , 从而使其更适合作为基因载 研究表明 , 阳离子聚合物作为载体介

导的 RNAi 能够在内耳无损伤的表达 , 可能这种方 法在将来的基因治疗中 ,能使相关基因表达下调 。

11213   其他非病毒载体介导 : 除以上两种较为常用

的非病毒载体外 , 研究者不断尝试新的非病毒投药 系统用于研究中 。Honma
[14 ]

用胶原这种非病毒投药

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系统将 siRNA 转运到非人类灵长类癌症转移实验动 物体内 ,达到基因功能性屏蔽的效果 。

癌症基因和修饰基因的作用 、 评价常规癌症治疗和 新药 、 鉴定癌症肿瘤生长标记 、 分析肿瘤微环境对肿 瘤形成的影响 、 定义潜伏期 ,肿瘤发展分期等都优于 传统的转基因的疾病模型 。目前 ,乳腺 、 、 、 胰腺 肠 结 肠和前列腺癌症的基因工程小鼠模型已经构建出 来 ,而脑 、 、 卵巢 颈和皮肤癌症模型正处于研究的初 期阶段
[19 ]

2  RNAi 技术的应用
211   利用 RNAi 技术进行基础研究 21111   真核细胞基因功能的研究 : 随着基因测序技

术和生物信息学的不断发展 ,果蝇 、 、 、 线虫 水稻 小鼠


[20 ]

和人类基因组测序已经完成 , 而基因功能的研究步 伐却相对缓慢 。与传统的基因功能研究方法 ( 如基 特异 、 快捷和成本相对低廉的基因功能研究手段 ,与 基因芯片等高通量基因筛选技术相结合 , 它将在真 核细胞基因功能的大规模研究中发挥重要作用 。利 用 RNAi 技术 , 可以在 RNA 水平部分阻断某基因的 能。 Dunn 等
[15 ]

RNAi 除了被用于建立癌症疾病模型外 ,也用于

其他疾病模型的建立和保护方面 。Shcherbata



因敲除 、 反义 RNA 技术等) 相比 ,RNAi 是一种高效 、

用遗传和 RNAi 诱导果蝇细胞激化和肌营养不良表 型 : 缺少灵活性 、 年龄依赖的肌肉退化和有缺陷的光 感受领航器 。Kim 构建重组体慢病毒将 shRNAs 定 向转移到保守的柯萨奇肠道病毒序列 , 防治病毒性 心肌炎 ,提高病毒性心肌炎动物模型的成活率
[21 ]



表达 ,获得功能性丧失 , 进一步研究相关基因的功 利用 RNAi 技术针对海葵肌动蛋白 和半胱氨酸蛋白酶这两个基因 , 用原位杂交的方法 证实这两个基因的表达均受到抑制 , 进而研究该基 因的功能 。

但是利用 RNAi 建立的疾病动物模型的性状持续时 间不太长 ,而且不一定能被稳定遗传下来 , 还有其 他问题有待继续研究 。
213   利用 RNAi 进行药物研究

利用 RNAi 能够特异高效地抑制基因表达 , 获

21112   信号转导通路的研究 : 利用 RNAi 技术可以

得去基因功能表型 , 能够在短时间内大规模筛选靶 点 ,从而实现了在细胞水平和动物水平筛选药靶和 [22 ,32 ] [24 ] 评定药靶 。Hamamichi 利用 RNA 干扰 ( knock
down) ,系统屏蔽帕金森病模型中将近 900 个候选基

容易地确定复杂的信号转导途径中相关基因的上下 游关系及其作用 。James 等
[16 ]

应用 RNAi 研究了果

蝇细胞系中胰岛素信号传导途径 , 取得了与已知胰 岛素信号通路完全一致的结果 。另外 , 基因组范围 的 RNAi 表型筛选已成为研究基因在特殊细胞功能 基因之间的相互关系还是不能确定 。

因和通路 , 找到了两个帕金森病遗传易感性位点和 治疗靶点 ,从而为该疾病的治疗奠定基础 。
RNAi 在被广泛应用于功能基因组研究确定了

和生物活性中作用的一种有效方法 , 然而对于相关

大量潜在的药物作用靶点的同时 , 也被证实了其作 为新一代基因治疗药物的可能性 。2006 年 , 美国
RNAi 药物 — Bevasiranib 在 RNAi 临床实验方面取得

21113   其他基础研究 : 除了以上两个主要应用方面

外 ,RNAi 技术还被应用于生理学 、 生长发育过程研 究等方面的基础研究中 。Palmer 等
[17 ]

Acuity 制药公司生产的用于治疗湿性老年斑病变的

利用 RNAi 技

术进行动物细胞离子通道生理学的研究和应用 。

成功 ,它在疗效 、 安全性方面都优于常规药物 。目 前 ,FDA 已经批准 Bevasiranib 进入 III 期临床实验 , 而最终的试验结果将于 2009 年获得 。RNAi 药物其 他方 面 的 应 用 , 如 治 疗 Huntington 病 和 哮 喘 以 及
COPD 也进入临床前研究阶段 , 但是 RNAi 药物仍存

212   利用 RNAi 建立疾病模型

传统的建立人类疾病动物模型是利用基因敲除

和 Cre2loxP systems 方法 , 但是如果目的基因是小鼠
RNAi 将是建立转基因动物模型的新的工具 ,随着该

发育必需基因的话 ,这些方法就会受到很大的限制 。 技术的发展 ,它可以通过使组织特异的基因功能灭 活 ,不再需要条件定向小鼠和组织特异重组小鼠 ,因 而转 基 因 动 物 将 是 更 加 广 泛 使 用 的 生 物 研 究 工 具
[18 ]

在如给药途径 、 使用安全性等方面的问题 。

3  RNAi 的研究应用展望
   就目前来说 ,RNAi 信号细胞间转导的机制 、 转 录抑制和翻译抑制的机制等都还不是十分清楚 , 但
RNAi 技术为病毒 、 肿瘤及遗传性疾病等尚未根治的 RNAi 技术将更广泛的应用于生命科学研究和人类



遗传基因工程小鼠已被广泛用于建立人类癌症

模型 ,模型小鼠模拟人类癌症相应的形态学 ,组织病 理学 、 、 表型 基因型 。这样的疾病模型对于分析特殊

疾病提供了新的治疗方案 。相信随着研究深入 ,

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Lentiviral RNAi2induced

疾病的临床治疗中 , 这将是目前无法治疗的疾病在 基因治疗方面的一场新的革命 。
参 考 文 献
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