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RNA干扰的原理与应用


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RNA 干扰的原理与应用
王晓然 (10 微生物 102200942) 摘要:RNA 干扰现象最初被称为转录后基因沉默现象,秀丽新小杆线虫是研究该 现象很好的模型;利用该模型探讨了由双链 RNA 介导 RNA 干扰的基本原理;并 且介绍了利用 RNA 干扰引发的基因沉默在药物开发的研究中的应用。 关键字:RNA 干扰 基因沉默 秀丽新小杆线虫 1. 背景介绍 RNA 干扰是普遍存在于真菌、植物、果蝇等各类真核生物之中的现象, 类似于一种古老的免疫机制。 1990 年, Napoli 教授在研究矮牵牛花查尔酮基因时发现了基因共抑制现 象(cosuppression)[1]。她在体外构建了控制矮牵牛花花色的基因查尔酮基 因片段,连上花椰菜花叶病毒的 35S 启动子,连入农杆菌的 T-DNA 质粒,在 矮牵牛花中过度表达。她原先预期,查尔酮的过度表达能加深牵牛花花色的 紫色,但是结果却导致了矮牵牛花子代花色的褪色,内源性的查尔酮遭到沉 默。Napoli 教授把这一现象称之为内源性基因共抑制现象。 1998 年,Andrew J. Hamilton 教授研究了番茄 ACC 氧化酶基因的基因共 抑制现象。 他利用放射性标记法和放线菌酮处理法分析转录后 ACC 氧化酶基 因的 mRNA 和成熟 mRNA。实验结果表明,外源重组基因片段能成功转录, 但是 mRNA 成功转录出后,因为某种原因发生了转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing PTGS)[2]。因此,Andrew J. Hamilton 认为内源 性基因共抑制现象属于转录后的基因沉默现象。 1998 年, Fire 和 Mello 课题组接手了 Guo 教授研究的秀丽新小杆线虫发 育过程中的一个关键基因 par-1[3]的课题。他们以秀丽新小杆线虫为模型, 发现在 Guo 的课题中,引发线虫 par-1 基因沉默的是小片段的双链 RNA[4], 而不是正义单链 RNA 或负义单链 RNA。 他们之后又研究了秀丽新小杆线虫的 unc-22 基因, 进一步阐述了双链 RNA 在基因沉默中的作用, 并创造性地使用 了“RNA 干扰”这个名词。 他们的研究成果激起了其他科学家研究 RNA 干扰现象的浓厚兴趣, 由于 他们的发现揭示了分子生物学中一个全新的,具有普遍性的机制,Andrew Fire, Craig C. Mello 两位科学家因此在 2006 年获得诺贝尔奖 2. RNA 干扰的原理 2.1 线虫中的 RNA 干扰模型 Tabara 教授于 1999 年以秀丽新小杆线虫为模型,揭示了 RNA 干扰 的原理[5]。线虫细胞上的跨膜蛋白 SID-1 引导细胞外的长链双链 RNA 进 入细胞质,RNA 立即与细胞质内的 RDE-4,RDE-1 蛋白形成复合体。然后 DCR-1 与 DRH-1 蛋白与该复合体结合,DCR-1 蛋白将长链 RNA 切断,得 到 RDE-1 结合的 siRNA(小干扰 RNA)复合物。RDE-1-si-RNA 复合物在解 旋酶的作用下解链,RDE-1 蛋白脱去,RISC 酶与正义链和反义链中的一 条链结合,RISC-单链 RNA 复合物在引导下与靶 mRNA 结合。反义 RNA 与靶 mRNA 上同源的部分特异性结合, RISC 的作用下, mRNA 链被 在 靶
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切断,无法与核糖体结合,翻译成蛋白质,引起基因沉默。同时,以反 义 RNA 为引物,以 mRNA 为模板,在 RdRP(RNA 依赖性 RNA 聚合酶) 的作用下,生成新的 siRNA 反义链。这就是 siRNA 的级联放大的机制。 RNA 干扰现象介导的 mRNA 降解特异性强,同时由于放大机制的存 在微量 siRNA 就能引起明显的 RNA 干扰现象。[6]线虫中的 RNA 干扰机 制比较典型,但是在高等生物中,RNA 的机制又有细微差别。 2.2 高等植物细胞中的 RNA 干扰机制 植物细胞中在细胞核内产生的内源性 miRNA(微小干扰 RNA)参与 了植物的基因表达的调控。植物 miRNA 多数长 21 个碱基,具有保守性, 它的产生, 是由 miRNA 前体长链 dsRNA 经 Dicer 酶家族 (与 DCR-1 类似, 常被称为 DCL1、DCL2 等)切割产生。 以下机制为高等植物所特有[7] ① 干扰机制依赖于 Ago 蛋白家族,该家族有 10 个成员,它们在 siRNA 积累,DNA 甲基化作用中起着关键作用,在整个 RNA 干扰的转录后 基因沉默(PTGS)机制中起调节作用 ② Dicer 酶家族在高等植物中有特异性, 4 个成员, 共 称之为 DCL1~DCL4 它们与 miRNA 的成熟有关。同时,miRNA 的成熟需要植物细胞特有 的 HYL1 这种双链 RNA 结合蛋白的参与 ③ 植物中特有的 RDRs(RNA 依赖的 RNA 多聚酶) ,它的作用机制与昆 虫,哺乳动物有明显差异 2.3 哺乳动物的 RNA 干扰机制 哺乳动物的 RNA 干扰机制与高等植物稍有不同,主要表现在以下几方 面: ① 动物 miRNA 的长度多为 22~24 个碱基,比植物的长 ② 动物 miRNA 的前体比植物 miRNA 的前体短得多,后者的长度是前者 的三倍。 ③ 动物 miRNA 由 Drosha(与 Dicer 酶类似) 、RNaseⅢ在细胞核、细胞 质中分两步完成,而该步骤在植物细胞的细胞核中完成 ④ 动物 miRNA 在切断 mRNA 时,通常喜欢在 3’非翻译区域结合 ⑤ 哺乳动物如人类,小鼠等具有较发达的免疫系统,外源性大片段 dsRNA 会引起干扰素样反应,蛋白酶 R(PKR)被激活,有时还能激 活寡聚腺苷合成酶(OAS)通路,使得细胞内蛋白质翻译停止,细胞 死亡,该现象不出现在植物细胞中。 3. RNA 干扰的应用 RNAi 技术在制药行业应用广泛,利用 RNAi 造成的特异性基因沉默,可 以对产生药物的基因工程菌进行改造,提高产率,减少杂质等作用。 李凤岚、邱德有等人利用农杆菌介导的 RNA 干扰技术,在紫杉醇的生物 合成中阻断紫杉烷 14β-羟基化酶(简称 14OH)基因的表达,阻止中间产物流向 C-14 氧取代的紫杉烷[8]。以提高产量。 紫杉醇是一种重要的具有抗癌活性的药物,而人工生产紫杉醇的方法中 红豆杉细胞培养法被认为是最有发展前途的途径之一。紫杉醇生物合成全过 程十分复杂,包含约 20 步酶促反应。其中紫杉烷 14β-羟基化酶(简称 14OH) 存在于包括紫杉醇在内的各种生物合成分支途径中,如下图所示,红圈处会 被 14OH 催化生成 C-13 氧取代的紫杉烷衍生物, 利用 RNAi 技术将 14OH 特异
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性沉默,以减少该杂质,大幅提高紫杉醇的产量。这将带来明显的经济效益。

图表 1

该实验选用该实验室培养的生长状态较好的曼地亚红豆杉细胞系进行转化 试验,采用 6, 7-V 培养基(加入 0.2mg/L 6-BA,1. 5mg/L 2, 4-D 和 2mg/L IAA)对红豆杉 愈伤组织细胞进行培养。该试验采用根癌农杆菌 GV3101,该菌株具有利福平 (rifampicin)抗性,利用该抗性可对其进行筛选。使用载体为 pZh01。 该实验简要步骤如下: ① 双元载体的构建 设计引物,从中国红豆杉中克隆出 14OH 基因片段,长 915bp,正反向插入带有 抗性标记 pZh01 载体,导入农杆菌。该外源基因片段经农杆菌介导,进入红豆杉 愈伤组织细胞中将激活该细胞产生 RNA 干扰作用, 沉默该基因, 14OH 不在细 使 胞中表达。 ②农杆菌的活化 在带抗生素的平板上筛选携带外源基因的农杆菌,然后挑取筛选得到的单菌落, 培养,活化。 ③红豆杉细胞的培养 选取处于对数生长期的的红豆杉细胞,在 6, 7-V 液体培养基中培养 ④转化 将活化好的农杆菌用培养基稀释,放入悬浮培养的细胞体系中超声 30s 处理,共 培养 3 天。然后用培养基清洗细胞,在新鲜的培养基中加入抗生素,继续培养。 ⑤PCR-Southern 检测 提取新鲜的愈伤组织细胞的总 DNA,以它为模板,进行 PCR 反应,然后产物经 0.8%琼脂糖电泳分离后转到硝酸纤维素薄膜上。烘烤使 DNA 与薄膜交联,加入 地高辛标记的外源目的基因片段作为探针进行杂交。 ⑥14OH 基因 mRNA 表达水平的检测 使用试剂盒提取总 RNA,利用 RT-PCR 技术半定量的检测基因表达水平的变化 ⑦C-14 氧取代的紫杉烷含量分析
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将培养好的细胞进行破碎预处理,选择合适的液相色谱条件,使用 HPLC 法定量 检测,算出 C-14 氧取代的紫杉烷在经改造的细胞中的含量高低,利用统计学方 法,算出利用 RNA 干扰技术是否能显著降低红豆杉愈伤组织细胞产生 C-13 氧取 代的紫杉烷杂质的能力。 ⑧结果 RT-PCR 检测结果显示,如下图,14OH 基因表达量显著下降,而作为内参基因的 β-actin 的表达量没有下降。 a 表示转基因(1 号、2 号)与非转基因(3 号)的红豆杉愈伤组织细胞中β-actin 表达 量,可以看出两者无显著差别 b 表示转基因(1 号、2 号)与非转基因(3 号)的红豆杉愈伤组织细胞中 14OH 基因表 达量,可以看出转基因组的表达量明显受到 抑制,而对照非转基因组的表达量很多。
图表 2

这表明 RNA 干扰的效果以及特异性都很强。同时通过 HPLC 分析,产物中三 种 C-14 氧取代紫杉烷类杂质化合物的含量有明显下降。 参考文献 [1] Carolyn Napoli,Richard Jorgensen ,et al lntroduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans The Plant Cell 1990 Vol. 2, 279-289 [2] Andrew J. Hamilton ,Don Grierson, et al A transgene with repeated DNA causes high frequency,post-transcriptional suppression of ACC-oxidase gene expression in tomato The Plant Journal (1998) 15(6), 737–746 [3] Guo, S. & Kemphues, K. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell 81, 611-620 (1995). [4] Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., and Mello C.C., 1998, Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans, Nature,391: 806-811 [5] Tabara H., Sarkisslan M., Kelly W.G., Fleenor J., Grishok A.,Timmons L., Fire A., and Mello C.C., 1999, The rde -1 gene, RNA interference, and transponson silencing in C. elegans, Cell, 99: 123-133 [6] K·阿帕萨尼,殷勤伟等 RNA 干扰技术——从基础科学到药物开发,科 学出版社 2007 年 5 月第一版 [7] 宋尔卫 RNA 干扰的生物学原理与应用 高等教育出版社 2005 年 6 月第 一版 [8] 李凤岚,邱德有,马小军,刘敏,许德荣 利用 RNAi 抑制曼地亚红豆杉 细胞紫杉烷 14β-羟基化酶基因的表达[J]. 中国生物工程杂志 2009 年 05 期

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