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RT-PCR实验方法总结


RT-PCR 实验方法总结
RT-PCR 实验有三步:抽提 RNA,RT,PCR。 实验有三步: , , 。 要求: 1.做 RT 前必需测 RNA 浓度,逆转录体系对 RNA 量还是有一些要求,常用 500ng 或 1ug。 2. RT 按要求做,一般不会出太大问题。 3. PCR,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的 cDNA 存在,不是单改 变 Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1)RT 和 PCR 时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?必须

在 RT 时,引物设计有 3 种方法即 a:Random 9mers;b:Oligo dT-Adaptor Primer;和 c:特 异的下游引物。如果用 a 和 b 方法,是扩增的所有的 cDNA(理论上),还要用此产物做 PCR 的模板继续扩增。

如果用 c 方法,那么要去那里查它的序列呢?http://www.ncbi.nlm.nih.gov

问题: 在做 RT-PCR 遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩 出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试 其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!(注:已肯定该基因在两种组织中都表达, 且内参照在两种组织都可扩增出来) 从这两种组织中提取的 RNA 的量是不一样的, 我测过吸光度, 差异还很大, 会不会和这有关呢? 请高手指教! 解答: 1.RT-PCR 有两种做法: 条件具备的话可用 kit 进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再 PCR。但后来 发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于 PC R 的进行,当然也可能是我买的 kit 不太好。(promega)。 2.RT-PCR 应具备的条件 高质量的 RNA(保留后可做 5‘,3’RACE);引物的(最好产物短点);若涉及粗略定量的话还 应考虑 RNA 的浓度或是 cDNA 的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将 RNA 的 浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样);体系的均一性等。 3.RACE 我做过 RACE(3’RACE 是宝生物的 Kit;5‘RACE 是 Gibico),但现在再进行另一个同源基因的 3 ‘RACE 时却怎么也 P 不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序

列(RACE 的方法),而另一个基因的 3’UTR 却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的 3‘UTR 太长的缘故,我都快绿了,有无

RT-PCR 的常用内标 b-actin 和 GAPDH 的使用有选择性吗?比如不同的细胞,不同的刺激。

有关内参: RT-PCR 内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些),最好分开两管,把除了引物之外 的 mixture 统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基因表达的相对浓度。

问:我曾经作过同一管的 PCR,内有 actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质 量不理想(而且酶量、Mg2+加倍)。请教 mxbdna2003 ,你是如何处理同一管的 PCR 的各成 分的浓度? 答: it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. i t just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR) and bettr er for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using "accurate piptte" is wrong. it shoud be remembered to do the inner control o f housekeeping gene everytime. 在同一管中做 RT,其实没有什么问题,不需要 taq 魅加量,taq 酶本来就是过量的^-^,(平时 做 pcr 的时候,完全可以再省一些 taq 酶的,半斤八两就可以了,我想这肯定再很多贴子里应该 都谈到了。Mg 就跟不能变了,一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。 关键是摸,十八摸(太少,只争朝夕,开个玩笑)虽然用不着,但是摸上 3、5 摸总是必要的, 首先要分开摸,然后再一起摸,直到摸的好了,还要考虑比较的不同的模板中的量,所以我们不 建议再同一管中进行,因为还有互相竞争抑制的问题,即使不同基因之间。

有关内参的建议:

一定要做内参的,每一次,我想。不作内参的结果是不可信的 电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度,着我在好几封帖子里都谈了,再说一边 我得观点,1、半定量和定量 RT-PCR 做的都是基因相对表达量,不是绝对表达量,除非你能准 确知道来自多少细胞,但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量 RT-PCR 本身是不可信 的,作为实验的粗筛是可以的,但不能作为最终结果的,3、半定量 RT-PCR 应该再两管中进行, 除非内参基因和目的基因表达相同,长度差不多,GC 含量相似,或者实在穷的要省 PCR 管和 t aq。 关于平台期和线性期的问题,实际上线性期是指数期,只不过碰巧 2 的冥和 2 的倍数是相同的。 看上去任何一个时期都可以,实际上是不对的,因为牵涉到酶促动力学的问题,这个我也不懂, 有一些专门的文章,好像,涉及到很多化学的东西。我们学医的,也没必要知道那些,但是其中 主要是因为模板引物酶原料和 buffer 之间的关系,这种反应单靠改变其中一种成分没有用的,

酶一直是过量,再加酶也没用,引物 ntp 都是这样。烟鬼正传,最好选线性期的开始阶段,但是 要在你的凝胶成像分辨范围内,所以选一个这两种的契合点。给你一张图你就明白了,再开始的 时候酸的是切线,关于引物设计,再可能的情况下,除了常规要求之外,最好兼顾跨内含子(不 过,根据要求,还可以专门设计隔内含子的,这样还可以用于基因组 PCR)、长度小于 500bp -600bp 等等。

引物当然要设计成一样的退火温度,即使不在一管中,也要一样的,要在一台机器里啊。我的引 物占了冰箱一格,大部分是一个温度,这样任何几个都可以拿来披,也不用查。 我反复说过了,别用软件,就用眼睛看,软件涉及的在好,有些基因在它出软件的时候,还没发 现呢,跟不要说在基因组的位置和序列了,怎么考虑内含子的问题呢?

18s 的引物也和著名的 βactin 一样是设计的,只要拿到序列就可以了,但是限制是只能用总 RN A 为模板,但是比 actin 和 bubulin 等可准多了,更不要说 GAPDH 这个破烂了。18s 除了在细胞 中更相同(量)外,主要是它占的比例远远高于看家基因,所以定量更加准确,我想,不知对不 对,请几位主任和 eeflying 指教。我认为,就像你用某一种东西的数量去概括,因该选那种多的 东西,说一座房子是由 2000 块砖造成的,比说又 29 根梁更准确吧。更不要说没有看家基因不 看家的缺点,因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。 PE 有专门的用于实时 PCR 的内参试剂盒,就是用 18s,不过我们看懂使用的那条序列,不知有 没有人用过,告知其序列和 genbank 号。

我觉得做 RT-PCR 的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是 许多人还是历经多次磨难, 有时就是得不出结果。 因此, 我认为因为每个人所要克隆的片断不同, 引物不同等,因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明:做实验时各人的 情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。 记得我开始我的RT-PCR 时,按常规方法,提取总RNA后,首先用自己设计的下游引物进行 逆转录,不断改变反应条件,进行了N次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的 PCR 的片断位 于我们实验另一位同学克隆的片断当中,而该同学已经用 RT-PCR 克隆出她的片断(尽管她用这 些RT-PCR产物做模版再进行PCR时也没办法重复出她的产物),因此,我先用她的引物 和条件扩增出她的片断,然后用她的RT-PCR产物作模板(有点改进,逆转录反应换用了9 mers 随机引物),用我的引进物进行一般 PCR,终于得到我的产物,测序结果完全正确。尽管 我的这个经历别人很人遇到, 但足可以说明实验可以有自己的模式, 书本的知识和别人的经验很 重要,但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制

请问: 1 引物的特异退火温度怎样设定?可以根据 gc 和 at 含量算出吗?可以用引物报告单上的 Tm 值吗? 2 PCR 时 20 微升体系中 cDNA 应加多少比较合适?MgCl2 应加多少?各个成分的量有无确定标 准?

3 PCR 结果跑电泳,actin 有,但跑不出目的条带,有几种原因?与 cDNA 的量少有关吗?Mg 离 子太多是否会抑制 Taqase 的活性?

一般来说引物报告单上的是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的. 20 中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加 1,2ul 都可以的.mg 要调的,但我总觉 得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的. 如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.
一、 防止 RNA 酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于 180℃的高温下干烤 6hr 或更长时间。 2. 塑料器皿可用 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不

能使用)。
3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在 3% H2O2 室

温 10min,然后用 0.1% DEPC 水冲洗,晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC,在 37℃处理 12hr 以上。然后用高压灭菌除去残留的

DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用 DEPC 处理过的无菌双蒸水配制,然后经 0.22?m 滤膜过 滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。 6. 设置 RNA 操作专用实验室,所有器械等应为专用。 二、常用的 RNA 酶抑制剂 1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂。它通过和 RNA 酶的活性基

团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的 RNA 酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使 RNA 酶失活。

它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对 RNA 酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和 RNA 酶结合形成过渡态类物

质,几乎能完全抑制 RNA 酶的活性。
4. RNA 酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin 是 RNA 酶的一 种非竞争性抑制剂,可以和多种 RNA 酶结合,使其失活。 5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对 RNA 酶也有一定抑制作用。

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RT-PCR 实验方法大全
发布日期:2007-7-10 热门指数:10516 分享 | 收藏

RT-PCR 实验有三步:抽提 RNA,RT,PCR。 要求: 1.做 RT 前必需测 RNA 浓度,逆转录体系对 RNA 量还是有一些要求,常用 500ng 或 1ug。 2. RT 按要求做,一般不会出太大问题。 3. PCR,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的 cDNA 存在,不是单改 变 Mg2 浓度、退火温度能解决的。 1)RT 和 PCR 时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?必须

在 RT 时,引物设计有 3 种方法即 a:Random 9mers;b:Oligo dT-Adaptor Primer;和 c:特 异的下游引物。如果用 a 和 b 方法,是扩增的所有的 cDNA(理论上),还要用此产物做 PCR 的模板继续扩增。

如果用 c 方法,那么要去那里查它的序列呢?http://www.ncbi.nlm.nih.gov

问题: 在做 RT-PCR 遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩 出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试 其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!(注:已肯定该基因在两种组织中都表达,

且内参照在两种组织都可扩增出来) 从这两种组织中提取的 RNA 的量是不一样的, 我测过吸光度, 差异还很大, 会不会和这有关呢? 请高手指教! 解答: 1.RT-PCR 有两种做法: 条件具备的话可用 kit 进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再 PCR。但后来 发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于 PC R 的进行,当然也可能是我买的 kit 不太好。(promega)。 2.RT-PCR 应具备的条件 高质量的 RNA(保留后可做 5‘,3’RACE);引物的(最好产物短点);若涉及粗略定量的话还 应考虑 RNA 的浓度或是 cDNA 的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将 RNA 的 浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样);体系的均一性等。 3.RACE 我做过 RACE(3’RACE 是宝生物的 Kit;5‘RACE 是 Gibico),但现在再进行另一个同源基因的 3 ‘RACE 时却怎么也 P 不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序 列(RACE 的方法),而另一个基因的 3’UTR 却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的 3‘UTR 太长的缘故,我都快绿了,有无

RT-PCR 的常用内标 b-actin 和 GAPDH 的使用有选择性吗?比如不同的细胞,不同的刺激。

有关内参: RT-PCR 内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些),最好分开两管,把除了引物之外 的 mixture 统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基因表达的相对浓度。

问:我曾经作过同一管的 PCR,内有 actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质 量不理想(而且酶量、Mg2 加倍)。请教 mxbdna2003 ,你是如何处理同一管的 PCR 的各成 分的浓度? 答: it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. i t just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR) and bettr er for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using "accurate piptte" is wrong. it shoud be remembered to do the inner control o f housekeeping gene everytime. 在同一管中做 RT,其实没有什么问题,不需要 taq 魅加量,taq 酶本来就是过量的^-^,(平时 做 pcr 的时候,完全可以再省一些 taq 酶的,半斤八两就可以了,我想这肯定再很多贴子里应该 都谈到了。Mg 就跟不能变了,一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。 关键是摸,十八摸(太少,只争朝夕,开个玩笑)虽然用不着,但是摸上 3、5 摸总是必要的, 首先遥分开摸,然后再一起摸,直到摸的好了,还要考虑比较的不同的模板中的量,所以我们不

建议再同一管中进行,因为还有互相竞争抑制的问题,即使不同基因之间。

有关内参的建议:

一定要做内参的,每一次,我想。不作内参的结果是不可信的 电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度,着我在好几封帖子里都谈了,再说一边 我得观点,1、半定量和定量 RT-PCR 做的都是基因相对表达量,不是绝对表达量,除非你能准 确知道来自多少细胞,但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量 RT-PCR 本身是不可信 的,作为实验的粗筛是可以的,但不能作为最终结果的,3、半定量 RT-PCR 应该再两管中进行, 除非内参基因和目的基因表达相同,长度差不多,GC 含量相似,或者实在穷的要省 PCR 管和 t aq。 关于平台期和线性期的问题,实际上线性期是指数期,只不过碰巧 2 的冥和 2 的倍数是相同的。 看上去任何一个时期都可以,实际上是不对的,因为牵涉到酶促动力学的问题,这个我也不懂, 有一些专门的文章,好像,涉及到很多化学的东西。我们学医的,也没必要知道那些,但是其中 主要是因为模板引物酶原料和 buffer 之间的关系,这种反应单靠改变其中一种成分没有用的, 酶一直是过量,再加酶也没用,引物 ntp 都是这样。烟鬼正传,最好选线性期的开始阶段,但是 要在你的凝胶成像分辨范围内,所以选一个这两种的契合点。给你一张图你就明白了,再开始的 时候酸的是切线,这图我在 *** 帖过。 关于引物设计,再可能的情况下,除了常规要求之外,最好兼顾跨内含子(不过,根据要求,还 可以专门设计隔内含子的,这样还可以用于基因组 PCR)、长度小于 500bp-600bp 等等。

引物当然要设计成一样的退火温度,即使不再一管中,也要一样的,要在一台机器里啊。我的引 物占了冰箱一格,大部分是一个温度,这样任何几个都可以拿来披,也不用查。 我反复说过了,别用软件,就用眼睛看,软件涉及的在好,有些基因在它出软件的时候,还没发 现呢,跟不要说在基因组的位置和序列了,怎么考虑内含子的问题呢?

18s 的引物也和著名的 βactin 一样是设计的,只要拿到序列就可以了,但是限制是只能用总 RN A 为模板,但是比 actin 和 bubulin 等可准多了,更不要说 GAPDH 这个破烂了。18s 除了在细胞 中更相同(量)外,主要是它占的比例远远高于看家基因,所以定量更加准确,我想,不知对不 对,请几位主任和 eeflying 指教。我认为,就像你用某一种东西的数量去概括,因该选那种多的 东西,说一座房子是由 2000 块砖造成的,比说又 29 根梁更准确吧。更不要说没有看家基因不 看家的缺点,因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。 PE 有专门的用于实时 PCR 的内参试剂盒,就是用 18s,不过我们看懂使用的那条序列,不知有 没有人用过,告知其序列和 genbank 号。 正好问一下,我查了一些序列,一直没有去合成,主要是因为手上的 actin 的荧光探针还没有完, 当初和成了一堆。 有那位高手用过 18s 的内参,请问您的序列(我指的是模板的序列)? 原位杂交最好用 RNA 做探针,效果好一些,反正你有钱卖 roche 的盒子,而且量也能保证,因

为转录过程嘛,沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理清。

我觉得做 RT-PCR 的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是 许多人还是历经多次磨难, 有时就是得不出结果。 因此, 我认为因为每个人所要克隆的片断不同, 引物不同等,因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明:做实验时各人的 情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。 记得我开始我的RT-PCR 时,按常规方法,提取总RNA后,首先用自己设计的下游引物进行 逆转录,不断改变反应条件,进行了N次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的 PCR 的片断位 于我们实验另一位同学克隆的片断当中,而该同学已经用 RT-PCR 克隆出她的片断(尽管她用这 些RT-PCR产物做模版再进行PCR时也没办法重复出她的产物),因此,我先用她的引物 和条件扩增出她的片断,然后用她的RT-PCR产物作模板(有点改进,逆转录反应换用了9 mers 随机引物),用我的引进物进行一般 PCR,终于得到我的产物,测序结果完全正确。尽管 我的这个经历别人很人遇到, 但足可以说明实验可以有自己的模式, 书本的知识和别人的经验很 重要,但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制

请问: 1 引物的特异退火温度怎样设定?可以根据 gc 和 at 含量算出吗?可以用引物报告单上的 Tm 值吗? 2 PCR 时 20 微升体系中 cDNA 应加多少比较合适?MgCl2 应加多少?各个成分的量有无确定标 准? 3 PCR 结果跑电泳,actin 有,但跑不出目的条带,有几种原因?与 cDNA 的量少有关吗?Mg 离 子太多是否会抑制 Taqase 的活性?

一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的. 20 中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加 1,2ul 都可以的.mg 要调的,但我总觉 得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的. 如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了. 在所有 RNA 实验中,最关键的因素是分离得到全长的 RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸 酶(RNA 酶)的污染。由于 RNA 酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而 RNA 制剂 中只要存在少量的 RNA 酶就会引起 RNA 在制备与分析过程中的降解,而所制备的 RNA 的纯度 和完整性又可直接影响 RNA 分析的结果,所以 RNA 的制备与分析操作难度极大。 在实验中,一方面要严格控制外源性 RNA 酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的 RNA 酶。RNA 酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。 外源性的 RNA 酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验 中使用的 RNA 酶也会造成污染。这些外源性的 RNA 酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳 槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的 RNA 酶。 一、 防止 RNA 酶污染的措施

1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于 180℃的高温下干烤 6hr 或更长时间。 2. 塑料器皿可用 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故 不能使用)。 3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在 3% H2O2 室 温 10min,然后用 0.1% DEPC 水冲洗,晾干。 4. 配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC,在 37℃处理 12hr 以上。然后用高压灭菌除去残留的 DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用 DEPC 处理过的无菌双蒸水配制,然后经 0.22?m 滤膜过 滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。 6. 设置 RNA 操作专用实验室,所有器械等应为专用。 二、常用的 RNA 酶抑制剂 1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂。它通过和 RNA 酶的活性基 团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。 2. 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的 RNA 酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使 RNA 酶失活。 它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对 RNA 酶有强烈的变性作用。 3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和 RNA 酶结合形成过渡态类物 质,几乎能完全抑制 RNA 酶的活性。 4. RNA 酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin 是 R NA 酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种 RNA 酶结合,使其失活。 5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对 RNA 酶也有一定抑制作用。 mRNA 的分离与纯化 真核细胞的 mRNA 分子最显著的结构特征是具有 5’端帽子结构(m7G)和 3’端的 Poly(A)尾巴。 绝大多数哺乳类动物细胞 mRNA 的 3’端存在 20-30 个腺苷酸组成的 Poly(A)尾,通常用 Poly (A )表示。这种结构为真核 mRNA 的提取,提供了极为方便的选择性标志,寡聚(dT)纤维 素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化 mRNA 的理论基础就在于此。 mRNA 的分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。此法 利用 mRNA 3’末端含有 Poly(A )的特点,在 RNA 流经寡聚(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液 的作用下, mRNA 被特异地结合在柱上, 当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下, mRNA 被洗脱,经过两次寡聚(dT)纤维柱后,即可得到较高纯度的 mRNA。 寡聚(dT)纤维素柱纯化 mRNA 一、试剂准备 1.3M 醋酸钠(pH 5.2) 2.0.1M NaOH 3.1×上样缓冲液:20mM Tris-HCl(pH 7.6);0.5M NaCl;1M EDTA(pH 8.0);0.1%SLS(十 二烷基氨酸钠。配制时可先配制 Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,经高压消 毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至 65℃时,加入经 65℃温育(30min)的 10%SLS 至终浓度为 0.1%。 4.洗脱缓冲液:10mM Tris-HCl(pH 7.6);1mM EDTA(pH 8.0);0.05% SDS

5.无水乙醇、70%乙醇 6.DEPC 二、操作步骤 1.将 0.5-1.0g 寡聚(dT)-纤维悬浮于 0.1M 的 NaOH 溶液中。 PE 有专门的用于实时 PCR 的内参试剂盒,就是用 18s,不过我们看懂使用的那条序列,不知有 没有人用过,告知其序列和 genbank 号。 正好问一下,我查了一些序列,一直没有去合成,主要是因为手上的 actin 的荧光探针还没有完, 当初和成了一堆。 有那位高手用过 18s 的内参,请问您的序列(我指的是模板的序列)? 原位杂交最好用 RNA 做探针,效果好一些,反正你有钱卖 roche 的盒子,而且量也能保证,因 为转录过程嘛,沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理清。

我觉得做 RT-PCR 的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是 许多人还是历经多次磨难, 有时就是得不出结果。 因此, 我认为因为每个人所要克隆的片断不同, 引物不同等,因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明:做实验时各人的 情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。 记得我开始我的RT-PCR 时,按常规方法,提取总RNA后,首先用自己设计的下游引物进行 逆转录,不断改变反应条件,进行了N次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的 PCR 的片断位 于我们实验另一位同学克隆的片断当中,而该同学已经用 RT-PCR 克隆出她的片断(尽管她用这 些RT-PCR产物做模版再进行PCR时也没办法重复出她的产物),因此,我先用她的引物 和条件扩增出她的片断,然后用她的RT-PCR产物作模板(有点改进,逆转录反应换用了9 mers 随机引物),用我的引进物进行一般 PCR,终于得到我的产物,测序结果完全正确。尽管 我的这个经历别人很人遇到, 但足可以说明实验可以有自己的模式, 书本的知识和别人的经验很 重要,但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制

请问: 1 引物的特异退火温度怎样设定?可以根据 gc 和 at 含量算出吗?可以用引物报告单上的 Tm 值吗? 2 PCR 时 20 微升体系中 cDNA 应加多少比较合适?MgCl2 应加多少?各个成分的量有无确定标 准? 3 PCR 结果跑电泳,actin 有,但跑不出目的条带,有几种原因?与 cDNA 的量少有关吗?Mg 离 子太多是否会抑制 Taqase 的活性?

一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的. 20 中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加 1,2ul 都可以的.mg 要调的,但我总觉 得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的. 如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.

在所有 RNA 实验中,最关键的因素是分离得到全长的 RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸 酶(RNA 酶)的污染。由于 RNA 酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而 RNA 制剂 中只要存在少量的 RNA 酶就会引起 RNA 在制备与分析过程中的降解,而所制备的 RNA 的纯度 和完整性又可直接影响 RNA 分析的结果,所以 RNA 的制备与分析操作难度极大。 在实验中,一方面要严格控制外源性 RNA 酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的 RNA 酶。RNA 酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。 外源性的 RNA 酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验 中使用的 RNA 酶也会造成污染。这些外源性的 RNA 酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳 槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的 RNA 酶。 一、 防止 RNA 酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于 180℃的高温下干烤 6hr 或更长时间。 2. 塑料器皿可用 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故 不能使用)。 3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在 3% H2O2 室 温 10min,然后用 0.1% DEPC 水冲洗,晾干。 4. 配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC,在 37℃处理 12hr 以上。然后用高压灭菌除去残留的 DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用 DEPC 处理过的无菌双蒸水配制,然后经 0.22?m 滤膜过 滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。 6. 设置 RNA 操作专用实验室,所有器械等应为专用。 二、常用的 RNA 酶抑制剂 1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂。它通过和 RNA 酶的活性基 团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。 2. 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的 RNA 酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使 RNA 酶失活。 它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对 RNA 酶有强烈的变性作用。 3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和 RNA 酶结合形成过渡态类物 质,几乎能完全抑制 RNA 酶的活性。 4. RNA 酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin 是 R NA 酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种 RNA 酶结合,使其失活。 5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对 RNA 酶也有一定抑制作用。 mRNA 的分离与纯化 真核细胞的 mRNA 分子最显著的结构特征是具有 5’端帽子结构(m7G)和 3’端的 Poly(A)尾巴。 绝大多数哺乳类动物细胞 mRNA 的 3’端存在 20-30 个腺苷酸组成的 Poly(A)尾,通常用 Poly (A )表示。这种结构为真核 mRNA 的提取,提供了极为方便的选择性标志,寡聚(dT)纤维 素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化 mRNA 的理论基础就在于此。 mRNA 的分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。此法 利用 mRNA 3’末端含有 Poly(A )的特点,在 RNA 流经寡聚(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液 的作用下, mRNA 被特异地结合在柱上, 当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下,

mRNA 被洗脱,经过两次寡聚(dT)纤维柱后,即可得到较高纯度的 mRNA。 寡聚(dT)纤维素柱纯化 mRNA 一、试剂准备 1.3M 醋酸钠(pH 5.2) 2.0.1M NaOH 3.1×上样缓冲液:20mM Tris-HCl(pH 7.6);0.5M NaCl;1M EDTA(pH 8.0);0.1%SLS(十 二烷基氨酸钠。配制时可先配制 Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,经高压消 毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至 65℃时,加入经 65℃温育(30min)的 10%SLS 至终浓度为 0.1%。 4.洗脱缓冲液:10mM Tris-HCl(pH 7.6);1mM EDTA(pH 8.0);0.05% SDS 5.无水乙醇、70%乙醇 6.DEPC 二、操作步骤 1.将 0.5-1.0g 寡聚(dT)-纤维悬浮于 0.1M 的 NaOH 溶液中。 PE 有专门的用于实时 PCR 的内参试剂盒,就是用 18s,不过我们看懂使用的那条序列,不知有 没有人用过,告知其序列和 genbank 号。 正好问一下,我查了一些序列,一直没有去合成,主要是因为手上的 actin 的荧光探针还没有完, 当初和成了一堆。 有那位高手用过 18s 的内参,请问您的序列(我指的是模板的序列)? 原位杂交最好用 RNA 做探针,效果好一些,反正你有钱卖 roche 的盒子,而且量也能保证,因 为转录过程嘛,沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理清。

我觉得做 RT-PCR 的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是 许多人还是历经多次磨难, 有时就是得不出结果。 因此, 我认为因为每个人所要克隆的片断不同, 引物不同等,因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明:做实验时各人的 情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。 记得我开始我的RT-PCR 时,按常规方法,提取总RNA后,首先用自己设计的下游引物进行 逆转录,不断改变反应条件,进行了N次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的 PCR 的片断位 于我们实验另一位同学克隆的片断当中,而该同学已经用 RT-PCR 克隆出她的片断(尽管她用这 些RT-PCR产物做模版再进行PCR时也没办法重复出她的产物),因此,我先用她的引物 和条件扩增出她的片断,然后用她的RT-PCR产物作模板(有点改进,逆转录反应换用了9 mers 随机引物),用我的引进物进行一般 PCR,终于得到我的产物,测序结果完全正确。尽管 我的这个经历别人很人遇到, 但足可以说明实验可以有自己的模式, 书本的知识和别人的经验很 重要,但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制

请问: 1 引物的特异退火温度怎样设定?可以根据 gc 和 at 含量算出吗?可以用引物报告单上的 Tm 值吗?

2 PCR 时 20 微升体系中 cDNA 应加多少比较合适?MgCl2 应加多少?各个成分的量有无确定标 准? 3 PCR 结果跑电泳,actin 有,但跑不出目的条带,有几种原因?与 cDNA 的量少有关吗?Mg 离 子太多是否会抑制 Taqase 的活性?

一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的. 20 中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加 1,2ul 都可以的.mg 要调的,但我总觉 得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的. 如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了. 在所有 RNA 实验中,最关键的因素是分离得到全长的 RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸 酶(RNA 酶)的污染。由于 RNA 酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而 RNA 制剂 中只要存在少量的 RNA 酶就会引起 RNA 在制备与分析过程中的降解,而所制备的 RNA 的纯度 和完整性又可直接影响 RNA 分析的结果,所以 RNA 的制备与分析操作难度极大。 在实验中,一方面要严格控制外源性 RNA 酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的 RNA 酶。RNA 酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。 外源性的 RNA 酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验 中使用的 RNA 酶也会造成污染。这些外源性的 RNA 酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳 槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的 RNA 酶。 一、 防止 RNA 酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于 180℃的高温下干烤 6hr 或更长时间。 2. 塑料器皿可用 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故 不能使用)。 3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在 3% H2O2 室 温 10min,然后用 0.1% DEPC 水冲洗,晾干。 4. 配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC,在 37℃处理 12hr 以上。然后用高压灭菌除去残留的 DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用 DEPC 处理过的无菌双蒸水配制,然后经 0.22?m 滤膜过 滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。 6. 设置 RNA 操作专用实验室,所有器械等应为专用。 二、常用的 RNA 酶抑制剂 1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂。它通过和 RNA 酶的活性基 团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。 2. 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的 RNA 酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使 RNA 酶失活。 它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对 RNA 酶有强烈的变性作用。 3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和 RNA 酶结合形成过渡态类物 质,几乎能完全抑制 RNA 酶的活性。 4. RNA 酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin 是 R

NA 酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种 RNA 酶结合,使其失活。 5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对 RNA 酶也有一定抑制作用。 mRNA 的分离与纯化 真核细胞的 mRNA 分子最显著的结构特征是具有 5’端帽子结构(m7G)和 3’端的 Poly(A)尾巴。 绝大多数哺乳类动物细胞 mRNA 的 3’端存在 20-30 个腺苷酸组成的 Poly(A)尾,通常用 Poly (A )表示。这种结构为真核 mRNA 的提取,提供了极为方便的选择性标志,寡聚(dT)纤维 素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化 mRNA 的理论基础就在于此。 mRNA 的分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。此法 利用 mRNA 3’末端含有 Poly(A )的特点,在 RNA 流经寡聚(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液 的作用下, mRNA 被特异地结合在柱上, 当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下, mRNA 被洗脱,经过两次寡聚(dT)纤维柱后,即可得到较高纯度的 mRNA。 寡聚(dT)纤维素柱纯化 mRNA 一、试剂准备 1.3M 醋酸钠(pH 5.2) 2.0.1M NaOH 3.1×上样缓冲液:20mM Tris-HCl(pH 7.6);0.5M NaCl;1M EDTA(pH 8.0);0.1%SLS(十 二烷基氨酸钠。配制时可先配制 Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,经高压消 毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至 65℃时,加入经 65℃温育(30min)的 10%SLS 至终浓度为 0.1%。 4.洗脱缓冲液:10mM Tris-HCl(pH 7.6);1mM EDTA(pH 8.0);0.05% SDS 5.无水乙醇、70%乙醇 6.DEPC 二、操作步骤 1.将 0.5-1.0g 寡聚(dT)-纤维悬浮于 0.1M 的 NaOH 溶液中。 2.用 DEPC 处理的 1ml 注射器或适当的吸管,将寡聚(dT)-纤维素装柱 0.5-1ml,用 3 倍柱床 体积的 DEPC H2O 洗柱。 3.使用 1×上样缓冲液洗柱,直至洗出液 pH 值小于 8.0。 4.将 RNA 溶解于 DEPC H2O 中,在 65℃中温育 10min 左右,冷却至室温后加入等体 2×上样 缓冲液,混匀后上柱,立即收集流出液。当 RNA 上样液全部进入柱床后,再用 1×上样缓冲液洗 柱,继续收集流出液。 5.将所有流出液于 65℃加热 5min,冷却至室温后再次上柱,收集流出液。 6.用 5-10 倍柱床体积的 1×上样缓冲液洗柱,每管 1ml 分部收集,OD260 测定 RNA 含量。前 部分收集管中流出液的 OD260 值很高,其内含物为无 Poly(A)尾的 RNA。后部分收集管中流出 液的 OD260 值很低或无吸收。 7.用 2-3 倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱 Poly(A )RNA,分部收集,每部分为 1/3-1/2 柱体积。 8.OD260 测定 Poly(A )RNA 分布,合并含 Poly(A )RNA 的收集管,加入 1/10 体积 3M NaAc (pH5.2)、2.5 倍体积的预冷无水乙醇,混匀,-20℃放置 30min。 9.4℃离心,10000g×15min,小心吸弃上清。用 70%乙醇洗涤沉淀。[注意:此时 Poly(A )RN

A 的沉淀往往看不到]。4℃离心,10000g×5min,弃上清,室温晾干。 10. 用适量的 DEPC H2O 溶解 RNA。 三、注意事项 1.整个实验过程必须防止 Rnase 的污染。 2.步骤(4)中将 RNA 溶液置 65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个,一个是破坏 R NA 的二级结构,尤其是 mRNA Poly(A )尾处的二级结构,使 Poly(A )尾充分暴露,从而提高 P oly(A )RNA 的回收率;另一个目的是能解离 mRNA 与 rRNA 的结合,否则会导致 rRNA 的污染。 所以此步骤不能省略。 3.十二烷基肌氨酸钠盐在 18℃以下溶解度下降,会阻碍柱内液体流动,若室温低于 18℃最好 用 LiCl 替代 NaCl。 4.寡聚(dT)-纤维素柱可在 4℃贮存,反复使用。每次使用前应该依次用 NaOH、灭菌 ddH2 O、上样缓冲液洗柱。 5. 一般而言, 107 哺乳动物培养细胞能提取 1-5?g Poly(A )RNA, 约相当于上柱总 RNA 量的 1% -2%。 RNA 酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义 RNA 探针与样品 杂交,以检测 RNA 表达的技术。与 Northern 杂交和 RT-PCR 比较,RPA 有以下几个优点: 1. 检测灵敏度比 Northern 杂交高。由于 Northern 杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针 的损失,使灵敏度下降,而 RPA 将所有杂交体系进行电泳,故损失小,提高了灵敏度。 2. 由于 PCR 扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题,基于 PCR 产物量进行分析所得数据的 可靠性将下降,而 RPA 没有扩增过程,因此,分析的数据真实性较高。 3. 由于与反义 RNA 探针杂交的样品 RNA 仅为该 RNA 分子的部分片段,因此,部分降解的 RN A 样品仍可进行分析。 4. 步骤较少,耗时短。与 Northern 杂交相比,省去了转膜和洗膜的过程。 5. RNA-RNA 杂交体稳定性高,无探针自身复性问题,无须封闭。 6. 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交,无竞争性问题。 7. 检测分子长度可以任意设置,灵活性大。 RPA 的缺点是需要同位素标记探针。 一、试剂准备 1. GACU POOL:取 100mM ATP、CTP、GTP 各 2.78?l、100mM UTP 0.06?l,加 DEPC H2 O 至 100?l。 2. 杂交缓冲液 IPES 0.134g、0.5M EDTA(pH8.0)20?l、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺 8ml,加 D EPC H2O 至 10ml。 3. RNase 消化液:5M NaCl 120?l、1M Tris-HCl(pH7.4) 20?l、0.5M EDTA(pH8.0)20?l、R Nase A(10mg/ml) 8?l、RNase T1(250U/?l) 1?l,加 DEPC H2O 至 2ml 二、操作步骤 1. 反义 RNA 可由含 T7 或 SP6 启动子的重组质粒为模板制备, 也可以用含启动子的 PCR 产物为 模板制备,本文介绍后者。 (1)设计含 T7 启动子的 PCR 引物

由于 PCR 产物将作为合成反义 RNA 的模板,所以一对引物中的下游引物 5’-端要含 T7 启动子序 列:

T7 启动子序列为:5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引物设计的其他要求与一般 PCR 引物的设计相同。 PCR 产物的长度决定了反义 RNA 探针的长度, 具体设计时可考虑 100-400bp 长。最好采用巢式 PCR,即先扩增出一较长的片段,再以该片段 为模板扩增出较短的片段,以保证探针的特异性,如下图所示:

上游引物

下游引物Ⅱ T7 启动子序列

下游引物Ⅰ

(2)PCR

先用上游引物和下游引物Ⅰ进行 PCR,再以 PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7 进行 二次 PCR(具体操作参见 PCR 章节)。

(3)探针合成标记与纯化

在 0.5ml 离心管中加入下列试剂:

RNasin (40U/?l) 0.5?l

GACU POOL GAC (含 GTP、CTP、ATP 各 2.75 mM,UTP 61?M) 2?l

[α-32P]UTP(10?Ci/?l) 2.5?l

DTT (二硫苏糖醇,0.1M) 1?l

5×转录 buffer 2?l

模板(50ng/?l) 1?l

T7 RNA 聚合酶 (15U) 1?l

混合后,短暂离心,37OC 保温 1hr。

加入 DNaseⅠ(10U/?l)1?l, 37OC 15min, 然后 75 OC 10min 以灭活 DNAseⅠ和 T7 RNA 聚 合酶。

加入:饱和酚 50?l

氯仿 50?l

酵母 tRNA(2?g/?l) 4?l

DEPC H2O 100?l 室温下充分混匀,离心 10000g×2min。取上层液置另一 0.5 ml 离心管中,加入 100?l 氯仿,混 匀,离心 10000g×2min。将上层液转移至另一 0.5ml 离心管中,再加入 3M NaAc 10?l、预冷 无水乙醇 250?l,混匀后,-20OC 静置 30min。4OC 离心 13500g×10min。弃上清液,沉淀用 7 5%乙醇 100?l 洗涤,4OC 离心 13500g×2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入 50?l 杂 交缓冲液溶解沉淀,4OC 下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。(参见本 节电泳步骤)。

2.杂交

(1) RNA 提取后溶解在杂交缓冲液中,浓度为 1?g/?l。

(2)取 8?l RNA 加入 1-3?l 探针(根据探针检测结果调整)于 0.5ml 离心管中。

(2) 80OC 保温 2min,然后 40-45OC 下杂交 12-18hr。

3. 消化

(1) 杂交管于 37 OC 保温 15min,加入 RNase 消化液,37 OC 保温 30min。

(2) 加入 10%SDS 10?l、10?g/?l 蛋白酶 K 20?l,混匀,37 OC 保温 10min。

(3) 加入 65?l 饱和酚和 65?l 氯仿,混匀,室温离心,10000g×2min。

(4) 转移上层液到另一 0.5 离心管中,加入 10?l 酵母 tRNA 和 3M NaAc 15?l,再加入 200?l 异 丙醇,混匀后,置-20OC 30min,4 OC 离心,135000g×10min。 (5) 弃上清液,室温下挥发乙醇,加入 5-8?l 上样缓冲液溶解沉淀。 4、电泳与放射自显影 (1)配制凝胶:(50ml) 40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺(19:1) 6.25ml 5×TBE 10ml 尿素 24g 加 H2O 至 50ml 溶解后加入 25%过硫酸胺 50?l,TEMED 50?l,混匀,注入电泳槽中,插入梳,待胶凝固。 (2)预电泳 以 1×TBE 为上下槽电泳缓冲液,加上电压后进行预电泳,如果用测序电泳装置,电压应达 200 0v 以上,功率设定为 100w,温度设为 50 OC。待胶板温度达 50 OC 时,暂停电泳,准备加样。

(3)加样 将已溶解在加样缓冲液中的样品 80 OC 加热 2min,立即加样到胶孔中,电泳 1-2hr。(电泳条 件同预电泳)。 (3) 电泳结束后,打开胶板,用滤纸取下胶,覆上一层保鲜膜,放置于暗盒中,暗室红光下, 压上一张 X 片,盖上暗盒,-70OC 曝光 1-3 天。暴光结束后,将 X 光片显影、定影、水洗、晾 干。 三、注意事项 1.本实验大部分为 RNA 操作,注意 RNA 酶的污染。 2.RNase 消化液消化未杂交的单链 RNA 和探针 RNA,当探针与样品之间有碱基错配时,错配 位点也将被消化,因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行 PCR 时,采取尽量减少错配的措 施。 3、 同位素对 RNA 合成有一定影响,有时会产生非全长的探针。因此,标记时间不宜过长。

4、 RNase 消化液有时会产生过度消化而无检测信号,可以将消化液稀释 10-100 倍后使用。

可能问题出在标本的保存:一般四小时之内就应处理,分离出细胞 说的是套式 PCR,可以在你的第一次 PCR 两个引物内,再设计一对引物进行第二次 PCR 就行了 如果你的第一次 PCR 刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了 第二次的引物设计要求可以低一点 以 50?l 体系为例 引物各 1?l 第一次 PCR 产物 5?l 二次 PCR 和巢式 PCR,即设计两对引物进行扩增,不是一个概念,它是拿第一次的 PCR 产物, 稀释 100-1000 倍做模板,加入底物,从新进行扩增反应,以期增加产物的量 我做 RT-PCR 时,提总 RNA 时,都是用灭菌 DEPC 水,按 1:100 稀释后测 OD260 和 OD280,后根据 公式:RNA 浓度=OD260*稀释度/25(ug/ul),后用 1mg total RNA 分离 mRNA.做逆转录及 PCR,效 果很好. luoyu10 wrote: 各位大哥: 我有一个问题请教, RT-PCR 要求模板 RNA 的 260nm/280nm 的比值最低为多少,如果太低是不 是会影响结果? 最低到 1.8,最好 2.0,我感觉稍微低一点影响不算太大。 问:我是RT-PCR的新手,想请教引物如何设计? 好的引物所具有的令人满意的特点: * 典型的引物 18 到 24 个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目 的序列位点的可能性。但是长度大于 24 核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能 会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。 * 选择 GC 含量为 40%到 60%或 GC 含量反映模板 GC 含量的引物。 * 设计 5'端和中间区为 G 或 C 的引物。 这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。 * 避免引物对 3'末端存在互补序列,这会形成引物二聚体,抑制扩增。 * 避免 3'末端富含 GC。设计引物时保证在最后 5 个核苷中含有 3 个 A 或 T。 * 避免 3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 * 避免存在可能会产生内部二级结构的序列,这会破坏引物退火稳定性。 目的序列上并不存在的附加序列, 如限制位点和启动子序列, 可以加入到引物 5'端而不影响特异 性。当计算引物 Tm 值时并不包括这些序列,但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。 有时候,仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如,如果仅知道氨基酸序列,可以设计简并 引物。 简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。 为了增加特 异性,可以参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏好,减少简并性。次黄嘌呤可以同所 有的碱基配对,降低引物的退火温度。不要在引物的 3'端使用简并碱基,因为 3'端最后 3 个碱

基的退火足以在错误位点起始 PCR。使用较高的引物浓度(1?M 到 3?M),因为许多简并混合 物中的引物不是特异性针对目的模板。 【经验】如何确认 RNA 的质量 各位都知道,提取到质量良好的 RNA(包括总 RNA 和 mRNA,以下同)是非常困难,关于 RNA 的提取技术,我就不说了,为什么呢?或许各位非常关心呢,我是这样想的,我可以看到的资料 或者是厂家的说明书,各位也同样可以看到的,内容当然都是一样的了,所以实验做的好不好, 主要是心的投入多少的问题,所以希望大家自己多多思考啊! 以下两种方法,相信大家都知道的: 1)检测 RNA 溶液的吸光度 280、320、230、260nm 下的吸光度分别代表了核酸、背景(溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白等 有机物的值。一般的,我们只看 OD260/OD280(Ratio,R)。 1.82.0 时,我们认为 RNA 中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的,不过要注意,当你用 Tris 作为缓冲液检测吸光度时,R 值可能会大于 2(一般应该是<2.2 的)。当 R<1.8 时,溶液 中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显, 你可以根据自己的需要决定这份 RNA 的命运。 R> 当 2.2 时,说明 RNA 已经水解成单核酸了。 如果 RNA 的量够,可在 260nm(A260)用分光光度法测定 RNA 的得率,1 个单位等于 40ug/ mlssRNA。纯 RNA 的 A260/A280 的比值为 2.0。A260/A230 的比值还表明 RNA 的纯度,其值小 于 2.0 表明裂解液中有亚硫氰胍和 belta-巰基乙醇残留,其值大于 2.4,需用乙酸盐,乙醇沉淀 RNA。 2)RNA 的电泳图谱 一般的,RNA 的电泳都是用变性胶进行的,但是根据我的经验,如果你仅仅是为了检测 RNA 的 质量是没有必要进行如此麻烦的实验的,用普通的琼脂糖胶就可以了。 电泳的目的是在于检测 28S 和 18S 条带的完整性和他们的比值, 或者是 mRNA smear 的完整性。 一般的,如果 28S 和 18S 条带明亮、清晰、条带锐利(指条带的边缘清晰),并且 28S 的亮度 在 18S 条带的两倍以上,我们认为 RNA 的质量是好的(见下图)。 以上是我们常用的两种方法,但是这两种方法都无法明确的告诉我们 RNA 溶液中有没有残留的 RNA 酶。如果溶液中有非常微量的 RNA 酶,用以上方法我们很难察觉,但是大部分后续的酶学 反应都是在 37 度以上并且是长时间进行的。这样,如果 RNA 溶液中有非常微量的 RNA 酶,那 么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了,当然这时你的实验也就完 了。 下面,我们介绍一个可以确认 RNA 溶液中有没有残留的 RNA 酶的方法。 3)保温试验 方法很简单的,按照样品浓度,从 RNA 溶液中吸取两份 1000 ng 的 RNA 加入至 0.5 ml 的离心 管中,并且用 pH7.0 的 Tris 缓冲液补充到 10 ul 的总体积,然后密闭管盖。把其中一份放入 70℃ 的恒温水浴中,保温 1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存 1 h。 时间到了之后,取出两份样本进行电泳。电泳完成后,比较两者的电泳条带。如果两者的条带一 致或者无明显差别(当然,它们的条带也要符合方法 2 中的条件),则说明 RNA 溶液中没有残 留的 RNA 酶污染,RNA 的质量很好。相反的,如果 70℃保温的样本有明显的降解,则说明 RN A 溶液中有 RNA 酶污染。 如果你的 RNA 样本通过了保温实验的检测并且你在后续的实验中还是非常小心的防范 RNA 污 染.

RT-PCR 之我见
发布日期:2007-7-10 热门指数:8525 分享 | 收藏

本文讨论的范围包括 RNA 酶保护分析,northernblot,原位杂交,半定量 RT-PCR 和定量 RT-P CR。本文不谈具体 protocol,是因为各种书籍和 kit 说明书上都有,主要说一些原则,而且大部 分是失败和成功的经验,还有小组讨论结果以及各种书里七零八落看的内容,希望对大家有用。

基因表达的定义:说到基因表达,是指 RNA,还是蛋白?是指 mRNA 还是包括风头正旺的非编 基因表达的定义: 码 RNA?mRNA 还有不翻译的 RNA 呢。应该说转录水平指的是 RNA 水平,而蛋白应该叫翻译水 平?我们这里就特指编码蛋白的 mRNA 的量的检测吧!

方法:很多很多,我们常用的也就是 RT-PCR 和 northern。RNA 没保护分析在国外很常用,也 方法: 有半定量的功能,一次性试剂盒还能以此将一个表达簇一起分析,例如 NFkB 的转录激活谱中的 8 个常见基因。dot blot 的最大贡献是发展到了反向 dot blot 的顶峰――曾经无限时髦的基因芯 片,而原位杂交的放大效应和它的假阳性使它的定量(半定量,应该根本算不上定量),用它定 位和用蛋白定位的意义不可同日而语, 又难做, 只有新发现的基因可以在没有得到蛋白和抗体的 情况下进行组织或者细胞定位。 先谈谈 RT-PCR 吧。关于原位杂交和 dot blot 大家可以和我论战的,我曾经看到一篇公开发表 的文章把 dot blot 称为定量检测,是极端错误的。

1、模板均一性问题:愚见采用从 RNA 定量的方法似不妥,不要说 PCR 的本身的敏感度,即便 是在反转录就有差异,到了 cDNA 的分装和用于模板的取样,这些都不能保证准确,当然在反 转录阶段我们也经常控制在 1 或 5ug, 但这是为了再将来加样的时候保证大致差不多, 而且尽可 能地利用反转录酶,而且 RNA 定量本身即使用电泳也不是那么准,更不要说分光光度计,这里 说一下,我曾经看到有人说用分光光度计定量,这也不是很准确,分光光度计只是掌握大概,当 然用于反转录足够了,但是用于 rt-pcr 的定量这是不正确的,很不准的,RNA 也最好至少要用 电泳, 一方面定量, 另一方面可以看看完整性。 至于用分光光度计比较不同标本之间就更不准了。

2、RNA 制备:一般制备总 RNA 即可,有时需要制备 mRNA,个人认为初学者还是选择 Trizol, 大量制备采用传统的方法自己配, 实际上和 trozol 一样的, 有时效果还好, trizaol 也就是混一混, 但是优点在于质量保证,使用方便,效率高,根据不同组织用 trizol 一般可以提到全部 RNA 的 5 0%(别小看,这已经很高了)以上,有些可以到达 80%。mRNA 用 Qiagen 的柱子,别去自己 做 Oligo(dT)柱,太麻烦。是否用 DNAseI 根据基因的特点和引物的设计,能够跨内含子的就 不需要处理,处理还是很危险的哦。像这样的微量和也用不了多少次的实验,并且如果牵涉到样 品是无价之宝的时候,因该选好的进口试剂。谈到 RNA 的贮存实际上主要是温度,至于放在 T

RIZOL 中是不可取的,更不要说在胍里了,只-20 是不够的,至少-80,液氮最保险,想想, 在低温里,即使加上些 RNA 酶它也降解不了哇!qiagen 出了一种 easy 产品可用于保存标本, 但在常温也只是 1 天,所以低温才是首要的,抽的时候也是这样。

3、反转录:常规,取样尽量一致,如上所述,不是为了定量,是为了半定量 PCR 时图形的好 看。选择逆转录酶根据实验需要,少量的可用 Promega 的一种 1ug 的酶,多的我们用 invitrgen 的 5ug 的 II,当然有人说 Promega 和 Roche 的也不错,用过,的确可以,要不 Invitrogen 不像 当初 Gibco 时那么牛了,也降价打折了。反转录成功后就不必太小心了,放在那里都可以,想想 你还曾经 72 度灭活呢,是不是?要知道,杂合双链比 DNA 双链还稳定的。一般来说要扩增从 反转录到 PCR 全过程的长达 2kb 以上的片断是相当困难的事,很多长基因是通过随机引物库得 到的而不是通过 oligo (Td)得到的,不要说反转录,即使是 PCR 也是很困难的,不信可以从质 粒里试试,至于反转录,就更是天方夜谭了,除了酶的效率等,还有 RNA 的二级结构等因素,这就 要一些大公司的特殊的名贵的效果也未必好的酶了,Roche 和 Invitrogen 都有的.听天由命吧。

4、半定量 RT-PCR:重点,为什么是第 4 条?首先说明一下,半定量 PCR,我是指基于凝胶成 像分析的,定量 PCR 指实时 PCR。 实验设计: 实验设计:根据不同的实验,对于不同的基因要有不同的策略,还有不同的组织,选择不同的基 因的转录本,选择不同的看家基因,都各自不同,对于文献不可照抄。 引物: 引物:对于 RT-PCR 重要的是引物的位置,有两种方法,一种是上下游引物设计在跨内含子的 两个外显子的 3’端和下一个外显子的 5’端,这样不会在基因组上扩出来。第二种是我最喜欢的, 设计在两个离得远的外显子上,这样从基因组和 cDNA 上得到得不一样,可以一引两用。以上 原则对单外显子基因不使用,这是最好选择 DNAaseI 处理。另外,我们有一个好习惯,就是把 退火温度设计成一样的,这样每次做的时候不用“三查七对”,从冰箱里拿出就坐。另外 3'最后一 个碱基是很重要的。 昨天看到有人问 5‘端得问题,本来以为这是大家都知道的,也在这里顺便说说,表达水平检测和 开放读框没有关系,PCR 的位置不需要在读框里,相反 3’非翻译区反而同源性最低。而且如果 用的是 oligo( dT),用 3 端更保险。再说一句,我从不用软件,全靠两只眼睛看,每每用一个 上午,想想还有基因组呢,只看得两眼昏花。设计好以后,最好在查一下有没有同源序列,尤其 是一个家族的基因。

关于 mRNA 和蛋白的一致性,mRNA 是不能代替蛋白水平的分析的,因为还有翻译效率和 RNA 降解速度的影响, 当然还有蛋白的剪切和分解速度等等, 但是表达水平一般来说可以大致估计一 种基因的翻译产物的,有时。但二者不能混委一谈。

基因组问题: 如上所述, 可以不用处理基因组的。 但是如果是单外显子呢?曾经有以为朋友问我, 基因组问题: 她的样品中总是有基因组的污染,用 RNA 去 p 总能 P 出来。她先用 trizol 过两遍,再用 qiagen

过两遍,还能 P 出来。这是很多人碰到的问题,问题的关键是 TAQ(除了具有 DNA 指导的)还 有 RNA 指导的 DNA 聚合酶功能,所以是可以直接从 RNA 中 P 出来的!那就冒险让 RNA 高温一 下吧,只是 DNAase 处理时一定小心,买大公司的,保险一些,至少也应该是 takara 的,买液 体做好的,不要自己配,比起标本来,这时候银子已经退居其次了。

长度: 长度:我们认为 500 之内比较好,不受中间可能出现的各种序列和二级结构的影响。至于 eeflyi ng 说的跑的在前会弥散则可以用 2%的胶就行了。我一般是 250 左右。目的基因和内参照之间 的大小比例可以根据爱好和胶的浓度、 分辨率调整的。 如果是 250, 则相差 100bp 很好, 如果 4、 500 则差个 200bp 也可以。

内参照: 内参照:每一次一定要做内参。不作内参的结果是不可信的,实际上我想大部分半定量 RT-PC R 本身就是不可信的,不过我做的是可信的,因为我反复摸,重复做,每次作内参照,跟自己对 照,用不同的酶,不同的体系,作出同样的结果(基因表达结果,不是条带什么的)。 不管多少样品,内参不作,等于说比较珠穆朗玛峰和泰山的高度一样,没有海拔,泰山从地面的 高度和珠穆朗玛峰从青藏高原的高度没什么差别。PCR 一定要同时作,但是电泳可以不一起跑, 没有关系,记住,计算的是相对表达程度,再说一遍我的观点:1、半定量和定量 RT-PCR 做的 都是基因相对表达量, 不是绝对表达量, 除非你能准确知道来自多少细胞, 但是细胞还有死的呢。 2、以电泳为基础的半定量 RT-PCR 本身是不可信的,作为实验的粗筛是可以的,但不能作为最 终结果的,不过我的可以。3、半定量 RT-PCR 应该在两管中进行,除非内参基因和目的基因表 达相同,长度一致,目的扩增区域的 GC 含量相似,或者实在穷的要省 PCR 管和 Taq 酶。 解释一下: 解释一下:1、同一管中不是不可以,因为它有条件现同的优点,只要目的基因的扩增量和选择 的不同循环数的内参照基因的最终扩增产量大致相同就很好, 很拗口吧。 但是一管中的竞争抑制 实在是大问题,即使对照组一致了,咱做的是差异,总有不一致的,而且 PCR 的放大效应会把 芝麻 P 成西瓜的哦。在不同管中重要的模板的平均分配,这不用多说了把。2、相对和准确的问 题,PCR 的相对定量是因为引入了内参照,所以没有绝对定量一说,至于半定量和定量的区别 不是相对和绝对的区别, 而是准确和不准确的区别。 一般经常搞错的定量半定量和绝对量相对量 的概念,定量半定量是指检测准确度,而绝对量相对量是指基因在组织中的表达丰度,例如 No rthen 虽然不是很准(Northern 不是很好的金标准),主要是上样量的原因,不管使用 28s18s 定还是用 SB GAPDH 或者 β-actin 都是,但是 Northern 得出的是绝对组织丰度,而实时荧光定 量 RT-PCR 虽然准确(定量)但是得出的是相对表达丰度,不管使用 β-actin 还是用 18srRNA。 至于常规的通过跑电泳的所谓“定量”RT-PCR 那就远了去了。

另外,似乎有人认为要做的好,就要把条件摸得哈好的,一旦很好,就不更改,PCR 条件,徨 论 Taq 酶,窃以为实不足取,为何?我说的“摸”是指循环数和模板,如果连 taq 也要固定下来, 其不是别人重复不了了?因为检测的是相对量(反复强调),所以理论上在 PCR 过程和成像过 程只要在线性期,结果应该是差不多的,为什么不说一样是应为即使在线性期也是有差异的,大 家看看文后的我们做的定量 PCR 的图就知道了,在每个点的切线的斜率是不同的。

关于选择什么作为内参照的问题,实际上没有定论,个人认为,18s 优于 actin,不要跟我说 GA PDH,著名的 GAPDH 都可以说是肿瘤相关分子了,其它还有 tubulin 什么的,因该差不多,实 际上 actin 虽然相对来说很稳定的表达量,但我想在细胞分裂的过程中,需要骨架,因此 actin 等本身在不同细胞,不同组织、不同时期是变化的,我想,姑妄听之。作为骨架蛋白和细胞的分 裂发育是密切相关的,在不同状态表达是不同的,不同细胞等。之所以用 18s 是因为相对而言 核糖体 RNA 量相对稳定,因为它的功能是同整个基因谱有关的(负责装配),更重要的(我想 的)它在总 RNA 中占地比例高,所以更准确,就像你用某一种东西的数量去概括总量,应该选 那种多的,说一座房子是由 2000 块砖造成的,比说用 29 根梁更准确吧,当然你用的是 mRNA 就另当别论了。 摸:一定要摸,关键是摸,摸上 3、5 摸总是必要的,首先分开一个一个摸,然后再放到一起摸 (特指同管 PCR),直到摸的好了,还要考虑比较的不同的模板中的量,这就是因为下面谈到 的线性期和平台期的问题。 线性期和平台期: 线性期和平台期:根据上面摸的结果,选择线性期的起始周围的循环数作为 PCR 指数,这和定 量 PCR 中的原理是一样的,这相当于取线性期曲线的切线(是不是这样?)。线性期似乎因该 是指数期(我想的),只是因为 2 的幂和倍数正好一样?不要为了后期的亮度取线性期的晚期, 那样是不准的,文后复一张自备的定量 RT-PCR 的图参考就明白了。本来想把模板量单列的, 在这里说了吧,模板量应该越多越好,当然是指在条件允许和不影响 PCR 体系的情况下,也不 是指把 20ul 都加上,还要摸呢,对吧。一般来说 2ul 要比 1ul 好,很多人会问,过了一个循环 不久一样了么?不一样的,这和 PCR 本身的原理有关,什么原理我也不懂。就像到了线性期, 很多人会说,再加酶,实际上不是的,再加酶和 dNTP 还有引物都没用的,其实这些本身就是过 量的。 综合上面两点,说说下面一点: 综合上面两点,说说下面一点:一般摸出来的结果是什么呢?个人认为,再使用 1ugRNA 反转 录后用 2-4ul 为模板和使用 5ug 反转录用 1-2ul 为模板的情况下,一般目的基因很少超过 30 循环,著名的 β-actin 很少超过 25 循环,如果你看到有人用 actin 和 sb GAPDH 超过 28-30 循环的话,结果是不可信的,实际上即使超过 25 循环也是值得商榷的,肯定再 RNA 或者 cDNA 的步骤有问题,此时因该增加模板量,而不是增加循环数,即使目的基因要用 30 以上也要考虑 一下。对于想脾脏这样的组织,actin 甚至可能要低于 20 循环,实际上在后文谈到的凝胶成像仪 的检测范围之内,应该循环数越少越好。还是那句话,并不是在指数期就可以的。

提示: 提示:另外,不是很亮(跑电泳时)并不代表没有到平台期,再看看我们的做的定量 PCR 的图 就明白了,有些基因的平台期是达不到很高的(这不是因为荧光标记得影响),要看你摸的时候 不同循环的扩增产物的量之间的关系,在相邻之间的差异基本复合线性增长才是线性期。 一步法还是二步法:我一直不建议采用一步法,因为逆转录酶很贵,就做一次 PCR,多可惜啊! 还有 RNA。 而且反转录了之后可以做 10-20 次, 还可以摸条件找原因。 不要以为一步法是盒子, 实际上是一样的,操作没有什么不同,还没办法摸条件,早该淘汰了(特指 RT-PCR 过程中)。

对于少量的标本用 1ug 的反转录酶既可以了,或者用于预实验都是很好的,但是 P 的时候要多 加一点,之所以这些话总是不确定是因为还和你正在做的基因的风度有关。

关于凝胶成像分析: 关于凝胶成像分析:这是常人所未想的问题(晕倒一片),一般来说基于 CCD 的成像系统也有 这个问题,这就是 CDD 本身的工作原理和软件的质量,有的 CCD 是重复扫描的,有的软件是只 有 256 灰阶的,所以要注意上样量不要太多,当然也不要太少(以防看不到),否则会超出扫 描 CCD 和软件的分析范围,这和 PCR 到线性期就没有什么不同了。另外很多软件有手动调节, 这样的软件使用时要保持每次框起来的范围的大小的一致性, 不要造成太多的人为误差, 号召大 家不要任意修改数据。此外,紫外灯管的质量、光的强度、均一性和 CCD 距离、焦距、分辨率 都要注意。如果有钱买冷 CCD 当然最好了,不过其实一般用不着。实在不行的,拍了照再扫描 再用 photoshop 分析也未尝不可,但是那可是很不准的,中间不周太多,而且如果是热敏打印 机很容易亮度饱和的,不一定会有灰阶。

PCR 反应:常规 PCR 什么的,实际上 Mg2 什么的没有那么重要的,退火温度什么也没有什么 反应: 的。别忘了两对引物的退火温度相同哦,即使在两管中也要这样,因为在一台 PCR 仪上,如果 在一管中,还要考虑 4 条引物之间不互补。

复孔的问题: 复孔的问题:其实用这个办法很容易解决一些判断问题,作三个复孔很好,这在定量 PCR 常用 对吧?但是如上文所属,如果模板足够多,这步可以省去去的。

定量 PCR:其关键在于准确和起始模板可以微量,但也只是相对定量,特指 RT-PCR,这里不 讨论根据标准曲线检测基因啊病毒啊什么的绝对值。为什么是准确的相对定量,我再废话一会 a gain,是指你不知道你的模板来源是多少,所以才用 GP 内参,话说回来,及时你知道多少个细 胞,还有细胞生死的问题对不?这就是为什么说 northern 是不很准确(没有定量 PCR 准确)的 绝对定量,是因为 northern 的模板多,综合分光光度计和 28s/18s 更复合实际情况些,尤其是 在不同组织分布的研究中更有效。 1、 原理:毕竟,PE 是定量 PCR 的鼻祖,而且型号也一直在推陈出新。bio-rad 和 roche 的也 是很强的,各有优势,大家还是比一比,价格、功能、性能、服务,尤其是技术支持,有些公司 的技术支持强可以帮我们很多忙的。还有最近基因公司也有一种新的不错的。 2、 Taqman:常见原则,方法简单,原理易懂,结果可靠。同管不同管和上面一样的,只是还 多了问你的仪器有没有双波长检测滤镜,而且双波长有时在一管中也有影响。 3、 仪器选择:PMT 和 CCD 各有千秋,不要听信一家之言。能兼容 96 孔板和普通 PCR 管的最 好,96 控板便宜而且一致性较好,至于边缘效应实际上没有那么明显得,只要做个对照就明白 了。最好能兼容各种方法、试剂和耗材的,以防后“费”无穷。速度不重要,但是其中一家公司的 变性时间短也是不容小觑的优势,对整个实验速度还有 TAQ 酶的影响小,当然没有也没大关系, 毕竟 taq 现在都很好。

4、 结果分析:要注意不同的探针的标记效率,分开设域值线还是放在一起要根据实际情况, 即目的基因和参照基因的 CT 值的差距,CT(还是 T,很想 CS 嘛)的倍数也可以改的。

总结一句,(我最在行的)半定量 RT-PCR 一般来说基本上是 g p。
随机引物 适用于长的或具有发卡结构的 RNA。适用于 rRNA、mRNA、tRNA 等所有 RNA 的反转录反应。 主要用于单一模板的 RT-PCR 反应。 Oligo dT 适用于具有 PolyA 尾巴的 RNA。 (原核生物的 RNA、真 核生物的 Oligo dT rRNA 和 tRNA 不具有 PolyA 尾巴。 )由于 Oligo dT 要结合到 PolyA 尾巴上,所以对 RNA 样品的质量要求较高,即使有少量降解也 会使全长 cDNA 合成量大大减少。 基因特异性引物 与模 板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况。天为时 性引物 代公司的 SuperScript One-Step Syste m 特别适合于与基因特异性 引物连用。

增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小, PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异 性扩增带与非特异性扩增带。 性扩增带与非特异性扩增带。
原因 引物特异性差 引物 引物浓度过高 建议 重新设计引物,改变引物的位置和长度,增强 其特异性或使用巢式 PCR 适当减少引物浓度 适当降低 Mg 浓度,从 1mM 到 3mM,间隔 0.5mM Mg 浓度
2+ 2+

Mg 浓度过高

2+

进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对 的最佳镁离子浓度。

耐热聚合酶 退火温度 PCR 循环次数

酶量过多 退火温度过低 PCR 循环次数过多

以 0.5U 为间隔适当减少酶量 适当提高退火温度或采用二阶段温度法 减少 PCR 循环次数

4. 操作多份样品时,制备反应混合液,先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减 少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度; 5. 最后加入反应模板,加入后盖紧反应管


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