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RNA干扰技术及其应用


RNA 干扰技术及其应用 柳满 生物制药 1201 1202150124 摘要:1998 年 Andrew.Fire 和 Craig C.Mello 发现双链 RNA 可以抑制线 虫同源基因的表达使基因沉默,并且沉默可遗传给后代。现将这类小干扰 RNA 分子可以高效、特异地阻断体内同源基因表达,促使同源 mRNA 降解,诱使细 胞表现出基因缺陷的表型现象称为 RNA 干扰。本文从 RNAi 的发现、机制、生 物学功能、应用来论述 RNAi。转基因沉默现象最初在植物中被发现。RNAi 的 作用机制: dsRNA 进入细胞内被 Dicer 酶切割成 siRNA。 siRNA 的双链结构被解 螺旋与沉默复合物形成复合物,siRNA 双链被解开,然后特异性结合到靶 RNA 上,切割 RNA。mRNA 剪切过程中新形成的 21-23 个 siRNA 又可以进入下一轮 循环而达到扩增效应的目的。生物学功能:沉默、机体内源性基因表达。 RNAi 的应用:基因功能的研究、基因剔除、医学方面的应用、RNAi 药物。 关键词:基因沉默 RNAi siRNA miRNA

以前我只知道遗传物质有 DNA、RNA,亦只知道 RNA 的功能是转录。但 随着知识的增多, 我了解到原来蛋白质也是一种遗传物质, 例如 Prion 蛋白。 Prion 学说的出现使得蛋白质不仅体现生物学功能,而且可储存遗传信息。 PrPC 蛋白 高级结构的改变不仅可造成蛋白功能的变化, 在某种意义上还是遗传信息传递的 方式。我亦知道了不是所有的 RNA 都是单链的,更知道了 RNA 的功能不仅仅 只是转录。通过学习分子生物学检测技术,我知道了 RNA 干扰现象的发现、作 用机制、应用等。1998 年 Andrew.Fire 和 Craig C.Mello 发现双链 RNA 可以 抑制线虫同源基因的表达使基因沉默,并且沉默可遗传给后代。现将这类小干扰 RNA 分子可以高效、特异地阻断体内同源基因表达,促使同源 mRNA 降解,诱 使细胞表现出基因缺陷的表型现象称为 RNA 干扰。2006 年 10 月 2 日,瑞典皇 家卡罗林斯卡(Karolinska)医学院宣布,将 2006 年度诺贝尔生理学或医学奖授予 两名美国科学家安德鲁·费里(Andrew.Fire)和克拉格·米洛(Craig C.Mello), 以表彰他们在 1998 年的重要发现。瑞典皇家卡罗林斯卡医学院在颁奖声明中宣 称,费里和米洛的发现能解释许多令人困惑、相互矛盾的实验结果,并提示了控 制遗传信息流动的自然机制。RNAi 的很多领域还是未知的,这有待于我们一代 一代人的不断努力,去揭开其神秘的面纱,为我们自己提供更好的医疗条件等。

一.RNA 的起源 秀丽新小杆线虫中的 RNAi 途径 转基因沉默现象最初在植物中被发现。 研究人员在植物中导人额外的产生特 定色素的基因,试图创造一种深色的花朵,结果发现,所有导入的额外基因连同 内源性基因都被沉默(Napoli et a1.,1990;Van der Krol et a1.,1990)。线 虫中的转基因通常能在成体组织中表达,而在幼虫中表现沉默(Kelly and Fire, 1997)。共抑制,即沉默和转入片段序列相同的内源基因,这一现象也在线虫的 幼虫中被观察到(Ketting and Plasterk,2000;Dernburg et a1.,2000)。在秀丽新 小杆线虫的每个细胞中导人几个小分子 dsRNA(Fire et a1.,1998)就能产生显著 的反应。这一结果表明在整个生物体中存在着一条应答基因沉默的调控通路。 Mello 实验室检测得到两类 RNAi 缺陷型(rde)突变体(Tabara eta1..1999)。第一 类由 rde-1 和 rde 一 4 组成,仅涉及 RNAi 途径,不参与其他过程。第二类突变 体包括 rde-2、rde-3 和 mut 一 7,它们仅参与幼体的 RNAi 过程。这类突变体也 具有一个增变突变体的特征, 即雄性线虫常表现为温度依赖的不育,而生殖细胞 却呈现正常沉默的转位子的移动(Collins et a1.,1987;Kettinget a1.,1999)。 Ketting 等人于 1999 年证实多数增变突变体不发生基因沉默。秀丽新小杆线虫中 RNAi 的重要特征之一是具有可遗传性。将靶向调节母体中胚胎发育基因的 dsRNA 注入雌雄同体线虫内会导致母体中的胚胎死亡。然而,RNAi 效应不会瞬 间生效,大约 12h 后生物体发生变化,继而导致后代死亡。在注射后 4~12h 产 生的后代也可能受到影响,因此,当它们成年后会产下死亡的卵。这种生物体称 为 RNAi 效应“携带者”。Kell 和 Fire 证明导入线虫的 DNA 序列的可遗传特征 是由于有效的基因沉默,同时他们也证实只要转基因与基因组 DNA 混合后一起 注入就能获得表达线虫幼虫转基因的转基因动物。 其他研究组报道利用粒子轰击 而不是传统的注射方法所得到的转基因动物能够持续表达单拷贝的转基因 (Praitis et a1.,2001)。 二.RNAi 的作用机制 1.起始阶段 在起始阶段,外源的 dsRNA 通过导入或者转基因、病毒感染、 转座子活化及特异重复序列及特异重复序列或其他未知方式进入细胞。引入的 dsRNA 被核酸酶 RNnase III 家族中特异识别,后者以一种 ATP 依赖的方式逐步 将 dsRNA 切割成长 21-23 个核苷酸的有正反义链组成的双链小分子干扰 RNA,且

每条单链的 3'd 都带有 2 个突出的非配对碱基(多数是 UU)。siRNA 是识别靶 RNA 的标志,它的生成启动 RNAi 反应。 2.效应阶段 siRNAs 的双链结构需被解螺旋后组装到 RNA 诱导的沉默复合 物中,形成一复合物,此复合物由内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源 RNA 搜索活性蛋白 4 种蛋白成分组成。在 ATP 存在下,该复合物中解旋酶活性将 siRNA 双链解开,并定位到 siRNA 的反义链互补的靶 RNA 转录本上,在距离 siRNA 双链 3'端 12 个碱基的位置切割 mRNA. 3.倍增阶段 以往许多实验发现仅需少量 siRNA 即可引起强烈的同源基因表 达抑制,研究者推测在 mRNA 剪切过程中产生的 21-23 个核苷酸片段可能会作 为新的 siRNA 而继续参与 RNAi 过程,从而使干扰作用放大,存在倍增放大机 制。 我对于机制简单的理解既:dsRNA 进入细胞内被 Dicer 酶切割成 siRNA。 siRNA 的双链结构被解螺旋与沉默复合物形成复合物, siRNA 双链被解开, 然后 特异性结合到靶 RNA 上, 切割 RNA。 mRNA 剪切过程中新形成的 21-23 个 siRNA 又可以进入下一轮循环而达到扩增效应的目的。 关于扩增反应:最近,至少在一些研究中发现扩增反应的存在。次级 siRNA 可能通过称为过渡性 RNAi(transitiveRNAi)的机制产生。其过程可能是 siRNA 或短的反义 RNA 可发挥启动特异性依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶(RdRP)合成与被靶定 序列互补的 RNA(cRNA)共同重新合成产生 dsRNA 的作用,然后通过 DCR 裂解成新 的 siRNA。也有新的证据表明有些 RdRP 也能非常高水平地进行特异性转录或在 检测到如病毒入侵的异常 RNA 存在的情况下不需要启动子就能产生 cRNA。最早 提出的这种设想是用来解释植物转基因产生的 PTGS 现象。推测对细胞带来的优 势是更多的 mRNA 引发并导致更多的靶基因失活,使得细胞更有效地清除感染的 病毒。 三.RNAi 生物学功能 RNA 沉默突变体的筛选最早是在放线菌中进行的,最近在线虫和果蝇中也有 所发展,并导致确定了几种 RNAi 应答相应蛋白质必需的基因,包括 DCR、RdRP、 RISC 及各种解旋酶等。沉默包含的连续遗传学途径分析阐明了这些不同功能成 分发挥作用的前后顺序及一些新的功能。有些 RNAi 相关基因缺失突变表现出一

些表型,包括增强了对病毒感染的敏感性,增加了‘倒 C 跃,,因子的移动,发 育时序的缺失,有丝分裂和减数分裂的缺失,不育和其他一些发育过程的缺陷。 这些表型对进一步增强对 RNAi 功能的理解具有重大意义。 最激动人心的发现之一是 RNAi 调控有机体内源性基因的表达。这种内源性 RNAi 作用是由机体基因组编码的一类小的调控性 RNA(microRNA,miRNA)所介导 的。 这种 miRNA 多数情况下与靶 mRNA 的 3 个非翻译区(3, untranslatedregion, 3'UTR)完全互补结合, 有些 miRNA 功能上类似 siRNA, 整合入 RISC 并导致靶 mRNA 裂解。不过,许多 miRNA 可能通过其他替代途径发挥作用,它与靶序列并不完全 互补结合,因而不影响靶 mRNA 稳定性,而是通过干扰翻译过程而阻止编码蛋白 质的合成。最近发现,这种干扰性 RNA 与靶 mRNA 的错配及甲基化的部位至关重 要,miRNA 在与靶位杂交过程中,其与靶序列的错配发生在结合区中间部位从而 形成“U”形区域,影响其靶基因的翻译过程。 假如 siRNA 分子能有效地结合其靶序列(序列配对及其空间结构决定), 那么 siRNA 分子还可以导致靶 RNA 分子的切割。已有证据表明单一结合位点也可介导 翻译过程的抑制或下调。然而,let-7miRNA 的内源性靶分子的 YUTR 含有多个与 其结合的位点, 这提示有些情况下,单一结合的情况可能不足以抑制靶基因的表 达。 miRNA 与 siRNA 的区别 相同点:1.二者的长度都约在 22nt 左右。2.二者都依赖 Dicer 酶的加工, 是 Dicer 的产物,所以具有 Dicer 产物的特点。3.二者生成都需要 Argonaute 家族蛋白存在。4.都与 RISC 形成复合物起干扰、调节作用。5.都可在转录后, 翻译水平上干扰靶 mRNA。 不同点:1.根本区别是 miRNA 是内源的,是生物体的固有因素;而 siRNA 是人工体外合成的,通过转染进入人体内,是 RNA 干涉的中间产物。2.结构上, miRNA 是单链 RNA,而 siRNA 是双链 RNA。3.在作用方式上,miRNA 可抑制靶标基 因的翻译,也可以导致靶标基因降解,即在转录水平后和翻译水平起作用,而 siRNA 只能导致靶标基因的降解,即为转录水平后调控。4.miRNA 主要在发育过 程中起作用,调节内源基因表达,而 siRNA 是抑制转座子活性和病毒感染。 四.RNAi 的应用

1.基因功能的研究 人类基因组测序完成,预测有 30000-40000 个编码蛋白 的基因,需要大规模高通量的研究手段。RNAi 能高效地特异地阻断基因的表达, 因而 RNAi 已成为研究基因功能的工具。例如:通过遗传学和分子生物学分析, 现已知在植物中 RNA 介导的基因沉默有三种途径: 细胞浆 siRNA 介导的基因沉默、 通过 miRNA 的内源性的信使 RNA 沉默、与 DNA 的甲基化后抑制转录有关。在染色 质水平 RNA 介导的沉默的一个重要作用可能是保护基因组免受由转座子引起的 损害。 2.基因剔除 为了解某个单个基因功能,常常人为地剔除无关的或不需要的 基因。但基因剔除技术操作技术复杂,而且 1 次只能一个基因,有时还可能导致 个体的早期死亡。RNAi 技术具有高效、特异、操作相对简便。效果稳定的优势, 并且一次课研究多个多个基因。 RNAi 已经被暗示参与了被称为“基因沉默的根 本形式” ——多余的 DNA 的程序性切除(theprogrammedexcisionofDNA)[so)。这 种现象已经在具有纤毛的原生动物中发现,这些生物在进行性接合的过程中,其 基因组进行广泛的重组。 3.基因治疗 RNAi 已作为一种新基因治疗法,被广泛应用于病毒感染、癌症 等研究中。 4.医学方面的应用 关于 RNAi 在医学中的应用,仍有很多问题有待解决。针 对特定疾病治疗的基因疗法的应用比最初的预期要缓慢得多。当然,存在许多潜 在的基因靶位可以利用 RNAi 进行治疗性干扰。现在已开始了在体内利用 RNAi 拮抗疾病进展的研究。例如,RNAi 敲除 Fas 基因或丙肝病毒基因组以保护小鼠 免于肝炎的侵害。目前,这方面的研究还主要致力于预临床前的阶段。 RNAi 药物 RNAi 药物有望治疗癌症,丙肝和艾滋病等病毒性疾病,甚至可能 用来治疗神经系统疾病。 第一个 RNAi 药物 bevasiranib(Acuity 公司)已经诞生, 用于治疗湿性老年性黄斑变性(AMD)。 美国 Alnylam 公司开发的 RNAi 药物用来治 疗呼吸道合胞病毒感染、流行性感冒、帕金森病和高胆固醇血症等,其中治疗呼 吸道合胞病毒感染的 RNAi 药物 ALN—RSV01 已进人 I 期临床; 默克公司研制的治 疗老年性黄斑变性的 RNAi 药物 Sirna 一 027 已经进入Ⅱ期临床;另外,PTC Therapeutics 公司开发的用来治疗实体瘤的以 VEGF 为靶点的 siRNA 药物 PTC 一 299 也已经进入 I 期临床。

我的感悟:尽管 RNA 不是主要的遗传的物质,但仍有其不可替代的作用:如 转录。说明任何事物的存在都是有道理的,没有什么会凭空存在或凭空消失,很 多时候我们不要妄自菲薄;小干扰 RNA 在 19981 才被发现,尽管被发现的很晚, 但其的作用是一直存在的,自从被发现后,引起了很多人的关注,这说明只要我 们有才,终究会被发现,只是时间的问题,而在被埋藏的那些日子里,我们需要 做的是不断沉淀自己,充实自己。在今后的学习中,我会多关注 RNAi 的进展和 其成功。或许将来有天,我亦会去研究其中的一个应用,但前提是我得从现在开 始积累相关知识,为以后做准备。 参考文献: 1.Prion——一种无核酸的微小生命体?董小平 中国预防医学科学院病毒学研所 2.RNA 干扰技术:从基础科学到药物开发(美)K.阿帕萨尼主编 殷勤伟等译,

3.双链 RNA 引起的基因沉默机制——2006 年诺贝尔生理学或医学奖成果简介. 4.RNA 干扰技术的研究进展 徐俊、毛颖、苗荻、郝佳 中国知识产权专利局专利审查协
作北京中心。 5.GunterM, ThomasT.Mechanisms Of gene silencing by double-stranded RNA. 6.RNA 干扰原理及应用 汤华主编 7.Wilson JA,Jayasena S,Khvorova A,et a1.RNA interference blocks gene expression

8.生物技术制药概论 姚文兵著 9.Development of new RNAi therapeutics, Histology and Histopathology


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