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生物技术遗传学实验指导



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人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备 小鼠骨髓细胞染色体标本的制备 人类染色体 G 显带技术 人类染色体 C 显带技术 核仁形成区银染技术 人类染色体 G 显带核型分析 X 染色质标本的制备 姐妹染色单体交换 微核检测技术 ABO 血型的测定及其基因频率的计算 苯硫脲尝味试验及其基因频率的计算 人类皮纹分析 遗传咨询 人类基因组 DNA 的提取 聚合酶链式反应(PCR) DNA 的琼脂糖凝胶电泳 PCR-RFLP 技术

《遗传学》实验须知
一、医学遗传学实验目的和要求 医学遗传学实验课是医学遗传学课程的重要内容。 实验课有助于加深和巩固基础理论知 识,并进一步了解和掌握本学科的基本实验内容和操作技能。在培养学生分析问题、综合问 题和解决问题能力方面具有重要作用。为此,要求学生做到以下几点: 1、实验课前做好预习,明确实验目的、实验原理。 2、复习有关理论内容。 3、熟悉实验的主要步骤。 4、初步估计和判定实验的可能结果。 二、实验操作过程中的注意事项 1、认真操作,仔细观察和综合分析实验所出现的现象与结果并及时记录。 2、如果实验结果与理论结果不一致,须及时进行科学分析,判断结果的可靠性,寻找 出现误差的原因。 3、各种实验试剂用后放回原处,瓶盖封严,轻拿轻放。 4、使用微量加样器时,一定调整好取用量,按使用要求操作。 5、实验室应保持肃静,注意清洁卫生,实验中用过的废弃物品要及时清理,避免堵塞 下水管道。 三、实验后的注意事项 1、实验后,整理清洁所用仪器、设备,注意放回原位,以备下次使用。 2、如有仪器损坏,要及时填写破损报告,并报告老师。 3、离开实验室前,检查并关闭门、窗、水、电。 四、实验室的意外处理 实验室如遇着火、烫伤等意外事件发生,必须镇静做紧急处理,并立即报告老师。 1、着火:如遇酒精灯推倒或其它原因着火,首先将一切易燃品移至远处,然后用水扑 灭或者切断电源。 2、火伤:皮肤被火灼伤,用烫伤软膏涂抹,如伤势较重,立即送医院治疗。 3、如有毒药品泼溅到皮肤上,如 EB,同位素等,应用大量清水进行清洗,必要时,去 医院处理。

4、割伤出血:遇玻璃割伤出血,可用碘酒或红药水消毒后,用纱布包扎。如有玻璃留 在伤口,处理前应先取出。

实验一 人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备
【目的要求】 目的要求】 1、初步掌握人体外周血淋巴细胞短期培养的基本方法。 2、初步掌握人体外周血淋巴细胞染色体标本制备的技术方法 【实验原理】 实验原理】 人体外周血淋巴细胞培养(人体末梢血、 微量全血短期培养)及其染色体标本制备是国内 外研究显示染色体最常用和效果最好的方法。此方法取材方便,用血量少,操作简便,现已 广泛应用于基础医学、临床医学的研究和染色体病的诊断等。 人体外周血中的小淋巴细胞,是已分化、处于 G0 期的细胞,几乎不具有分裂增殖能力。 在离体血培养细胞中很难找到正在分裂的淋巴细胞,因此,需采用刺激细胞增殖的措施。人 们发现从云豆(菜豆)中提取的植物血球凝集素(植物血凝素,PHA)可以刺激小淋巴细胞进行 有丝分裂,即在 PHA 作用下,处在 G0 期的小淋巴细胞可转化为淋巴母细胞。淋巴母细胞具 有分裂能力,重新进入增殖周期进行有丝分裂。在 PHA 作用下体外培养 72 小时左右,多数 淋巴细胞已处于细胞周期的第二周期。此时,细胞分裂相较多,但都处于分裂的不同时期。 一般来说,制作染色体标本主要是显示细胞分裂中期染色体,因中期染色体形态最为典型、 最为清晰,最易辨认,是研究染色体的最好阶段。为了获得大量可供分析的中期染色体,需 在终止细胞培养前数小时加入适当浓度的有丝分裂阻断剂——秋水仙素(或其衍生物秋水仙 胺)。它可特异地抑制纺锤丝的形成、阻抑分裂中期活动而使细胞分裂停滞于中期。借此可 获得大量中期分裂相细胞。 在进行染色体标本制备的过程中,首先要进行低渗处理,使细胞体积胀大、染色体松散 开而便于观察分析。最常用的低渗液为 0.075mol/L 的 KCl,也可用水或 1%枸橼酸钠等。 低渗后的细胞需用固定液固定。醋酸固定液具有膨胀、固定作用。它和醇类混合固定,有利 于染色体松散,可获得分散好、易于分析的分裂中期染色体标本。现在常用的固定液为甲醇 -冰醋酸(3:1)固定液。 【实验准备】 实验准备】 1、试剂 RPMI-1640 营养液、小牛血清、0.25% 胰蛋白酶、Hanks 液、双抗(青霉素、链霉素)、 2%碘酒、75%酒精、3.8%NaHC03、520U/mL 肝素、40μg/mL 秋水仙碱、PHA、0.075mol /L KCl 低渗液、甲醇、冰醋酸、Giemsa 染液、二甲苯和香柏油等。 2、器材 超净工作台、光学显微镜(附照相设备)、隔水式恒温培养箱、离心机、冰箱、高压蒸汽 消毒锅、鼓风干燥箱、无菌正压滤器、分析天平(感量 1/10 毫克)、架盘天平、链霉素培养 瓶及瓶塞、 肝素小瓶及瓶塞(取血用)、10mL 吸管、 直头小吸管、5mL 刻度离心管、2mL 或 5mL 一次性注射器、量筒、烧杯、搪瓷盆、搪瓷盘、试管架、片盘、片盒、止血带、棉签、大吸 0 球、小吸头、pH 试纸、废液缸、解剖剪刀、镊子、记号笔、4 C 预冷的载玻片、酒精灯、火 柴、染色缸或染色玻璃板和擦镜纸等。

【实验材料】 实验材料】 人静脉血 【实验内容、方法】 实验内容、方法】 一、采血 在采血前,对各种用品进行清洗、无菌处理,配制、分装并冻存培养液(5mL/瓶),用 5mL 注射器抽取肝素 0.1mL,备用。 常规消毒肘部皮肤,用抽取肝素的注射器静脉采 2mL,轻轻摇匀,待接种培养。 二、接种培养 将事先配制冻存的装有 5mL 培养液的链霉素培养瓶或其它培养瓶从冰箱中取出, 置室温 0 融化,每瓶滴入约 0.3mL 肝素抗凝血,轻轻摇匀,置 37 C 培养箱培养 72 小时。 三、积累分裂中期细胞 在终止培养前 2 小时,于培养瓶内加入浓度为 20μg/mL 秋水仙素 1 滴,终浓度为 0 0.1-0.15μg/mL,摇匀,置 37 C 温箱继续培养 2 小时后收集细胞、制片。 四、制片 1、收集细胞:从培养箱中取出培养瓶,用小吸管将培养物吹打均匀,移人 5ml 刻度离 心管内,以 2000r/min 离心 10 分钟,吸去上清液,保留底物。 0 2、低渗:每管加入 37 C 预温的 0.075mol/LKCL 溶液 4ml,用吸管轻轻吹打均匀,置 0 37 C 水浴锅中低渗 30 分钟,以达到红细胞破坏、淋巴细胞膨胀和染色体分散之目的。 3、预固定:低渗处理后,每管加入 1 mL 甲醇:冰醋酸(3:1)固定液,将细胞轻轻吹打 均匀,置离心机 2000r/min 离心 10 分钟。 4、固定(一):去上清液,加固定液 5mL,吹打均匀,固定 30min,2000r/min 离心 10 分钟。 5、固定(二):去上清液,再加入 5mL 固定液,吹打均匀,再次固定 30min,2000r/min 离心 10 分钟。 6、滴片:去上清液,留底物,每管加入少许(约 0.2mL)固定液,将底物吹打均匀,制 成细胞悬液。然后用吸管吸取混匀的细胞悬液,约以 20cm 或更高的距离滴至预冷的载玻片 上,每片约 2~3 滴,随即将玻片在酒精灯火焰上微烤(一过性微烤数次),以助细胞、染色 体分散,使之均匀平铺于玻片上。将制片放人片盘,空气干燥后,收集于片盒中。 7、 染色和观察: 待制片晾干后, 放入约 1:10 Giemsa 染液的染色缸中染色 15 分钟左右, 或架在染色用玻璃板上扣染 15 分钟左右(扣染是指染色时, 将染色体制片的细胞面朝下, 架 在玻璃板上,将染液滴入玻璃板和细胞面之间),自来水轻轻冲洗,晾干后光镜下观察。先 用低倍镜观察后,选择分散好的染色体换为高倍及油镜观察,注意人类核型中近端、亚中和 中着丝粒染色体的形态特点。 【注意事项】 注意事项】 1、有关淋巴细胞培养的注意事项同实验十二。 2、PHA 的质量是人体外周血淋巴细胞培养成败的关键,不同来源或同一厂家的不同批 号、不同的保存时间,PHA 的效价可能会有较大的差异,直接影响培养细胞中分裂细胞的数 量。故每批 PHA 正式使用前,须进行一次预实验,摸索 PHA 的质量和使用量。其使用量不宜 过大,否则会导致红细胞凝集。一般,自己直接从菜豆中提取的 PHA 效果较好。 3、接种的血样标本愈新鲜愈好。肝素用以抗凝,用量不宜过多。 4、秋水仙素用量和作用时间要适当。该药有强烈的毒性作用,用量过大、作用时间过

长,可使染色体缩短和发生异常分裂现象,甚至染色体破碎。 5、低渗是制片好坏的重要环节。低渗液用量的多少与作用时间的长短都会影响染色体 的制片质量,如染色体分散不好、有胞浆背景,或细胞破损、染色体丢失等。要注意低渗液 0 使用前需 37 C 温箱预温。 6、低渗后的预固定也很重要,预固定时,固定液量不要多,加入固定液后要立即用吸 管吹打均匀, 用力不要过猛。 另外两次固定时, 固定液也不要过多, 吹打时用力也不要过猛, 以免细胞破碎,染色体丢失。固定液要在使用时配制。 7、最后的滴片也是染色体制片好坏的很关键的一步。载玻片上有油污或预冷不够,或 滴片时所滴悬液重叠、操作不好,或底物悬液过浓等都直接影响细胞、染色体的分散。底物 悬液过稀或酒精灯上烤片时间太长, 都可能造成制片中可供分析用的染色体很少, 甚至找不 到染色体。 【实验报告】 实验报告】 1、血培养中 PHA 所起的作用是什么?秋水仙素的作用是什么? 2、简述血培养和外周血淋巴细胞染色体标本制备的过程。

实验二

小鼠骨髓细胞染色体标本的制备

目的要求】 【目的要求】 1、初步掌握实验动物骨髓细胞染色体标本的一般制备方法(直接法)。 2、了解小白鼠染色体的形态特征及其数目。 实验原理】 【实验原理】 骨髓细胞具有旺盛的分裂增殖能力。 在骨髓细胞中, 有丝分裂细胞所占的比例比一般细 胞大。为了积累更多的有丝分裂中期细胞,可在收集细胞前进行秋水仙素处理。 通过制备的骨髓染色体标本,可以观察毒性物质在体内对细胞染色体的影响。同时,在 检测环境致突剂方面,也有其独特的优点。方法简捷、直接,易于掌握,一般实验室均可进 行。因此,此法也是用动物实验检测有害物质对机体遗传物质损伤的实验方法之一。 实验准备】 【实验准备】 1、试剂 0.04%秋水仙素、0.075mol/L KCl、甲醇、冰醋酸、Giemsa 染液、香柏油、二甲苯等。 2、器材 光学显微镜、恒温培养箱、离心机、架盘天平、酒精纱布及其它一般用品。 【实验材料】 实验材料】 健康小白鼠(体重约 20 克) 实验内容、方法】 【实验内容、方法】 1、取材和低渗 取材前 3~4 小时,于小鼠腹腔内注入 0.04%秋水仙素 0.1mL/10g 体重,以积累中期 分裂相。断颈髓法处死小鼠,取其股骨,用酒精纱布清除其上粘附的肌肉及结缔组织,并用 剪刀剪去股骨两端少许骨骺及骨皮质,暴露骨髓质,用注射器抽取 0.075mol/L KCl 5mL 冲洗骨髓腔, 将冲洗后的液体收集到 5mL 离心管中, 反复冲洗两次以上, 至骨髓腔变白为止, 0 将冲洗液吹打均匀后置 37 C 恒温箱低渗处理 20 分钟。 2、预固定

取出低渗后的离心管,加入 2~3 滴预固定液(甲醇:冰醋酸=3:1),立即吹打均匀,平衡 后用离心机 2500r/min 离心 5 分钟,去上清液,留底物。 3、固定一 加固定液 5mL 于离心管中,吹打均匀,室温固定 10 分钟后,2500r/min 离心 5 分钟。 去上清液,留底物。 4、固定二 再加固定液 5mL 于离心管中, 吹打均匀, 室温固定 10 分钟后, 2500r/min 离心 5 分钟。 倾去上清液,加入少许(约 0.5mL)固定液。 5、滴片 将沉淀物吹打均匀后,吸于滴管内,滴在预冷的载玻片上,每片 2~3 滴,酒精灯上烘 烤一下,放在片盘上,晾干后装入片盒中。 6、染色和观察 1:10 的 Giemsa 染液染色 15 分钟后,自来水冲洗。待制片干燥后置显微镜下观察。小 鼠染色体形态数目与人类染色体不同,小鼠全部为端着丝粒染色体,2n=40。 【注意事项】 注意事项】 1、在用酒精纱布处理股骨上的软组织时,不要使组织块掉入离心管中。 2、可参照实验十四染色体标本制备过程中的注意事项。 实验报告】 【实验报告】 1、小白鼠腹腔内提前注射秋水仙素的意义是什么? 2、叙述小鼠骨髓细胞染色体标本的制备过程(直接法)。

实验三

人类染色体 G 显带技术

【目的要求】 目的要求】 初步掌握染色体 G 显带制备的基本方法。 实验原理】 【实验原理】 自 20 世纪 60 年代末以来,染色体显带技术得到了很大的发展。人们用物理、化学的方 法处理染色体标本, 再用染料对染色体进行分化染色, 使其呈现出明暗相间或深浅不同的带 纹。这一技术的应用,可以准确识别 23 对不同类型的染色体,并能识别同一号染色体上的 不同区带。 从而提高了染色体核型分析的精确度, 为临床上某些疾病的诊断提供了有效的手 段。 关于 G 带的形成机理,迄今尚不十分清楚。有人认为,在胰酶的作用下,蛋白质不均匀 丢失是 G 带产生的原因。 在染色体上的蛋白质经处理而丢失后, 这些区域呈现出浅染(浅带)。 染色体上蛋白质和 DNA 结合牢固的区域, 由于蛋白质丢失少而呈现深染(深带)。 还有人认为, 染色体经蛋白酶消化后, 染色体的核蛋白破坏, 这些区域裸露的 DNA 分子的磷酸基团能与吉 姆萨染料中的天青和甲基蓝等噻嗪分子结合而使染色体着色。也有人认为,染色体上 T—A 和 C—G 碱基的含量和分布不同, 也与染色体上深浅带的形成有关。 A—T 碱基对较多的区域, 易与吉姆萨染料结合而染成深色区带;而 G—C 碱基对较多的区域则相反,染成浅染区带。 总之,目前说法较多,但主要概括了三种观点,即显带是由于:①DNA 的作用;②蛋白质的 作用;③DNA、染料和蛋白质三者之间相互作用的结果。这些都有待于进一步研究探讨。可

以肯定,G 显带具有很多优点,如制备方法简便易行,标本可长期保存,带纹清晰,成本低 廉,制备周期短,普通光学显微镜即可观察。故已成为当今细胞遗传学与分子细胞遗传学领 域中应用广泛的一种技术,并成为研究分析染色体的主要常规方法之一。 【实验准备】 实验准备】 1、试剂:0.85%生理盐水、0.025%胰蛋白酶溶液、吉姆萨染液、3.8%NaHC03、二甲 苯、松柏油等。 0 2、器材:普通光学显微镜、37 C 水浴箱、普通冰箱、立式染缸、直头小吸管、橡皮吸 头、pH 试纸、吸水纸(滤纸)、扣染玻璃板、擦镜纸、镊子等。 人类中期染色体标本制备用试剂和器材同实验十四。 【实验材料】 实验材料】 常规方法制备的人类中期染色体标本制片(片龄 3~5 天最宜)。 【实验内容、方法】 实验内容、方法】 0 1、 首先将配制好的 0.025%胰酶溶液装入立式染色缸中,调 pH 值至 7.0~7.2,放人 37 C 恒温箱中预温。 2、取染色体制片一张置胰酶缸中处理 15 秒左右,迅速投入 0.85%生理盐水缸中漂洗 数秒(可准备两缸盐水,做两次漂洗)。 3、用自来水稀释的吉姆萨染液(自来水:吉姆萨原液=8:1)扣染 20 分钟。 4、将标本用流水冲洗、晾干,必要时封片、镜检。镜检时,先在低倍镜下选择分散好、 长度适中的分裂相, 然后转换油镜观察其显带情况, 选择显带好的标本进行 G 显带核型分析。 【注意事项】 注意事项】 0 1、染色体制片胰酶处理前,需 37 C 温箱烤片一天左右。如滴片后当天进行 G 显带,可 0 在滴片后置 80 C 烤箱烤片两小时。 2、胰酶预温时要注意预温温度,温度过高时胰酶变性失效。 3、胰酶溶液需在使用前配制。染色体在胰酶中的处理时间可因制片质量、片龄而不同。 在不同个体的染色体制片中也可有差异。此外,不同厂家生产的胰酶或不同批号的胰酶,在 处理时间上都可有差别,故每次进行染色体 G 显带时,最好先试做一张制片,分段并用不同 时间处理,摸索胰酶处理时间,以保证获得最好的染色体 G 显带标本。 【实验报告】 实验报告】 1、G 显带过程中应注意哪些问题? 2、简述染色体 G 显带标本制备的基本方法。

实验四

人类染色体 C 显带技术

目的要求】 【目的要求】 1、初步掌握染色体 C 显带的制备方法。 2、熟悉 1 号、9 号、16 号和 Y 染色体 C 带的带型特征。 【实验原理】 实验原理】

C 显带技术是一种染色体局部显带技术。染色体经碱、酸、盐处理后,再经 Giemsa 染 色,呈现出特有的着丝粒、次缢痕区及 Y 染色体长臂远侧段等的结构异染色质区深染,称为 C 带。此区域的 DNA 多为高度重复序列,并仅与组蛋白紧密结合,因而保护了 C 带区的异染 色质免受酸、碱、盐破坏,并易被 Giemsa 深染。如该区域的 DNA 一旦发生变性,在改变变 性条件后,即可快速复性,这是高度重复序列 DNA 所具有的特性。其它部位的 DNA 一旦被碱 破坏变性后,不易发生复性,或复性较慢,因此,不易被 Giemsa 着色。所以,染色体两臂 的常染色质部分仅显示出浅淡的染色体轮廓。 优良的 C 带标本, 可使结构异染色质区着色很 深。在人类染色体中,染色体的着丝粒区、第 1、9、16 号染色体的次缢痕区和 Y 染色体长 臂的远侧段明显深染。因此,利用 C 带,可以准确地识别这些染色体,并可确定着丝粒的位 置和数目,还可配合其它显带技术对染色体某些结构异常、Y 染色体异常及性别,做出准确 的诊断。不同个体、种族,C 带的大小和染色的强度不同,呈现出多态性,故 C 显带技术在 多态性研究和鉴别染色体来源等方面具有一定的意义。 【实验准备】 实验准备】 1、试剂:5%~10%饱和 Ba(OH)2、0.1mol/L HCl、蒸馏水、70%、80%、95%酒精和 纯酒精、2×SSC 溶液、Giemsa 染液、香柏油或石蜡油、二甲苯等。 2、器材:光学显微镜、恒温水浴箱、温度计、立式染缸、镊子、扣染用玻璃板、小吸 管、50mL 量筒、擦镜纸等。 实验材料】 【实验材料】 常规方法制备的人类中期染色体标本制片。 【实验内容、方法】 实验内容、方法】 0 1、将染色体制片投入 58 C 饱和 Ba(OH)2 中 5 分钟。 2、取出标本置 0.1mol/L HCl 中漂洗。 3、蒸馏水漂洗数次。 4、酒精脱水:70%酒精→80%酒精→95%酒精→纯酒精(每个浓度 5 分钟),空气干燥。 0 5、置 65 C2×SSC 溶液中温育 1.5~2 小时。 6、Giemsa 染色 20 分钟,自来水冲洗,空气干燥,显微镜下观察。 将干燥后的标本置显微镜低倍镜下观察,找到分散好的、染色体长度适宜的分裂相,换 油镜观察。注意观察各染色体的着丝粒区深染,尤其是第 1 号、9 号、16 号染色体着丝粒区 及次缢痕区深染,两者合在一起形成明显大的 C 带,Y 染色体长臂远侧段约 1/2~2/3 区段 深染,C 带明显。第 1、9、16 号染色体和 Y 染色体长臂的 C 带具有多态性。 【注意事项】 注意事项】 1、片龄不宜过长,否则影响 C 带质量。 2、制片从饱和 Ba(OH)2 中取出时要迅速投入 0.1mol/L HCl 中,以免 Ba(OH)2 的沉淀物 粘贴在玻片上影响 C 带的观察。 3、染色浓度及时间不宜过高过长,以免影响 C 带的质量。 【实验报告】 实验报告】 1、简述染色体 C 显带标本制备的基本方法。 2、在 C 显带标本中,你能辨认第 1、9、16 号及 Y 染色体吗?它们的 C 带特点与其它各 号染色体有什么不同?

实验五

核仁形成区银染技术

【目的要求】 的要求】 1、初步掌握人类染色体核仁形成区银染标本的制备方法。 2、熟悉核仁形成区的所在部位。 【实验原理】 实验原理】 人类 D 组和 G 组染色体的随机柄部次缢痕区, 称为核仁形成区(NOR), 与核仁形成有关。 硝酸银染色技术,使具有活性的核仁形成区特异地染成黑色。这种银染色阳性的 NOR 称为 Ag—NOR,是具有转录活性的 rDNA 部位。现已证明,这里是具有转录活性的 18SrRNA 和 28SrRNA 基因的所在部位。 此处常伴有丰富的酸性蛋白质, 而这种蛋白含有较多的—SH 基团 + 从而使有转录活性的核仁形成区镀上银颗粒而 和二硫键, 易使硝酸银中 Ag 还原为 Ag 颗粒, 呈现出黑色区域,故被银染的不是 rDNA 本身而是酸性蛋白质。没有转录活性的 NOR 则不着 色。对 Ag—NOR 出现频率进行计数,可以了解有活性的 rRNA 基因(rDNA)的动态变化,估计 rDNA 的转录活性。人类细胞中的 Ag—NOR 数目及其在染色体上的位置都是比较稳定的,如 发生改变, 说明细胞内 rRNA 基因活性发生变化。 现认为, 该技术是研究 18SrRNA 和 28SrRNA 基因分布和转录活性的一种简易有效的方法, 并已广泛地用于肿瘤细胞遗传学、 体细胞遗传 学、进化遗传学和临床细胞遗传学等领域。 【实验准备】 实验准备 1、试剂:50%硝酸银、明胶—甲酸液、Giemsa 染液、蒸馏水。 2、器材:光学显微镜、恒温水浴箱、小吸管、小吸头、盖玻片、擦镜纸。 实验材料】 【实验材料】 人外周血淋巴细胞染色体标本制片(片龄在一周以内)。 【实验内容、方法】 实验内容、方法】 1、先吸取 50%AgN03 两滴滴在染色体标本制片上,然后加入明胶—甲酸液 3 滴,轻轻 来回摇晃混匀,盖上盖玻片。 2、 将玻片平置于沸水水浴箱的铁板上 1~2 分钟, 待玻片变金黄色, 立即用自来水冲洗, 以冲掉盖玻片。 3、以 5%Giemsa 染液复染 10 分钟,自来水冲洗,空气干燥,显微镜下观察。 Ag—NOR 计数:选择分散好、数目全的中期分裂相染色体,计数 D 组 6 个和 G 组 4 个近 端着丝粒染色体 Ag-NOR 的数目。凡有银染点的近端着丝粒染色体,不论单侧或双侧的,都 计数为一个银染的染色体。 【注意事项】 意事项】 1、硝酸银溶液应在临用前配制。配制及使用时,注意不要溅到四周,以免形成很难除

掉的黑色污点。 2、掌握好银染温度,温度越高,反应速度越快。 实验报告】 【实验报告】 1、仔细观察 Ag—NOR 形态、数目及其在染色体上的位置。 2、了解 NOR 银染的原理。

实验六

人类染色体 G 显带核型分析

【目的要求】 目的要求】 1、 通过 G 显带核型分析, 掌握 G 显带核型分析方法并初步掌握各号染色体的带型特征。 2、与非显带核型分析进行比较,认识 G 显带核型分析,能准确的识别每一条染色体。 【实验原理】 实验原理】 染色体标本用适当浓度的胰蛋白酶溶液处理,再用 Giemsa 染液染色,在染色体上显出 深浅交替的横纹,为 G 带。通过显示 G 带,不仅可以准确区分每一条染色体,还可检测出染 色体的微小结构异常。人类 G 显带染色体核型分析是染色体研究中最重要和最常用的方法。 它可根据染色体的数目、结构进行核型分析,而对染色体病患者做出准确的诊断。可在显微 镜下直接进行分析,也可进行显微照相,经冲洗、放大后,根据照片进行分析。根据丹佛 (Denver)及伦敦(London)会议提出的标准, 按照每条染色体的特异带型, 将照片上的染色体 按其轮廓剪下,进行配对、分组、排列,并贴在报告纸上。人体细胞含有 46 条染色体,即 23 对,其中 22 对为常染色体,男、女相同,编为 1~22 号。另一对为性染色体,男、女有 别,男性为 XY,女性为 XX。X 染色体编入 C 组,Y 染色体编入 G 组。在剪接粘贴时,性染色 体可单独排列。核型分析后,将其分析结果按国际标准进行描述。 【实验准备】 实验准备】 剪刀、镊子、核型分析纸、直尺、胶水、铅笔和橡皮。 【实验材料】 实验材料】 正常人外周血淋巴细胞 G 显带中期分裂相照片。 【实验内容、方法】 实验内容、方法】 一、正常人类染色体 G 带带型识别的主要特征 A 组染色体 包括第 1~3 号染色体,其长度最长。1 号和 3 号染色体的着丝粒均在 1/2 处,2 号染 色体的着丝粒约在 3/8 处。 1 号染色体 短臂:在分裂中期显示的 320 条带左右的分裂相上,近侧段有二条深带,第 2 条深带稍 宽,在处理较好的标本上,远侧段可显示 3~4 条淡染的深带。此臂分为三个区,近侧的第 1 条深带为 2 区 1 带,第 2 条深带为 3 区 1 带。 长臂:副缢痕紧贴着丝粒,着色深度大小不一,其远侧为一宽的浅带。近中段与远侧段 各有两条深带,中段两条深带稍靠近,其中第 2 条深带染色较浓。此臂分为 4 个区,副缢痕 远侧的浅带为 2 区 1 带,中段第 2 条深带为 3 区 1 带,远侧段第 1 深带为 4 区 1 带。 2 号染色体 短臂:可见 4 条深带,中段的两条深带稍靠近。此臂分为 2 个区,中段两条带之间的浅

带为 2 区 1 带。 长臂:有 4~7 条深带,第 3 和第 4 深带有时融合。此臂分为 3 个区;第 2 和第 3 深带 之间的浅带为 2 区 1 带,第 4 和第 5 深带之间的浅带为 3 区 1 带。 3 号染色体 着丝粒染色较浓。在长臂和短臂的近中段各具有一条明显而宽的深带。 短臂:一般在近侧段可见一条较宽的深带,远侧段可见两条深带,其中一条较窄,且着 色淡,这是区别 3 号染色体短臂的显著特征。在处理较好的标本上,近侧段的深带可分为两 条深带。此臂分为 2 个区,中段浅带为 2 区 1 带。 长臂:一般在近侧和远侧各有一条较宽的深带,在显带较好的标本上,近侧段的深带可 分为两条深带,远侧段的深带可分为三条深带。此臂分为 2 个区,中段浅带为 2 区 1 带。 B 组染色体 包括第 4、5 号染色体,长度次于 A 组,着丝粒均在 1/4 处。 4 号染色体 短臂:可见两条深带,近侧深带染色较浅,短臂只有一个区。 长臂:可见四条均匀分布的深带,在显带较好的标本上,远侧段的二条深带可各自分为 二条较宽的深带。此臂分为 3 个区,近侧段的第 1 和第 2 深带之间的浅带为 2 区 1 带,远侧 段二深带之间的浅带为 3 区 1 带。 5 号染色体 短臂:可见两条深带,其远侧的深带宽而浓染,此臂只有一个区。 长臂:近侧段有二条深带,染色较淡,有时不明显;中段可见三条深带,染色较浓,有 时融合成一条宽阔的深带。 远侧段可见二条深带, 近末端的一条着色较浓。 此臂分为 3 个区, 中段第 2 深带为 2 区 1 带,中段深带与远侧段之间的宽阔的浅带为 3 区 1 带。 C 组染色体 包括第 6~12 号和 X 染色体,中等长度。11 号和 X 染色体的着丝粒在 3/8 处,其它各 号染色体的着丝粒约在 1/4 处。 6 号染色体 短臂:中段有一条明显而宽阔的浅带,近侧段和远侧段各有一条深带。近侧深带紧贴着 丝粒。在显带较好的标本上,远侧段的深带可分为二条深带。此臂分为 2 个区,中段的明显 而宽阔的浅带为 2 区 1 带。 长臂:可见五条深带,近侧的一条紧贴着丝粒。远侧段的末端一条深带着色较浅。此臂 分为 2 个区,第 2 和第 3 深带之间的浅带为 2 区 1 带。 7 号染色体 着丝粒着色浓。 短臂:有三条深带,中段深带着色较淡,有时不明显。远侧深带着色浓,状如“瓶盖” 。 此臂分为 2 个区,远侧段的浅带为 2 区 1 带。 长臂:有三条明显的深带,远侧近末端一条着色较淡,第 2 和第 3 深带稍靠近。此臂分 为 3 个区,近侧第 1 条深带为 2 区 1 带,中段的第 2 深带为 3 区 1 带。 8 号染色体 短臂:有两条深带,中段有一较明显的浅带,这是与 10 号染色体鉴别的主要特征。此 臂分为 2 个区,中段的浅带为 2 区 1 带。 长臂:可见三条分界极不明显的深带,有时不明显,远侧的深带着色较浓。此臂分为 2 个区,中段的深带为 2 区 1 带。 9 号染色体 着丝粒着色浓。

短臂:近侧段和中段各有一条深带。在显带较好的标本上,中段可见二条窄的深带。此 臂分为 2 个区,中段深带为 2 区 1 带。 长臂:可见明显的二条深带,副缢痕一般不着色,在有些标本上呈现出特有的狭长颈部 区。此臂分为 3 个区,近侧的一条深带为 2 区 1 带,远侧的一条深带为 3 区 1 带。 10 号染色体 着丝粒着色浓。 短臂:近侧段和中段各有一条深带,在有些标本上,近中段可见二条深带,但与 8 号染 色体短臂比较,其深带的分界欠清晰。此臂只有 1 个区。 长臂:可见明显的三条深带,远侧段的二条深带稍靠近。近侧的一条深带着色最深,这 是与 8 号染色体相鉴别的主要特征。此臂分为 2 个区,近侧段的一条深带为 2 区 1 带。 11 号染色体 短臂:近中段可见一条深带,在显带较好的标本上,这条深带可分为二条较窄的深带。 此臂只有一个区。 长臂:近侧有一条深带,紧贴着丝粒。远侧段可见一条明显的较宽的深带,这条深带与 近侧的深带之间是一条宽阔的浅带,这是与 12 号染色体相鉴别的一个明显特征。在显带较 好的标本上,远侧段的这条较宽的深带,可分成两条较窄的深带,两深带之间有一条很窄的 浅带,一般较难辨认,但它是分区的一个界标。在有些标本上,近末端处可见一条窄的浅色 深带。此臂分为两个区,上述两条深带之间很窄的浅带为 2 区 1 带。 12 号染色体 短臂:中段可见一条深带,此臂只有一个区。 长臂:近侧有一条深带,紧贴着丝粒。中段有一条宽的深带,这条深带与近侧深带之间 有一条明显的浅带,但与 11 号染色体相比,这条浅带较窄,这是鉴别 11 号与 12 号染色体 的主要特征。在显带较好的标本上,中段这条较宽的深带可分为三条深带,其正中的一条着 色较浓,在有些标本上,远侧段的近端还可见 1~2 条染色较深的深带。此臂分为 2 个区, 中段正中的深带为 2 区 1 带。 X 染色体 其长度介于 7 号和 8 号染色体之间。 短臂:中段有一明显的深带,如竹节状。在有些标本上,远侧段还可见到一条窄的、着 色淡的深带。此臂分为二个区,中段的深带为 2 区 1 带。 长臂:可见 4~5 条深带,近中段的一条最明显。此臂分为 2 个区,近侧端的深带为 2 区 1 带。 D 组染色体 包括 13—15 号染色体,具有近端着丝粒和随体。 13 号染色体 着丝粒区深染。 长臂:可见 4 条深带,第 1 和第 4 深带较窄,染色较淡;第 2 和第 3 深带较宽,染色较 浓。此臂分为 3 个区,第 2 深带为 2 区 1 带,第 3 深带为 3 区 1 带。 14 号染色体 着丝粒区深染。 长臂:近侧和远侧各有一条较明显的深带。在处理较好的标本上,中段尚可见一条着色 较浅的深带。此臂分为 3 个区,近侧深带为 2 区 1 带,远侧深带为 3 区 1 带。 15 号染色体 着丝粒区深染。 长臂:中段有一条明显的深带,染色较浓,有的标本上,近侧段可见有 1~2 条染色浅

的深带。此臂分为 2 个区,中段深带为 2 区 1 带。 E 组染色体 包括第 16~18 号染色体。16 号染色体为中央着丝粒染色体,17 和 18 号染色体为亚中 央着丝粒染色体,着丝粒约在 1/4 处。 16 号染色体 短臂:中段有一条深带,显带较好的标本上可见二条深带。此臂只有一个区。 长臂:中段和远侧各有一条深带,有时远侧的一条不明显,副缢痕着色浓。此臂分为两 个区,中段深带为 2 区 1 带。 17 号染色体 短臂:有一条深带,紧贴着丝粒,此臂只有一个区。 长臂:远侧段可见一条深带,这条带与着丝粒之间为一明显而宽的浅带。此臂分为 2 个区,这条明显而宽的浅带为 2 区 1 带。 18 号染色体 短臂:有一条窄的深带,此臂只有一个区。 长臂:近侧和远侧各有一条明显的深带。此臂分为 2 个区,两深带之间的浅带为 2 区 1 带。 F 组染色体 包括 19、20 号染色体,均为中央着丝粒染色体。 19 号染色体 着丝粒及其周围为深带,其余均为浅带。短臂与长臂均只有 1 个区。 20 号染色体 着丝粒区深染。 短臂:有一条明显的深带。此臂只有一个区。 长臂:在中段和远侧段可见 1—2 条染色较淡的深带,有时全为浅带。此臂只有一个区。 G 组染色体 包括第 21、22 染色体和 Y 染色体。是染色体中最小的、具近端着丝粒的染色体。21、 22 号染色体可具有随体。 21 号染色体 着丝粒区着色淡。 与 22 号染色体比较,其长度比 22 号短,其长臂近侧有一明显而宽的深带。此臂分为 2 个区,其深带为 2 区 1 带。 22 号染色体 着丝粒区着色浓。 与 21 号染色体相比, 其长度比 21 号长。 在长臂上可见二条深带。 近侧的一条着色较浓, 而且紧贴着丝粒。近中段一条着色淡,在有的标本上不显现。此臂只有一个区。 Y 染色体 长度变化较大,有时整个长臂被染成深带。在显带较好的标本上可见二条深带。此臂只 有一个区。 二、正常人 G 显带核型分析 1、每位同学发两张正常人外周血淋巴细胞 G 显带中期分裂相照片。其中一张将染色体 按其轮廓逐个剪下,根据其大小、带型特点和着丝粒位置,依次分组、配对,排放在核型分 析纸上。摆放时短臂向上,长臂向下,着丝粒位于铅笔画的横线上,多次调整检查无误后, 方可进行粘贴。 2、将另一张照片适当剪小,粘贴在核型分析纸上方正中间。

3、写出分析结果。 【注意事项】 注意事项】 1、实验操作时,不宜面对剪下的染色体大声说话、咳嗽和打喷嚏,以免染色体吹跑遗 失。 2、剪贴时应注意一对染色体要排列紧密,不要有间隔,而每对之间要有间隔。着丝粒 都要排列在横线上。上下线染色体要求对齐排列。 3.、X 染色体排列在 C 组旁,Y 染色体排列在 G 组旁。 4、按染色体轮廓剪成长方形,以便排列、配对和粘贴。 【实验报告】 实验报告】 1、每人剪贴分析一张正常人体细胞 G 显带中期分裂相染色体照片。 2、简单说出 G 显带各号染色体带型的特点。 3、进行性别诊断并写出核型。

实验七

X 染色质标本的制备

【目的要求】 目的要求】 1、初步掌握 X 染色质标本的制备方法。 2、观察熟悉人类间期细胞 X 染色质的形态特征、数目及所在部位。 3、了解性染色质检查的临床意义。 【实验原理】 实验原理】 X 染色质检查的重要临床意义在于性别的鉴定。 在正常女性间期细胞核膜边缘常常可以 观察到一个被碱性染料浓染的、直径 1 微米左右的小体。这一小体,是由女性一条“失活” 的 X 染色体形成的, 是不具有转录活性并呈异固缩状态的 X 染色质, 也称 X 小体或巴氏小体。 女性另一条 X 染色体与其它染色体一样呈解螺旋状态,并具有转录活性。X 小体的数目在女 性中是性染色体数目减 1。正常女性细胞中有两条 X 染色体,所以仅有一个 X 小体,而具有 三条 X 染色体的不正常女性,则有两个 X 小体。男性个体因只有一条 X 染色体,而不发生异 固缩,因而没有 X 小体。但先天性睾丸发育不全症患者(核型:47,XXY),在细胞核中也可 见到 X 染色质。因此,可以通过 X 染色质数目的检查,鉴定胎儿的性别和性别畸形。 X 染色质大多位于核膜内侧缘,1 微米左右,深染。形状不一,有球状、扁凸状、三角 形和半圆形等。正常女性间期细胞中,X 染色质阳性检出率为 20%~70%,大多为 30%~ 50%,高时可达 70%以上,男性细胞中则平均低于 1%。可采用口腔粘膜细胞、绒毛细胞、 羊水细胞等进行检查。 【实验准备】 实验准备】 1、试剂:0.85%生理盐水、甲醇、冰醋酸、95%乙醇、硫堇染液、香柏油、二甲苯、 加拿大树胶。 2、器材:光学显微镜、离心机、小吸管、载玻片、烧杯(50mL)、量筒(50mL)、小吸头、 牙签、片盘、镊子、擦镜纸。 【实验材料】 实验材料】

人口腔粘膜细胞 【实验内容、方法】 实验内容、方法】 1、取 5mL 离心管,加入 5mL0.85%生理盐水。 2、受试者嗽口后,用牙签刮取口腔颊部粘膜,置离心管中生理盐水中涮洗,弃掉牙签。 用吸管轻轻吹打涮洗下来的细胞,以 1500r/min 离心 10 分钟。 3、弃上清液,加入新鲜配制的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)5mL,轻轻吹打均匀,室温固 定 10 分钟。 4、1500r/min 离心 10 分钟,弃上清液,留底物,加固定液 0.3~0.5mL(加入量视底物 量而定),轻轻吹匀后,将细胞悬液滴在清洁的载玻片上,每片约 2 滴,空气干燥。 5、硫堇染色法: (1)将空气干燥后的制片放入蒸馏水中漂洗数分钟。 (2)用 5mol/L HCl 水解 10 分钟。 (3)蒸馏水中漂洗数分钟(中间可更换一次蒸馏水),充分洗掉 HCl。 (4)将制片置人硫堇染液中浸染 30 分钟。 (5)蒸馏水漂洗,晾干。 (6)加 50%酒精漂洗一次。 (7)70%酒精分色半分钟。 (8)95%、100%酒精脱水各 1-2 分钟。 (9)二甲苯透明两次(1~2 分钟),加拿大树胶封片。 6、镜检 100 个细胞,统计含有 X 染色质细胞所占的百分率。正常值:男性为 10%以下 或没有,女性为 40%以上。 【注意事项】 注意事项】 1、口腔颊部刮片时,用力要适当、均匀,以求刮下的细胞可以观察到 X 染色质。 2、掌握好盐酸水解的时间和温度。 【实验报告】 实验报告】 1、绘出一个所观察的含有 X 染色质的口腔粘膜上皮细胞。 2、镜检 100 个细胞,统计含有 X 染色质细胞的百分比。

实验八

姐妹染色单体交换

【目的要求】 目的要求】 1、初步掌握人体外周血淋巴细胞染色体姐妹染色单体分化染色技术。 2、初步掌握 SCE 的观察及分析方法。 3、了解 SCE 频率变化的意义。 实验原理】 【实验原理】 姐妹染色单体分化染色技术可使中期染色体的两条染色单体着色深浅不同, 能借以观察 姐妹染色单体交换(SCE)现象。姐妹染色单体交换,是指在染色体复制过程中,同一条染色 体上的两条姐妹染色单体在相同位置上发生的等位对称的片段交换, 即两条姐妹染色单体在 DNA 合成中核苷酸序列发生互相交换的现象。

当细胞在含有 BrdU(5—溴脱氧尿嘧啶核苷)的营养液中增殖分裂时,由于 BrdU 是与脱 氧胸腺嘧啶核苷相类似的核苷,所以在 DNA 复制过程中 BrdU 可取代胸腺嘧啶核苷而参入到 新复制的 DNA 子链中。根据 DAN 半保留复制的规律,细胞在含有 BrdU 的营养液中进行第一 次 DNA 复制时,每个 DNA 双链中的一条单链为 BrdU 参入链(TB 型链)。当第二次复制时 DNA 双链又经过一次半保留复制,其中一个 DNA 双链仍为 TB 型链,而另一个 DNA 分子的双链都 含有 BrdU(称 BB 型链)。因此,第二周期中的每条染色体的两条姐妹染色单体中 DNA 分子, 一个为 TB 型 DNA 分子,一个为 BB 型 DNA 分子。由于双链都含有 BrdU 的 DNA 双链螺旋化程 度较低而降低了与某些染色剂的亲和力, 所以经 Giemsa 染色后含有 BB 型 DNA 分子的染色单 体比含有 TB 型 DNA 分子的染色单体染色浅而出现色差。在普通光学显微镜下即可观察到第 二周期中一条中期染色体的两条染色单体, 显示出深浅不同的颜色。 如果在某些因素的作用 下两条染色单体间发生了等位片段的交换, 则可以很容易观察到。 这种交换的多少即为交换 率。现已证明,许多诱变剂、致癌剂和致畸剂可诱发染色体畸变和 SCE 频率增高,但 SCE 频率的改变比染色体畸变灵敏得多,而且有害物质毒性越强,SCE 频率就越高,表现出很好 的剂量—效应关系。因此,SCE 技术已成为检测致突变物和致癌物的一种常用手段。SCE 分 析可作为 DNA 损伤修复研究中一项有意义的指标。 【实验准备】 实验准备】 1、试剂:2×SSC 溶液、Giemsa 染液、香柏油、二甲苯、BrdU(500μg/mL)。 2、器材:光学显微镜、恒温水浴锅、黑光灯(20W)、饭盒盖、擦镜纸、小吸管、小吸头、 黑布和扣染用玻璃板等。 【实验材料】 实验材料】 加 BrdU 营养液培养的外周血淋巴细胞染色体标本制片。 【实验内容、方法】 实验内容、方法】 一、血培养和染色体标本制备 在进行外周血淋巴细胞培养时,5mL 培养液中加入 BrdU(500μg/mL)0.1mL,使培养液 中 BrdU 的最终浓度为 10μg/mL,加入抗凝血后用黑布包裹,避光培养 72 小时,按常规进 行染色体的标本制备。 二、姐妹染色单体差别染色 (一)方法一 0 1、常规方法制片后,空气干燥,将标本制片置 37 C 温箱中烤 24 小时。 2、将染色体制片放在培养皿内牙签上,细胞面朝下,盖一张擦镜纸,滴加适量 2×SSC 溶液,以浸透擦镜纸,充分覆盖细胞面。 3、将培养皿置于 55℃恒温水浴锅的水面上, 。 4、用 30 瓦紫外灯垂直照射标本 30 分钟,照射距离 10cm。 5、照射完毕,用自来水冲洗标本,空气干燥。 6、用 10%的 Giemsa 染液扣染 10 分钟。 7、自来水冲片,空气干燥,镜下观察。 (二)方法二: 0 1、将新制片置 37 C 温箱中三天。 2、依次浸入 0.4M NaCl 溶液、0.004M KCl 溶液和 0.01M PBS 溶液中各 5 分钟。 3、用 Hoechst-33258 荧光染液染色 20 分钟,然后用 0.01M PBS 液冲洗 2 次。 4、见方法一之 2~3。

5、用黑光灯照射 30-40 分钟。 6、见方法一之 5~8。 三、SCE 的观察与计数 在显微镜下,选择染色体分散良好、数目完整、染色体长度适宜的分裂相观察。首先应 区别第一、二、三周期中期分裂相染色体 Giemsa 染色的特点。第一周期两条染色单体全部 深染;第二周期,一条染色单体浅染,另一条染色单体深染;第三周期,可出现两条染色单 体均为浅染的分裂相, 只要有一条染色体的两条染色单体相同位置都浅染, 就可判定为第三 周期。 SCE 计数:凡在染色体端部出现的交换,记为一个 SCE;在染色体的长臂或短臂中间出 现交换,记为两个 SCE;在着丝粒部位发生交换,排除着丝粒部扭转,记为一个 SCE。观察 记数 20 个中期分裂相,计算出每个细胞的 SCE 平均值,即为该个体的 SCE 交换频率。由于 BrdU 本身可致畸,如浓度过高可引起自身 SCE 频率本底的增高,因此应设正常对照组。 【实验报告】 实验报告】 1、在自己的制片中找到三个不同周期的中期分裂相。 2、简述姐妹染色单体差别染色的原理。 3、观察计数 20 个分裂相,并计算出每个细胞 SCE 的平均值。

实验九

微核检测技术

【目的要求】 目的要求】 1、掌握人体外周血淋巴细胞微核检测技术(有丝分裂阻断法微核检测技术)。 2、熟悉微核的形态特征。 3、了解微核检测的实际意义和应用范围。 【实验原理】 实验原理】 微核是游离于细胞质中的核物质小体。其大小一般是主核的 1/3~1/4。微核是染色体 畸变的一种特殊表现形式, 是由细胞分裂后期滞留的染色体断片或整条染色体在子代细胞分 裂间期的细胞质中形成的游离团块物。 由于染色体受化学诱变剂和辐射损伤而断裂成一些无 着丝粒的染色体断片或受到纺锤体的毒物作用,纺锤体受到损伤,当细胞进入分裂后期时, 不受纺锤丝牵引而滞留在赤道板附近,在末期以后,单独形成一个或几个规则的次核,包含 在子细胞的胞质内, 由于比主核小得多, 故称微核。 微核同主核一样, 是由 DNA 物质所组成。 现已证实,微核率同外界作用因子的剂量呈线性正比关系。因此,微核检测技术已广泛应用 在辐射防护、损伤,化学诱变剂研究和新药、保健食品的毒理实验中。 微核的形成需要经过一次细胞分裂。 有丝分裂阻断法微核检测技术是利用一定浓度的细 胞松弛素 B 阻断淋巴细胞细胞质的分裂而不影响细胞核的分裂, 故在淋巴细胞培养过程中加 入细胞松弛素 B,使经过一次分裂的淋巴细胞呈双核,选择这部分细胞进行微核计数而提高 了实验的敏感性。 同时也成为检测致突变、 致癌、 致畸物质对机体遗传效应的一种重要手段。 【实验准备】 实验准备】 1、试剂:已配好的营养液(20%小牛血清+80%RPMI—1640+PHA)、100μg/mL 浓度的细 胞松弛素 B、0.075moL/L KCl、甲醇—冰醋酸固定液(3:1)、Gierma 染液、香柏油、二甲苯。 2、器材:超净工作台、光学显微镜(附照相设备)、隔水式恒温培养箱、离心机、冰箱、

高压蒸汽消毒锅、鼓风干燥箱、无菌正压滤器、分析天平(感量 1/10 毫克)、架盘天平、链 霉素培养瓶及瓶塞、肝素小瓶及瓶塞(取血用)、10mL 吸管、直头小吸管、5mL 刻度离心管、 2mL 或 5mL 一次性注射器、量筒、烧杯、搪瓷盆、搪瓷盘、试管架、片盘、片盒、止血带、 0 棉签、大吸球、小吸头、pH 试纸、废液缸、解剖剪刀、镊子、记号笔、4 C 预冷的载玻片、 酒精灯、火柴、染色缸或染色玻璃板和擦镜纸等。 实验材料】 【实验材料】 肝素抗凝的正常人静脉血。 【实验内容、方法】 实验内容、方法 实验内容 一、血培养 0 1、取静脉血 0.5mL~lmL 注入两个含 5mL 培养液的培养瓶中,置 37 C 温箱培养。为了 60 增加微核率便于实验观察,在血培养前正常人静脉血可经 Co 照射。 2、细胞培养至 40~42 小时,培养瓶中加入 100μg/mL 的细胞松弛素 B 0.3mL/瓶(终 浓度:6μg/mL),继续培养 30 小时。即培养至 70~72 小时收获细胞。 二、制片 1、将培养物移至 5mL 离心管,以 1000r/min 离心 10 分钟,弃上清液,留底物,加入 0 3mL 预温(37 C)的 0.075mol/L KCl 和 2mL 固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)混匀。 2、混匀后,以 1000r/min 离心 10 分钟,弃上清液,加 4Ll 固定液吹匀,室温固定 10 分钟,离心。再重复一次。 3、弃上清液,留底物,加 0.5mL 固定液,吹打均匀,滴片,空气干燥。 4、Giemsa 染液扣染 20 分钟,自来水冲片,空气干燥,显微镜观察。 三、微核观察、分析及计数 首先用低倍镜观察选择染色和细胞分散好的区域, 换高倍镜或油镜观察计数。 一般情况 60 下,计数 1000 个胞浆完整的双核淋巴细胞(每瓶计数 500 个),经 Co 照射过的淋巴细胞微 核率明显高于未照射过的细胞。所计数的微核要求与主核完全脱离,多呈圆形,边缘光滑, 着色与主核一致,小于主核的 1/3。一个细胞中,不论出现几个微核,均按一个细胞计数。 【注意事项】 注意事项】 在微核标本的制备过程中,动作要轻,离心速度要准确,以免细胞破碎,微核丢失。 【实验报告】 实验报告】 1、随机观察 500~1000 个细胞并计算微核细胞率。 2、简单叙述微核的形成机理及微核检测的实用价值。

实验十

ABO 血型的测定及其基因频率的计算

【目的要求】 目的要求】 目的要求 了解 ABO 血型的测定方法,熟悉 ABO 血型基因频率的计算方法。 【实验原理 实验原理】 实验原理 根据红细胞抗原的有无和血清中抗体的存在情况,是否发生凝集反应来确定血型。 血 型 红细胞抗原 血清中的凝集素

A型 B型 AB 型 O型

A B A、B 无

抗B 抗A 无 抗A抗B

【实验准备 实验准备】 实验准备 载玻片、一次性采血针、酒精棉球、干棉球、A、B 标准血清、显微镜。 【实验材料】 实验材料】 材料 耳垂血或手指血 【实验内容、方法】 实验内容、方法】 内容 (一)ABO 血型的测定: 1、一张清洁的载玻片,于左半部加一滴 A 型标准血清(含抗 B 凝集素),于右半部加一 滴 B 型标准血清(含抗 A 凝集素)。 2、用酒精棉球消毒耳垂,用一次性采血针刺耳垂。待出血后用一次性采血针的一端沾 血少许,搅拌在 A 型标准血清中,拌匀后再用一次性采血针的另一端沾血少许,搅拌在 B 型标准血清中。切记不能使 A、B 血清相混。 静置 1 分钟后,观察凝集现象。凡红细胞分散者为不凝集,而红细胞成群且有粘连者为 凝集。不明显的用显微镜观察。按下表判定血型。 A 型血清 + + B 型血清 + + 血型 O型 B型 A型 AB 型

(凝集者画“+”,不凝集者记“-”) (二)ABO 血型基因频率的计算法: 根据检查血型的结果,计算出各血型(表现型)的频率,假设其为遗传平衡群体,根据下 列公式算出基因频率。 表现型 基因型 频 率
2

A型 A I I +I i
A A 2

B型 B I I +I i
B B

O型 ii
2

AB 型 A B II 2pq(或 AB)

p +2pr(或 A) q +2qr(或 B) r (或 O)

i 的频率 r=√O A I 的频率 p=1-√B+A B I 的频率 q=1-√A+O 【实验报告】 实验报告】 计算出本班或本年级 ABO 血型的基因频率。

实验十一

苯硫脲尝味试验及其基因频率的计算

【目的要求】 目的要求】 目的要求 1、通过 PTC 尝味试验了解不完全显性遗传。 2、掌握等位基因频率的计算方法。 【实验原理 实验原理】 实验原理 人类对苯基代硫脲(简称苯硫脲,PTC)的尝味能力属于不完全显性遗传。此药物呈白色 结晶状,有苦涩味。基因型为 TT 和 Tt 的人,对 PTC 都有尝味能力(称 PTC 尝味者),但纯合 子(TT)的尝味能力强(能尝出 1/75 万~1/300 万 PTC 溶液的苦涩味),杂合子(Tt)的尝味 能力低(只能尝出 1/5 万~1/40 万 PTC 溶液的苦味)。基因型 tt 的人对 PTC 的味觉最差, 甚至完全缺乏,称为 PTC 味盲(只能尝出>1/2.4 万浓度溶液的苦味,甚至连 PTC 粉末结晶 也尝不出其味)。 【实验准备 实验准备】 实验准备 计算器 【实验材料】 实验材料】 材料 三种不同浓度的 PTC 溶液。 【实验内容、方法】 实验内容、方法】 内容 分别在每位试验者口中滴入数滴不同浓度的 PTC 溶液(1/75 万、1/5 万,1/2.4 万 三种浓度从低浓度到高浓度依次尝试),仔细品尝,并将新感觉到的味(有无苦涩味)记录于 下表中。最后根据尝味结果,分析你的基因型与尝味能力。 PTC 浓度 1/75 万 1/5 万 1/2.4 万 有无苦涩味 基因型 表现型

【实验报告】 实验报告】 实验报告 1、你的 PTC 尝味能力属于哪一类型?能尝出何种浓度 PTC 溶液的苦涩味?基因型如何? 将结果填于上表中。 2、计算本班或本年级 PTC 尝味能力的基因频率。

实验十二
【目的要求】 目的要求】 1、掌握皮纹分析的基本知识和方法。 2、了解皮纹分析在遗传学中的应用。

人类皮纹分析

【实验原理】 实验原理】 人体的手、脚掌面具有特定的皮纹。人类的皮肤由表皮和真皮构成。真皮乳头向表皮突 起,形成许多排列整齐、平行的乳头线,称为嵴纹。突起的嵴纹之间又形成凹陷的沟。这些 凹凸的纹理就构成了人体的指(趾)纹和掌纹。 目前, 皮纹学的知识和技术已广泛应用于人类 学、遗传学、法医学以及临床某些疾病的辅助诊断。 人体的皮纹既有个体的特异性, 又有高度的稳定性。 皮纹在胚胎发育第 13 周开始出现, 终生不变。 实验准备】 【实验准备】 放大镜、印台、印油或油墨、白纸、直尺、铅笔、量角器。 【实验材料】 实验材料】 实验者双手 【实验内容、方法】 实验内容、方法】 先在检查纸上依次填入姓名、 性别、 年龄和民族等, 将检查纸平放在光滑桌面上, 备用。 将双手洗净、擦干,用印油或油墨均匀地涂抹手掌和手指。先将十个手指分别滚动引在检查 纸的下边,然后再将手掌引下。 一、指纹观察 手指末端腹面的皮纹称为指纹。 根据纹理的走向和三叉点的数目, 可将指纹分为三种类 型:弓形纹、箕形纹、斗形纹。 1、弓形纹:特点是嵴线由一侧至另一侧,呈弓形,无中心点和三叉点。根据弓形的弯 度分为简单弓形纹和篷帐式弓形纹。 2、箕形纹:箕形纹俗称簸箕。在箕头的下方,纹线从一侧起始,斜向上弯曲,再回转 到起始侧,形状似簸箕。此处有一呈三方向走行的纹线,该中心点称三叉点。根据箕口朝向 的方位不同,可分为两种:箕口朝向手的尺侧者(朝向小指)称正箕或尺箕;箕口朝向手的桡 侧者(朝向拇指),称反箕或桡箕。 3、斗形纹:是一种复杂、多形态的指纹。特点是具有两个或两个以上的三叉点。斗形 纹可分绞形纹(双箕斗)、环形纹、螺形纹和囊形纹等。 根据统计, 指纹的分布频率, 存在种族、 性别的差异。 东方人尺箕和斗形纹出现频率高, 而弓形纹和桡箕较少;女性弓形纹多于男性,而斗形纹较男性略少。 二、嵴纹计数 1、指嵴纹计数:弓形纹由于没有圆心和三叉点,计数为零。箕形纹和斗形纹,则可从

中心到三叉点中心绘一直线,计算直线通过的嵴纹数。斗形纹因有两个三叉点,可得到两个 数值,只计多的一侧数值。双箕斗分别先计算两圆心与各自三叉点连线所通过的嵴纹数,再 计算两圆心连线所通过的嵴纹数,然后将三个数相加起来的总数除以 2,即为该指纹的嵴纹 数。 2、指嵴纹总数(TFRC):为 10 个手指指嵴纹计数的总和。我国男性平均值为 148 条,女 性为 138 条。 三、掌纹观察 掌纹分为五部分: 1、大鱼际区:位于拇指下方。 2、小鱼际区:位于小指下方。 3、指间区:从拇指到小指的指根部间区域(I1~I4)。 4、三叉点及四条主线:在 2、3、4、5 指基部有三叉点 a、b、c、d,并各引出一条主 线,即 A 线,B 线,C 线和 D 线。 5、atd 角:正常人手掌靠腕部的大、小鱼际之间,具有一个三叉点,称轴三叉或 t 三 叉。从三叉点 a 和三叉点 d 分别画直线与 t 三叉点相连,即构成 atd 角。可用量角器测量 atd 角度的大小,并确定 t 三叉点的具体位置。t 三叉点的位置离掌心越远,也就离远侧腕 关节褶线越近,atd 角度数越小;而 t 三叉点的位置离掌心越近,离腕关节褶线越远,atd o 角就越大。我国正常人 atd 角的平均值为 41 。 四、指褶纹和掌褶纹 褶纹是手掌和手指屈面各关节弯曲活动处所显示的褶纹。 实际上褶纹不是皮肤纹理, 但 由于染色体病患者的指褶纹和掌褶纹有改变,所以列入皮纹,进行观察讨论。 1、指褶纹:正常人除拇指只有一条指褶纹外,其余四指都有 2 条指褶纹与各指关节相 对应。 2、掌褶纹: ⑴普通型:正常人手掌褶纹主要有三条,分别是:远侧横褶纹、近侧横褶纹、大鱼际纵 褶纹。 (2)通贯掌:又称猿线。由远侧横褶纹与近侧横褶纹连成一条直线横贯全掌而形成。 (3)变异 I 型:也称桥贯掌。表现为远侧和近侧横褶纹借助一条短的褶纹连接。 (4)变异Ⅱ型:又称叉贯掌。为一横贯全掌的褶纹,在其上下各方伸出一个小叉。 (5)悉尼掌:表现为近侧横褶纹通贯全掌,远侧横褶纹仍呈正常走向。这种掌褶纹多见 于澳大利亚正常悉尼人群中,故称悉尼掌。 【实验报告】 实验报告】 1、观察自己指纹、掌纹、指褶纹和掌褶纹的类型。 2、计数指嵴纹总数(TFRC)。 3、测量双手的 atd 角。

实验十三

遗传咨询

【目的要求】 目的要求】 1、通过对单基因病(或性状)的系谱分析,熟练掌握系谱分析的一般方法。 2、熟练掌握遗传病再发风险的估计方法。 3、熟悉遗传咨询的一般过程。

【实验原理】 实验原理】 遗传咨询是医师或从事医学遗传学的工作人员用遗传学和临床医学的基本原理, 确定某 病是否为遗传病、遗传方式、再发风险、如何防治等一系列问题,然后回答患者及家属提出 的有关疾病的各种遗传学问题,并提出建议和指导。所以,从事遗传咨询的工作人员除具备 临床医学的知识外, 还必须具备医学遗传学的基本知识, 了解遗传病与其它临床疾病的鉴别 诊断,掌握系谱分析的原理和方法,熟悉遗传病再发风险估计等等。遗传咨询一般包括下列 几个步骤:①询问、查体、实验室检查、收集家族史,绘出系谱图;②依据第一步获得的资 料以及实验室的检查结果, 判断某病是否为遗传病; ③根据系谱分析判断遗传病的传递方式 或可能的传递方式; ④回答患者及有关人员所提出的各种遗传学问题, 例如该遗传病的产生 原因、诊断、预防、治疗及再发风险的估计等问题;⑤与患者及家属商谈,并帮助他们做出 恰当的选择和确定最佳措施。 遗传咨询是减少遗传病患儿出生的有效方法, 对降低遗传病的 群体发病率, 提高人类的遗传素质具有重要意义, 因此它是医学遗传学的一项重要研究内容。 【实验内容、方法】 实验内容、方法】 1、分析下列系谱,判断各系谱中单基因遗传病的遗传方式,并写出患者及其他各成员 的基因型(图 1~图 5)。 2、某女曾生育过一先天愚型患儿,现再次妊娠,惧怕再生同病患儿前来咨询。应该怎 样计算再发风险? 3、某种遗传病男女发病机会均等,而且发病的患者可出现在父母均正常的家庭中。现 有一对表现都正常的姨表兄妹,准备结婚,虽然双方父母正常,但他们的舅表兄患有此病, 所以前来咨询。 (1) 请问此病的遗传方式如何? (2) 这对姨表兄妹都是携带者的可能性有多大? (3)他们婚后出生此病患儿的概率是多大? (4)如果他们均为携带者,那么他们婚后生出此病患者的可能性有多大? 4、某男性,38 岁,两次结婚,第—妻妊娠 8 次均于妊娠 2 个月左右流产,故离婚,与 第二妻婚后,女方受孕 3 次亦均在 3 个月内流产。请分析流产的原因以及能否再次妊娠。 5、一对夫妇生有苯丙酮尿症(PKU)的患儿,他们听说是遗传病后,前来咨询,问题是: (1)他们二人及家庭各成员中全无这种病的患者,这怎么能算遗传病呢? (2)是谁的问题?能不能治疗?他们再生一个孩子患 PKU 的可能性是多大?如何预防患儿 的出生? 6、一对新婚夫妇,由于女方的弟弟患有白化病,害怕今后会生育白化病患儿前来咨询。 7、有一对外表正常的夫妇,怀孕 4 胎中,有两次流产,存活的长女表型正常,但其染 色体数目为 45 条,存活的男孩是一个具有 46 条染色体的先天愚型患者。 (1)请解释男孩的发病原因。 (2)长女将来会发病吗?婚后会生出先天愚型患儿吗?如果能,是否能防止患儿的出生? 8、一对夫妇婚后,怀孕 5 次,其中 4 胎流产,1 胎多发畸形。经细胞遗传学检查丈夫 为倒位携带者,他们还能否生出正常的孩子?如果能,表型正常的孩子的核型如何? 9、一位青年准备与他的姑表妹结婚,他们认为在他们的家系中从来没有过遗传病的患 者, 他们结婚对后代不会有影响。 请你从我国人群的遗传负荷是每人平均携带 5 个有害基因 的角度说明他俩不宜结婚的原因。 10、如果苯丙酮尿症的群体发病率为 0.0001,表兄妹婚后后代患苯丙酮尿症的概率有 多大?是随机婚配的多少倍?

11、 黑尿病(AR)的群体发病率为百万分之一, 请问下列情况产生有病后代的概率是多大? (1)两个正常的无亲缘关系的人结婚。 (2)一个患黑尿病的人与一个正常的无亲缘关系的人结婚。 (3)一个正常的人,其弟弟患黑尿病,他(她)与一正常的无亲缘关系的人结婚。 12、一位女性表型正常,父母和两个哥哥表型也正常,但因她的两个舅舅患有假肥大型 肌营养不良症(XR)前来咨询。 (1)她是携带者的可能性有多大? (2)如她与正常男性结婚,婚后生男孩的复发风险是多大?生女孩的复发风险是多大? (3)如果她婚后生了一个患者,如再生育,则生一个正常孩子的可能性是多少? 13、Huntington 舞蹈症为常染色体显性遗传病,25 岁以前发病的占 10%,40 岁以后发 病的占 60%。一位 25 岁的男性,表型正常,其外祖父患有该病,他的母亲现已 45 岁,表 型也正常,请问他是携带者的可能性是多少?他将来的子女获得致病基因的风险是多少?

实验十四

人类基因组 DNA 的提取

【实验目的】 实验目的】 1、了解 DNA 提取的原理; 2、学会实验室常用的提取 DNA 的方法。 【实验原理】 实验原理】 从不同组织细胞或血细胞中提取高质量的 DNA 是进行分子遗传学各项研究的先决条 件。制备高质量 DNA 的原则是:尽可能保持 DNA 分子的完整;将蛋白质、脂类、糖类等 物质分离干净。哺乳动物 DNA 的提取通常是在有 EDTA-Na2 及 SDS 一类的去污剂存在下, 用蛋白酶 K 消化细胞,然后用酚、氯仿抽提实现的。在 Tris-HCl 饱和酚(pH 8.0)作用下, DNA 被释放到上清液中,经过氯仿去蛋白、去酚(因为可有 10%的酚溶于水)作用后,乙 醇可使 DNA 分子聚合形成白色或无色絮状沉淀,从而获得粗提 DNA。用这一方法获得的 基因组 DNA 大小约有 100~150 kb,适用于 Southern 分析、用 λ 噬菌体构建基因组 DNA 文 库和 PCR 反应等。 【试剂与材料】 试剂与材料】 枸橼酸钠溶液(ACD) 、生理盐水、细胞裂解液、蛋白酶 K(10 mg/ml) 、10% SDS,STE 缓冲液(pH 8.0) 、Tris-HCl 饱和酚(pH 8.0) 、氯仿(CHCl3) 、乙酸钠(3 mol/L,pH 5.2) 、 无水乙醇、75%乙醇、TE 缓冲液(pH 7.5) 。 实验内容、方法】 【实验内容、方法】 一、外周静脉血 DNA 的提取 1、采集外周静脉血 3~4 ml 于 7 ml 管内,加 0.5 ml ACD 抗凝。 2、加等体积生理盐水,轻轻振荡混匀;1 500 g 离心 20 min。 3、弃上清液;每管加 5 ml 细胞裂解液,轻轻上下振荡至透明;1 500 g 离心 20 min。 4、弃上清液;每管加入 STE(pH 8.0)2 ml,蛋白酶 K(10 mg/ml)20 ml,10% SDS 200 ml,置 37℃恒温水浴箱内,消化过夜。 5、加等体积 Tris-HCl 饱和酚,轻轻振荡混匀;5 000 g 离心 20 min。 6、吸取上清液,重新抽提 1~2 次。

7、加等体积 CHCl3 抽提 2 次。 8、吸取上清液至一小锥形瓶中,加入 3 mol/L 乙酸钠至终浓度为 0.3 mol/L。 9、加入 2.5 倍体积的无水乙醇,可见有白色絮状沉淀物,即为所提取的 DNA。轻轻旋 转锥形瓶,慢慢将 DNA 聚到一起。 10、吸出 DNA 沉淀,放入加有 1 ml 75%乙醇的 Eppendorf 管内;12 000 g 离心 10 min。 11、弃上清液,室温干燥。 12、加适量(200~500 ml)TE 缓冲液,置 4℃保存,约 2~4 天 DNA 才能完全溶解。 13、用 DNA/RNA Calcultor 检测 DNA 的含量和纯度。 二、绒毛细胞 DNA 的提取 1、绒毛滋养层细胞及羊水细胞的获得:将绒毛细胞放入 Hank’s 液中,立即在显微镜下 分离绒毛枝状物,用生理盐水洗去血污,然后冻存于液氮中或立即提取 DNA。 2、绒毛细胞在塑料离心管中用玻璃棒轻轻匀浆,加 STE 至 500 ml,加 SDS 至终浓度 为 0.5%,加蛋白酶 K 至 100 mg/ml。37℃水浴过夜,期间振荡 2~3 次。 3、加等体积 Tris-HCl 饱和酚,轻轻振荡混匀,8 000 g 离心 10 min。 4、吸取上清液,加等体积 CHCl3,轻轻振荡混匀,5 000 g 离心 20 min。 5、重复步骤 4 一次。 6、以下步骤同“外周静脉血 DNA 的提取”。 三、羊水细胞 DNA 的提取 1、取羊水 20 ml,于 4℃、3 000 g 离心 15~20 min,除去上清液,用生理盐水洗涤沉 淀的羊水细胞 2~3 次,冻存于液氮中或立即提取 DNA。 2、绒毛细胞在塑料离心管中用玻璃棒轻轻匀浆;向羊水细胞中加 STE 至 500 ml,加 SDS 至终浓度为 0.5%,加蛋白酶 K 至 100 mg/ml。37℃水浴过夜,期间振荡 2~3 次。 3、加等体积 Tris-HCl 饱和酚,轻轻振荡混匀,8 000 g 离心 10 min。 4、吸取上清液,加等体积 CHCl3,轻轻振荡混匀,5 000 g 离心 20 min。 5、重复步骤 4 一次。 6、以下步骤同“外周静脉血 DNA 的提取”。 【应用】 应用】 遗传病的诊断、遗传病的家系系谱分析、人类基因组资源的保存、以及一些具体研究领 域的前期工作。 【注意事项】 注意事项】 1、外周静脉血一般用医用 ACD 抗凝,也可用 EDTA 抗凝。因肝素能抑制限制性内切 酶活性,故一般不采用肝素抗凝。 2、因 Tris-HCl 饱和酚(pH 8.0)、氯仿(CHCl3)有较强的毒性作用,在操作过程中 应注意防护,防止液体溅到皮肤上,有条件的可以戴乳胶手套以及口罩,保持良好通风。 3、在酚以及氯仿的混合过程中,注意轻轻混匀,切忌剧烈震荡,防止 DNA 因机械剪 切而发生断裂。 4、无水乙醇沉淀 DNA 的过程中,注意使用室温的无水乙醇,不需要预冷,否则 RNA 容易析出。 5、不要使 DNA 沉淀完全干燥,否则极难溶解。可以将其置于摇床平台上慢慢摇动至 DNA 完全溶解。

实验十五

聚合酶链式反应(PCR)

【实验目的】 实验目的】 1、了解 PCR 技术的原理; 2、掌握 PCR 技术的程序和步骤。 实验原理 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是利用 DNA 聚合酶依赖于 DNA 模板的特性,在体外模拟 DNA 的复制过程,经过变性、复性、延伸三个过程,在一对附加 的引物之间诱发聚合反应,短时间内可将要研究的目的 DNA 扩增数百万倍。 PCR 技术操作简单,灵敏度高,对模板 DNA 的质量和数量要求较低,常规方法提取的 DNA 和 RNA 都能满足 PCR 扩增需要,可在普通实验室完成,结果较为可靠。 试剂与材料 1、样本 DNA、上下游 PCR 引物、Taq DNA 聚合酶(5 U/ml)、10×PCR 反应缓冲液、 4×dNTPs(2.5 mmol/ml)。 2、微量加样器、PCR 自动热循环仪。 【实验步骤】 实验步骤】 一、样品的收集及处理 用于 PCR 反应的样品可以是已提取的各种来源的 DNA 分子,也可以选取经处理后的 全血、羊水、绒毛。 (一)全血 1、取全血 200 ml 用 EDTA 抗凝。 2、5 000 g 离心 10 min。 3、弃掉上清液,沉淀重悬于 200 ml 无菌三蒸水中,煮沸 5 min 裂解细胞和细胞核。 4、5 000 g 离心 10 min。 5、取上清液 30 ml,直接进行 PCR 扩增。 (二)绒毛 1、取绒毛样本,8 000~10 000 g 离心 2 min,使样本沉降到管底。 2、用 STE 缓冲液洗两次。 3、重悬于 50 ml 裂解液中振荡裂解。 4、煮沸 2~3 min,5 000 g 离心 10 min。 5、取上清液 2.5 ml,进行 PCR 扩增。 (三)羊水 1、取 1.5 ml 羊水,8 000~10 000 g 离心 5 min。 2、弃上清液,沉淀用 TE 缓冲液洗一次。 3、在细胞沉淀中加 50 ml 裂解液振荡裂解。 4、煮沸 2 min,再次震荡;5 000 g 离心 10 min。 5、取上清 2.5 ml,进行 PCR 扩增。 二、PCR 扩增 1、25 ml 标准 PCR 反应体系各成分终浓度如下: 模板 DNA50~100 ng Taq DNA 聚合酶 0.5~1 U 4×dNTPs20~200 mmol/L Mg2+0.5~2.5 mmol/L 引物各 0.1~0.5 mmol/L 2、标准 PCR 反应循环参数:

95℃ 5 min 预变性; 94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s(可根据扩增片段长度决定,一般为 1 kb/ min),共 30 个循环; 72℃ 7 min。 【结果判断】 结果判断】 多采用琼脂糖凝胶电泳法,根据 PCR 产物的片段长度,选用 1.5%~2%琼脂糖凝胶电 泳,电泳时间一般为 30~60 min,检测 PCR 扩增产物。 应用】 【应用】 PCR 反应在分子克隆和 DNA 分析中具有多种用途,例如,某些特异性探针的制备,突 变的分析,生成大量 DNA 进行序列测定,遗传病的诊断分析等。 【注意事项】 注意事项】 1、Taq DNA 聚合酶在使用时,要注意在冰上操作,并且可以将大包装分装成独立的小 包装,减少污染机会。 2、PCR 反应极其灵敏,痕量的 DNA 污染也可能会造成非特异性扩增,所以避免外部 DNA 污染是很重要的。 3、PCR 反应中,DNA 扩增片段的增加随着循环次数的增加会出现停滞效应,即平台 期,30 个左右的循环即可达到平台期,超过平台期的循环次数会引起非特异性扩增。

实验十六

DNA 的琼脂糖凝胶电泳

【实验目的】 实验目的】 1、了解琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的一般原理; 2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测技术。 【实验原理】 实验原理】 DNA 分子携带负电荷,在一定电解质缓冲液存在的条件下,它可以以不同孔径琼脂糖 为支持物由电源负极向正极移动。琼脂糖电泳是分离、鉴定和纯化 DNA 片段的常规方法。 琼脂糖凝胶可以灌制成各种形状、 大小和孔隙度。 参数的选择主要取决于所分离片段的大小。 琼脂糖凝胶的分离范围较广,用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为 200 bp 至近 50 kb 的 DNA。直接用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色,可确定 DNA 在凝胶中的位置。 少至 1~10 ng 的 DNA 条带即可直接在紫外灯下检出,还可以从凝胶中回收 DNA 条带,用 于各种克隆操作。 【试剂与材料】 试剂与材料】 1、 琼脂糖、 5×TBE 或 TAE 电泳缓冲液、 6×上样缓冲液、 溴化乙锭 (储存液 10 mg/ml) 。 2、稳压电泳仪、水平凝胶电泳槽、紫外线检测摄像装置。 【实验步骤】 实验步骤】 1、根据所需浓度称取一定量的琼脂糖,加入一定体积的 0.5×TBE 或 1×TBE 或其它电 泳缓冲液,如 TAE。

2、加热溶解琼脂糖。 3、溶液冷却至 60℃,加入溴化乙锭至终浓度为 0.5 mg/ml。 4、把制胶模具摆放好,插上梳子。 5、将琼脂糖倒入模具,凝胶厚度一般约为 0.5 cm。 6、室温下放置 30~45 min 后,琼脂糖溶液完全凝固,小心取出梳子,将凝胶放置于电 泳槽中。加样孔位置在负极。 7、 加入电泳缓冲液 (与琼脂糖凝胶的离子强度一致) 至电泳槽中, 让液面高于胶面 1 mm。 8、在 DNA 样品中加入 1/6 的上样缓冲液,混匀后,用移液器将 DNA 样品加入样品孔 中。同时将 DNA Marker 准加在两侧的空样品孔中。 9、接通电泳槽与电泳仪的电源,一般正极为红色,负极为黑色。切记 DNA 向正极泳 动。采用 1~5 V/cm 的电压降(长度以两个电极之间的距离计算)。 10、根据指示剂迁移的位置,判断是否中止电泳,切断电源后,再取出凝胶。直接于紫 外灯下观察结果。 【结果判断】 结果判断】 根据所检测的 DNA 样品,对比 DNA 分子量标准在紫外灯下观察凝胶中的条带,是否 为自己所需的阳性结果,或是阴性结果,并拍照保留。 【应用】 应用】 对基因组 DNA、PCR 产物、质粒 DNA 等 DNA 片段进行检测,估计样品的有无、质量 及浓度等。根据不同需要,可以对一些样品进行回收与纯化。 【注意事项】 注意事项】 1、电泳前要注意凝胶的位置是否摆放正确;接通电源后,应该观察正、负极铂金丝是 否有气泡出现,以便确认是否电泳槽已经接通电源。 2、 溴化乙锭是一种强烈的诱变剂并有中度毒性, 使用含有该染料的溶液时必须戴手套。 3、紫外线对人眼和皮肤有一定的损害,观察结果时注意佩戴防护面罩等进行防护。

实验十七

PCR-RFLP 技术

【实验目的】 实验目的】 1、了解 PCR-RFLP 技术的原理; 2、了解并熟悉 PCR-RFLP 技术步骤。 实验原理】 【实验原理】 聚合酶链式反应-限制酶片段长度多态(PCR-RFLP)分析技术是在 PCR 技术基础上发 展起来的。如果 DNA 的突变位点发生在某种限制性内切酶的识别位点上,这段 DNA 就会 增加或丢失该限制性酶的酶切点。利用这种限制性酶切割这段 DNA 的 PCR 产物,野生型 和突变体样本会产生长短不同的酶切产物,可以利用聚丙烯酰胺凝胶电泳加以区分。 本实验选用人的亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)作为 PCR 扩增的对象,以扩增 产物中 677 位点 C677T 突变,通过限制酶 TaqⅠ切割位点的有无来区别野生型与突变型样 本。本实验的引物序列:上游引物 P1 为 5'-GAA GCA GGG AGC TTT GAG GC-3';下游引

物 P2 为 5'-CCC ATG TC G GTG CAT GCC TT -3'; PCR 产物的长度为 134bp; 突变体的 PCR 产物可被 TaqⅠ切割成 75 bp 和 59 bp 的两个片段。 【试剂与材料】 试剂与材料】 1、样本 DNA(100 ng/ml)、MTHFR 上下游引物(5 pmol/ml)、Taq DNA 聚合酶(5 U/ml)、10×PCR 反应缓冲液、4×dNTPs(2.5 mmol/L)、限制性内切酶 TaqⅠ(10 U/ml)、 10×酶切反应缓冲液、30%丙烯酰胺(交联度 29:1)、1×TBE、10%过硫酸铵(现用现配)、 TEMED、6×上样缓冲液、DNA Marker、固定液、银染液、显色液。 2、微量加样器、PCR 自动热循环仪、聚丙烯酰胺凝胶电泳装置。 【实验步骤】 实验步骤】 一、PCR 反应 20 ml 反应体系成分如下: 模板 DNA(100 ng/ml) 1 ml 10×PCR 反应缓冲液 2 ml Taq DNA 聚合酶(5 U/ml) 0.2 ml 4×dNTPs(2.5 mmol/L) 1 ml MTHFR 上下游引物 各 1 ml 20 ml ddH2O 加至终体积 PCR 反应循环参数: 95℃ 5 min; 94℃ 30 s、62℃ 50 s、72℃ 90 s,共 30 个循环; 72℃ 7 min。 反应结束后,置 4℃保存。 二、PCR 产物的限制性酶切 20 ml 酶切反应体系成分如下: 10×酶切反应缓冲液 2 ml PCR 扩增产物 10 ml TaqⅠ内切酶(10 U/ml) 1 ml ddH2O 加至终体积 20 ml 置 65℃水浴中消化过夜。 三、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、制备 6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶:30%聚丙烯酰胺(交联度 29:1)10 ml,5×TBE 缓冲液 10 ml,加蒸馏水至 50 ml,加 TEMED 25 ml、10%过硫酸铵 250 ml,混匀后灌胶, 插入加样梳子。 待胶完全聚合后, 拔出加样梳子, 安装电泳装置, 加入电泳缓冲液 (1×TBE) , 缓冲液应高于加样孔上缘,用注射器吸取缓冲液冲净加样孔。 2、取限制性酶切产物 5 ml 与上样缓冲液 1 ml,混匀后加到点样孔中,以 1~8 V/cm 电 用 4~5 h。 四、聚丙烯酰胺凝胶染色 1、拆下电泳装置,取出聚丙烯酰胺凝胶,放到一个塑料盘内,用蒸馏水冲洗 1~2 遍。 2、倒入固定液,固定 8~10 min。 3、用蒸馏水冲洗 1~2 遍;倒入银染液,银染 10~12 min。 4、用蒸馏水冲洗若干遍;倒入显色液,显色至出现清晰的银染带。 5、用蒸馏水浸泡聚丙烯酰胺凝胶,观察 PCR-RFLP 结果。

【结果判断】 结果判断】 观察并记录聚丙烯酰胺凝胶上的 DNA 带。 根据凝胶上的带型位置判定野生型和突变型样本,野生型 MTHFR 的 PCR 产物不能被 限制性核酸内切酶 TaqⅠ切割,而突变体的 PCR 产物可被 TaqⅠ切割成 75 bp 和 59 bp 的两 个片段。 【应用】 应用】 DNA 碱基突变的检测,遗传病的分子诊断,基因组遗传图的构建。 【注意事项】 注意事项】 1、根据碱基突变位点的分析,选择适当的限制性内切酶进行切割。 2、根据目的片段酶切后分子的大小来选择适当浓度的聚丙烯酰胺凝胶,以达到最佳分 离效果。 3、染色最好在塑料盘中进行。


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