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分子生物学实验-2013


分子生物学实验

实验一

植物基因组 DNA 的提取及其定性定量分析

【实验目的】 通过本实验学习利用 CTAB 法从植物组织中提取 DNA 并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分 光光度法对 DNA 进行定性定量分析。 【实验原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂,可溶解细胞膜,在高离子强度 下(大于 0.7 M NaCl),与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研 磨,从而破碎细胞。然后加入 CTAB 缓冲液将 DNA 溶解出来,再用酚、氯仿抽提的方法去 除蛋白,最后经乙醇沉淀得到 DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化 DNA 片段的常用技术。把 DNA 样品加入到一块包含电 解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中,并置于静电场上。DNA 分子在高于等电点 的 pH 溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效 应和分子筛效应。 由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质, 相同数量的双链 DNA 几乎具有等 量的净电荷, 因此, 在一定的电场强度下, DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应, 即 DNA 分子本身的大小和构型。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系,分子 量小的 DNA 分子比分子量大的 DNA 分子迁移速率快,迁移距离远,由此得到分离。凝胶 电泳也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的 DNA 分子,超螺旋质粒 DNA(cccDNA) 泳动最快,其次为线状 DNA(L DNA),最慢的为开环质粒 DNA(ocDNA)。 核酸分子(DNA 或 RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键, 在 260 nm 波长处有特异 的紫外吸收峰, 其吸收强度与核酸的浓度成正比, 这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了 基础。1 OD260 相当于 dsDNA 50 μg/ml,ssDNA 33 μg/ml 和 ssRNA 40 μg/ml。可以此来计算 核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度,还可通过测定 260 nm 和 280 nm 的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度,若 DNA 的 A260/A280 比值高于 2.0, 则可能有 RNA 污染,低于 1.8 则有蛋白质污染。 【仪器设备】 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系 统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪。 【实验步骤】
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分子生物学实验
1. 取约 100 mg 新鲜的拟南芥嫩叶放入 1.5 ml EP 管,在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。 2. 加入 0.6 ml 2× CTAB 提取液(用前加入 0.2﹪的巯基乙醇),混匀,65℃ 水浴 30 min, 每 10 min 颠倒混匀一次。 3. 取出离心管,冷却后加入 0.6 ml 酚氯仿混合液,混匀。 4. 11,500 rpm 室温离心 8 min(若没离好可重复一次)。 5. 将上清液(约 400 μl)转移到另一新的 1.5 ml 离心管中。 6. 加入与上清等体积的氯仿,混匀,11,500 rpm 离心 8 min,取上清(约 350 ul)。 7. 加入 600 μl 无水乙醇,上下颠倒混匀,-80℃放置 30 min。 8. 4℃,15,800 rpm 离心 20 min,弃上清。 9. 1 ml 70%乙醇(预冷)洗涤沉淀 2 次,上下颠倒几次,不能 Vertex,7,000 g 离心 3 min, 弃上清,风干。 10. 加入 30 μl 无菌水(含 20 μg/ml RNase A),37℃ 溶解 DNA 30 min。 11. 取 5 μl DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳检测: (1) 制备琼脂糖凝胶 称取 0.24 g 琼脂糖,放入三角瓶中,加入 30 ml 0.5×TBE 缓冲液,置微波炉中加热至 完全熔化,取出摇匀,则为 0.8%琼脂糖凝胶液。 (2) 胶板的制备 ① 取有机玻璃内槽, 洗净, 晾干, 用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好 (一 定封严,不能留缝隙) ,形成一个模具。 ② 将有机玻璃内槽放置于一水平位置,并在固定位置放好样品梳子。 ③ 待琼脂糖凝胶液冷却到 60℃ 左右时,加入核酸染料 1.5 μl,摇匀,缓缓倒入有机玻 璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡) 。 ④ 室温下静置直至凝胶完全凝固(室温下 30-45 min) ,垂直轻拔梳子,取下胶带,将 凝胶及内槽放入电泳槽中。 ⑤ 加入 0.5×TBE 电泳缓冲液至电泳槽中,使缓冲液没过胶面约 1 mm。 (3) 加样 在点样板或 parafilm 上混合 DNA 样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不 小于 1× 。用 10 μl 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,将 DNA marker 分别加至 样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏 样品孔周围的凝胶面(注意:加样前要先记下加样的顺序) 。

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(4) 电泳 ① 接通电泳槽与电泳仪的电源,DNA 片段从负极(黑色插头)向正极(红色插头)移 动) 。 DNA 的迁移速度与电压成正比, 但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低, 因此, 最高电压不超过 5V/cm。 ② 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 1-2cm 处,停止电泳。 ③ 紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带(戴手套操作) ,采用凝胶成像系统拍照保存。 12.紫外分光光度法测定 DNA 浓度及纯度: (1) 用 0.1× TE 对待测 DNA 样品按 1:20 或合适的倍数稀释。 (2) 开机,仪器会自动对光路及分析软件进行检测,待显示屏上出现“instrument Ready” 时,进入核酸测定窗口。 (3) 调零。先用 0.1× TE 缓冲液注入样品杯,放入样品槽,关闭盖板。点击“set ref”键, 仪器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出,换上待测样品。 (4) 吸 70 μl 已稀释的 DNA 样品转入石英样品杯,放入样品槽,关闭盖板。如果样品很 少,可以用 5-7 μl 的石英样品杯。点击“enter” 键,仪器即进入分析状态。窗口同时显示 260 nm 和 280 nm 处的光密度(OD 值)及 A260/A280 nm 和 A280/A260 nm 的比率以及 DNA 样 品的浓度等。 (5) 打开盖板,取出石英样品杯,吸出样液,用超纯水清洁石英样品杯,风干后,再加 入下一个待测样品。 (6) DNA 纯度:以 A260/ A280 比值来反映。当 A260 /A280 比值<1.8 时,说明样品存在 蛋白质或酚等杂质,可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用氯仿或乙醚抽提去除 残留酚, 再用无水乙醇沉淀, TE 溶解后再测定。 当 A260/A280 比值>2.0, 说明样品存在 RNA 污染,可以用 RNA 酶处理样品去除 RNA。 【实验结果】 :

实验二

PCR 扩增目的片段

【实验目的】 通过本实验学习 PCR 反应的基本原理与实验技术。
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分子生物学实验
【实验原理】 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种体外核酸扩增系统,其原理 类似 DNA 分子的天然复制过程,是将待扩增的 DNA 片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸 引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA 扩增 2n 倍。 典型的 PCR 反应体系由如下组分组成:DNA 模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的 DNA 引物、耐热 DNA 聚合酶。PCR 的工作程序实际上是一个在模板 DNA、一对已知序列 的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下,DNA 聚合酶依赖的酶促合成反应。整 个扩增过程分三步:① 变性,加热使模板 DNA 双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变 性阶段;② 退火,快速降低温度至 50-60℃ 后,模板 DNA 与引物按碱基配对原则互补结 合,即退火阶段;③ 延伸,溶液反应温度升至 72℃,耐热 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模 板,在引物的引导下,利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按 5′→3′方向复 制出互补 DNA ,即引物的延伸阶段。完成以上三步为一个循环,每经过一个循环,样本中 的 DNA 量就增加一倍,新形成的 DNA 链又成为下一轮循环的模板。经过 25-30 个循环后, DNA 可扩增 106-109 倍。PCR 扩增的特异性取决于引物与模板 DNA 的结合。 【仪器设备】 PCR 热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统。 【实验步骤】 1.在 200 μl PCR 管内配制 20 μl 反应体系: 反应物 ddH2O 10× PCR 缓冲液 dNTP 引物 1 引物 2 模板 DNA rTaq 酶 Total 体积/μl 11.3 2.0 1.6(终浓度 20—200 μM) 2.0(引物终浓度 0.2 μM) 2.0(引物终浓度 0.2 μM) 1.0 0.1 20

视 PCR 仪有无热盖,不加或添加石蜡油。 2. 将上述试剂依次加入 PCR 薄壁管。 加样后用手轻弹混匀, 6,000 rpm 离心 15 sec 使反 应成分集于管底。 3. PCR 反应热循环程序设置:

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① 94 ℃ 预变性 3 min; ② 94 ℃ 变性 ③ 64 ℃ 退火 ④ 72 ℃ 延伸 ⑤ 72 ℃ 延伸 ⑥ 16℃ 30 sec; 30 sec; 1 min; 10min; pause 30 cycles

反应结束后短暂离心,置 4℃ 保存备用。 4. 配制 0.8%的琼脂糖凝胶。 5. 取 5 μl PCR 产物,加 1 μl 的 6× loading buffer,轻弹混匀后进行电泳检测。 6. 如果 PCR 产物非常特异,可以直接用于与载体的重组连接。 【实验结果】 本实验扩增片段长 430 bp 左右。

实验三
【实验目的】

目的片段和载体的连接

通过本实验掌握 DNA 重组连接方法。 【实验原理】 外源 DNA 与载体分子的连接就是 DNA 重组, 这种重新组合的 DNA 叫做重组子。 DNA 重组本质是一个酶促反应过程。即在一定的条件下,DNA 连接酶催化两个双链 DNA 片段 的 5′端磷酸和 3′端羟基之间相互作用,形成磷酸二酯键的过程。 pMD?19-T Vector 是一种高效克隆 PCR 产物(TA Cloning)的专用载体。它含有 Amp 抗 性基因、β 半乳糖苷酶的启动子和编码其 N 端氨基酸(α 肽链)的片断基因,在这段基因中插 入一个多克隆位点(DNA 载体序列上人工合成的一段序列,含有多个限制内切酶识别位点, 能为外源 DNA 提供多种可插入的位置或插入方案) ,其中有 EcoR V 识别位点,用 EcoR V 进行酶切反应后,再在两侧的 3′端添加“T”而成。这款载体含有的高效连接液 Solution I 可 以在短时间内 (约 30 min) 完成连接反应, 连接反应的温度在 37℃ 时有利于连接酶的活性。 但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度 12-16℃,最多可以 连接 12-16hr(过夜) ,这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳 定。

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分子生物学实验
【仪器设备】 移液器、吸头、恒温水浴锅。 【实验步骤】 1. 在灭菌的 Eppendorf 管中,加入: pMD-19 T 载体 目的 PCR 片段 Solution 0.5 μl 4.5 μl 5 μl

共 10 μl 体系,混匀,16℃ 连接过夜(12-16hr)或室温(20-25℃)连接 10 min。 DNA 片段的摩尔数应控制在载体 DNA 摩尔数的 3-10 倍。 2. 盖好盖子,用手指轻弹 EP 管数次,并于台式离心机离心 2 sec 以集中溶液。 3. 将反应管放入 16℃ 连接过夜(12~16hr) 。 4. 取出约 25 ng 的 DNA 连接液进行琼脂糖凝胶电泳,鉴定连接结果,以未经连接的质 粒 DNA 片段和 PCR 片段为对照进行电泳检测。 【实验结果】 :

实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化效率检测

【实验目的】 通过本实验掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。 【实验原理】 体外连接的重组 DNA 分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。 研究发现, 用含 Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会使细胞易于吸收外源 DNA。 大肠杆菌吸收 外源 DNA 的过程被称为转化。细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态称为感受态。用理化方 法可以诱导细胞进入感受态,如电转化法、CaCl2 法。 CaCl2 法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法,其原理是使细菌处于 0° C、CaCl2 低渗溶液中,细胞膨胀成球形,细胞膜的通透性发生改变,外源 DNA 附着于细胞膜表面, 经 42° C 短时间热冲击处理,促进细胞吸收 DNA 复合物。 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞,用 CaCl2 处理受体菌使其处于感受态,之后通
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分子生物学实验
过转化实验检测感受态细胞的转化效率。 【仪器设备】 台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅、超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温 箱。 【实验步骤】 1. 从大肠杆菌 DH5α 平板上挑取一个单菌落接于 2 ml LB 液体培养基的试管中,37 ℃ 210 rpm 振荡培养过夜。 2. 次日, 按 1:100(V/V), 即取 1 ml 菌液转接到一个含有 100 ml LB 液体培养基锥形瓶中, 37 ℃ 振荡培养 2-3 hr。 (此时,OD 600 ≤ 0.3-0.5,此为实验成功的关键) 。 3. 将菌液转移到 50 ml 冰浴好的离心管中,冰上放置 10 min。 4. 4 ℃,3,500 rpm/min,离心 10 min,回收细胞。 5. 倒出培养液,将管倒置,以便培养液流尽。 6. 将菌体重悬于 1/10 体积的终浓度为 20 mM CaCl2 和 80 mM MgCl2 的混合溶液中。 (务 必放冰上) 。 7. 4 ℃,3,500 rpm/min,离心 10 min,回收细胞。 8. 将菌体重悬于 1/50 体积冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液中(务必放冰上) 。此细胞为感受 态细胞。于 4℃冰箱中保存,一周内使用或将菌体悬浮于 1/50 体积冰冷的含有 15%甘油的 0.1 mol/L CaCl2 溶液中,分装,每 100 μl 一份,液氮速冻,置于-80℃。 【实验结果】 :

实验五
【实验目的】

重组质粒的转化

通过本实验,掌握重组质粒的转化方法和原理。 【实验原理】 转化是指质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 转化缓冲液中的 DNA 形成不易被 DNA 酶所降解的羟基—钙磷酸复合物,此复合物粘附于感受态细胞表面。42℃ 短时间热处理(热休克) ,可以促进细胞吸收 DNA 复合物。将处理后的细菌放置在非选择 性培养液中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如 Amp 抗性) 得到表达。然 后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上,37℃ 培养过夜形成单克隆。在这个过程中包
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分子生物学实验
含两种筛选方法,一种是抗性筛选,一种是蓝白斑筛选。载体中含有耐药基因,可以使转化 成功的受体细胞具有抗药性, 能够在含有相应药物的琼脂平板上形成单克隆菌落。 通过这种 方法就可以筛选转化成功的受体细胞。而能进行蓝白筛选是因为载体中有一段大肠杆菌 β半乳糖苷酶的启动子和编码其 N 端氨基酸(α 肽链)的片断基因。宿主具有编码 β 半乳糖苷 酶的 C 端基因。当二者产物组合在一起,就具有活性酶的产生,此现象称为 α 互补。在诱 导物 IPTG(乳糖类似物,不会被 β-半乳糖苷酶摧化降解)的作用下,由 α 互补形成的具有 功能活性的 β-半乳糖苷酶,可分解培养物中的 X-gal(它能将无色的化合物 X-gal 切割成半 乳糖和蓝色底物) ,使其呈蓝色反应 。如果外源基因插入位于 LacZ 基因内部的多克隆酶切 位点中,就会破坏 α 肽链的阅读框,从而不能合成与受体菌内的 β-半乳糖苷酶相互补的活 性 α 肽链,导致不能编码 β-半乳糖苷酶,菌落呈正常的白色。而没有插入外源片断的则是 蓝色的。因此,按照菌落的颜色就可以确定载体上是否插入了外源基因。 【仪器设备】 超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、恒温水浴器。 【实验步骤】 1. 取实验三重组质粒 10 μl 加入 100 μl 感受态细胞,混匀(轻弹,感受态很脆弱) ,冰 浴 30 min(静置,勿动,确保 DNA 吸附在感受态细胞表面) 。 2. 将管放到 42 ℃ 水浴锅中,热激 90 sec(准确,防止 LB 液体进入细胞中) 。 3. 冰浴 2 min(使得感受态细胞膜收缩,磷脂双分子层的运动) 。 4. 加 500 μl LB 液体培养基(在超净台中进行) ,轻轻混匀。 5. 37 ℃ 温育 45 min , 130 rpm 慢摇 (必须保证前 20 min 的转速, 因为大肠杆菌 20 min 繁殖一代,第一代的细胞较脆弱,防止细胞破碎) 。 6. 在预制的 LB 琼脂平板上,加 40 μl 20 mg/ml X-gal 和 16 μl 50 mg/ml IPTG 溶液。 7. 用灭菌玻璃棒(酒精灯上烧后冷却)均匀涂布。 8. 37 ℃ 温箱中放置 30 min(使有毒物质挥发) 。 9. 3,500 rpm,离心 2 min。 10. 弃约 500 μl 上清,将剩余菌液轻轻吹打混匀涂于含有氨苄青霉素的 LB 平板上,晾 至液体被吸收。 11. 倒置平皿 37 ℃ 培养 12-16hr,出现单菌落(培养皿上的会长出蓝色和白色菌落, 其中白色菌落为含有重组 DNA 质粒的菌落) 。

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分子生物学实验
【实验结果】 :

实验六

菌落的 PCR 鉴定

【实验目的】 通过本实验学习菌落 PCR 的基本原理与实验技术。 【实验原理】 重组子经过蓝白斑筛选后(具有假阳性),接下来可通过菌落 PCR 方法对重组子进一 步进行快速鉴定。 用灭菌后的牙签轻轻粘取白色菌落的部分菌体, 在准备好的双蒸水中洗涮 一下,充分混匀,取一定量加入 PCR 反应体系,在 PCR 反应循环中,95℃ 加热可以使细 菌破裂,释放出重组质粒作为 PCR 扩增模板。采用外源基因特异性引物进行扩增,如果重 组质粒转化入宿主细胞,则可以扩增得到预期大小的目的片段。 【仪器设备】 一、仪器及耗材 PCR 热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统。 二、试剂 1. 10 × 缓冲液 2. DNA 模板 3. dNTP Mix 4. 引物 P3: P5: (以菌体热解后暴露的 DNA 为模板)

5′-CGG GTA CCG GTG AAT TAA GAG GAG AGA GGA GG-3′ 5′-ACT CTA GAT GAG TAA AAC AGA GGA GGG TCT CAC-3′

引物溶液浓度:2 μM 5. rTaq 酶 5 U/μl

6. 去离子水或 TE(pH7.6) 【实验步骤】

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分子生物学实验
用 200 μl 的枪头挑取转化平板上白色的单菌落于 15 μl 无菌水中,从中取 2 μl 菌液作 为菌落 PCR 模板。 1.在 200 μl PCR 管内配制 20 μl 反应体系: 反应物 ddH2O 10× PCR 缓冲液 dNTP 引物1 引物 2 菌液 rTaq 酶 Total 体积/μl 10.3 2.0 1.6 2.0 2.0 2.0 0.1 20 ul

视 PCR 仪有无热盖,不加或添加石蜡油。 2. 将上述试剂依次加入 PCR 薄壁管。 加样后用手轻弹混匀, 6,000 rpm 离心 15 sec 使反 应成分集于管底。 3. PCR 反应热循环程序设置: ① 94 ℃ 预变性 3 min; ② 94 ℃ 变性 ③ 64 ℃ 退火 ④ 72 ℃ 延伸 ⑤ 72 ℃ 延伸 ⑥ 16 ℃ 30 sec; 30 sec; 1 min; 3 min; pause 30 cycles

反应结束后短暂离心,置 4℃ 保存备用。 4. 配制 0.8%的琼脂糖凝胶。 5. 取 5 μl PCR 产物,加 1 μl 的 6× loading buffer,轻弹混匀后进行电泳检测。 【实验结果】 本实验扩增片段长 430 bp。

实验七

重组质粒 DNA 的提取及酶切鉴定

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【实验原理】 细菌质粒是一类双链、闭环的 DNA,大小范围从 1 kb 至 200 kb 以上不等。各种质粒都 是存在于细胞质中、 独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份, 通常情况下可持续稳定 地处于染色体外的游离状态, 但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上, 随着染色体 的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。 一般分离质粒 DNA 的方法都包括 3 个步骤:①培养细菌,使质粒 DNA 大量扩增;② 收集和裂解细菌;③分离和纯化质粒 DNA。分离制备质粒 DNA 的方法很多,其中常用的 方法有碱裂解法、煮沸法、SDS 法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌 株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒 DNA 的用途进行选择。 碱裂解法提取质粒 DNA 是根据共价闭合环状质粒 DNA 和线性染色体 DNA 在拓扑学上 的差异来分离质粒 DNA。在 pH 值介于 12.0-12.5 这个狭窄的范围内,线性的 DNA 双螺旋 结构解开而被变性,在这样的条件下,尽管共价闭环质粒 DNA 的氢键会被断裂,但两条互 补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入 pH4.8 乙酸钾高盐缓冲液恢复 pH 至中 性时,因为共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确, 而线性的染色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们相 互缠绕形成不溶性网状结构,而复性的质粒 DNA 恢复原来构型,保持可溶性状态。通过离 心,染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA,蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去, 最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒 DNA。 限制性内切酶是一类能识别双链 DNA 分子中特异核苷酸序列的 DNA 水解酶,主要存 在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ型三大类。其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用,是常用的分子生物学工具 酶。 限制性内切酶识别序列长度一般为 4-8 个呈回文序列的特异核苷酸对。一般情况下,识 别序列越长,在同一 DNA 分子中识别位点出现的频率就越小。限制性内切酶主要用于基因 组 DNA 的片段化、重组 DNA 分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及 DNA 分子物理图谱的构建等。根据酶切目的和要求不同,可有单酶切、双酶切或部分酶切 等不同方式。根据酶切反应的体积不同,可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。本实验以 EcoRⅠ和 Hind III 对本实验中提取的重组质粒进行小量酶切鉴定。 在用特定的限制性内切核 酸酶对质粒进行酶切反应后,通常可采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果。

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分子生物学实验
【仪器设备】 一、仪器及耗材 恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅。 二、试剂 1. 质粒提取试剂盒(Takara) 2. EcoRⅠ和 Hind III.限制性内切核酸酶 3. 内切酶反应缓冲液 4. 琼脂糖凝胶电泳相关试剂 【实验步骤】 1. 将实验六第一步剩余的 13 μl 菌液接于 2 ml 含 Amp ( 50 μg/ml )的 LB 液体培养基中 37 ℃ 振荡(225 rpm)培养过夜。 2. 取 1.5 ml 的过夜培养菌液,12,000 rpm 离心 2 min,弃上清,尽可能除去细菌沉淀里 残留的液体培养基。 3. 用 250 μl 的 Solution Ⅰ(含 RNase A1)充分悬浮细菌沉淀。 注:注意不要残留细小菌块,可以使用振荡器(vortex)等剧烈振荡使菌体充分悬浮。 4. 加入 250 μl 的 Solution Ⅱ 轻轻地上下翻转混匀 5-6 次, 使菌体充分裂解, 形成透明溶 液。 注:此步骤不宜超过 5 min。 5. 加入 400 μl 的 4℃ 预冷的 Solution Ⅲ,轻轻上下翻转混合 5-6 次,直至形成紧实凝集 块,然后室温静置 2 min。 6. 室温 12,000 rpm 离心 10 min,取上清。 注:此时 4℃ 离心不利于沉淀沉降。 7. 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。 8. 将上述操作 6 的上清液转移至 Spin Column 中,12,000 rpm 离心 1 min,弃滤液。 9. 将 500 μl 的 Rinse A 加入 Spin Column 中,12,000 rpm 离心 30 sec,弃滤液。 10. 将 700 μl 的 Rinse B 加入 Spin Column 中,12,000 rpm 离心 30 sec,弃滤液。 注:请确认 Rinse B 中加入了指定体积的 100%乙醇。 11. 重复步骤 10。 12. 将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上,12,000 rpm 离心 1 min。 13. 将 Spin Column 安置于新的 1.5 ml 的离心管上, 在 Spin Column 膜的中央处加入 60 μl
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分子生物学实验
的灭菌蒸馏水或 Elution Buffer,室温静置 1 min。 注:把灭菌蒸馏水或 Elution Buffer 加热至 60℃ 使用时有利于提高洗脱率。 14. 12,000 rpm 离心 1 min 洗脱 DNA。 15. 取 5 μl 样品于 0.8%琼脂糖凝进行电泳(100V,25 min)检测。 16. 冰浴或-20 ℃ 保存。 17. 构建重组质粒酶切体系,限制性内切酶反应一般在灭菌的 0.2 或 0.5 ml PCR 薄壁离 心管中进行。 在冰浴上建立酶切反应体系(20 μl) ddH2O 重组质粒 10× Green Buffer NcoⅠ Bcu I Total 9 μl 8 μl(本实验提取的重组质粒 DNA) 2 μl 0.5 μl 0.5 μl 20 μl

限制性内切酶最后加入, 手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸混匀, 3,000 rpm 离心 15sec。 37℃ 水浴温育 90 min。 18. 取 20 μl 酶切产物,加入 4 μl 6× 上样缓冲液,混匀后 0.8%凝胶电泳观察实验结果。 【实验结果】 :

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分子生物学资料2013年
分子生物学资料2013年 隐藏>> 基因: 能够表达和产生蛋白质和 RNA 的 DNA 序列...十九、试述 Meselson 和 Stahl 关于 DNA 半 保留复制的证明实验。 提示:①将...
2013重庆大学分子生物学回忆版
2013 重庆大学分子生物学回忆版 一、名词解释(15 个,3 分一个) 1. 转录组 2. PCR 二、简答题(65 分) 1. 简述 DNA 复制和 RNA 转录的异同? 2. 乳糖...
《分子生物学》西南大学2013年度作业答案,共5次,已整理
分子生物学》西南大学2013年度作业答案,共5次,已整理_教育学_高等教育_教育专区...(2)1952 年 Hershey 和 Chase 等利用大肠杆菌噬菌体实验证实了 DNA 是遗传...
2013年分子生物学研究生课程考核
湖南大学 2013 年硕士学位研究生专业课程考试 考试科目名称:现代分子生物学 姓名...实验目的; 研究一个新基因的生理功能 实验内容:通过该基因的表达量对表型影响...
分子生物学试题-2013.12.19
分子生物学试题-2013.12.19_教育学_高等教育_教育专区。(每种题型都有多于标准...8、利用“杂交竞争实验”可以研究蛋白质间的相互作用。 9、在基因转录水平的...
2013分子生物学复习
第一章 1 、分子生物学的主要研究内容 2 、分子生物学发展简史上的三大理论发现 第二章 3 、染色体包括哪两大部分。 4 、组蛋白的一般特性 5 、 DNA 一级...
2013大学分子生物学课后习题答案及考试重难点
第一章 1.概念:分子生物学、反向生物学. (掌握) 答:研究层次上:整体水平 、细胞水平、分子水平 研究范围上:广义:研究生物大分子的结构和功能,从分子水平上阐明...
中科院2013博士入学考试分子生物学试题
中科院2013博士入学考试分子生物学试题 城市环境研究所 中科院 考博 分子生物学城市环境研究所 中科院 考博 分子生物学隐藏>> 名词解释 1, 端粒 2, 基因突变 3, ...
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