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RNA干扰


RNA沉默
----真核细胞基因表达调控的新途径
? 近年来,人们逐渐认识到,基因的沉默(gene silencing) 相对于基因的激活(gene activation)而言,也是一种 重要的基因表达调控手段。 ? 基因如何激活目前已经研究得比较透彻,但相对而言, 人们对基因如何失活、被抑制了解得并不多。 ? 随着这几年RNA干扰(RNA interference, RNAi)和 microRNA (miRNA)领域的研究,一种古老、有效的抑 制基因表达的机制又一次向我们展示出生命世界的丰富 多彩。

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? 为了应对外源遗传物质的侵入,很多物种发展出具有很 高特异性防御措施来“消灭”外界入侵的核酸,以阻止 它们整合到宿主的基因组或干扰正常的细胞活动,这种 核酸诱导的免疫过程的核心就是双链RNA(doublestranded RNA, dsRNA)。 ? 双链RNA的作用机制在于它能够触发不同类型的基因 表达的抑制,即基因沉默,统称为RNA沉默(RNA silencing)。RNA沉默是从酵母到人类都保守的一种 基因沉默机制。

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转录后水平的基因沉默现象---RNA干扰
? RNA干扰现象的发现、作用机制及应用研究在 2001~2003年连续三年被Science杂志评为当年十大科学 突破,其中2002年位于十大之首; ? 2003年美国Fortune(财富)杂志将RNA干扰与基因重 组技术、单克隆抗体技术并称为生物制药业三大“金 矿”。 ? 那么,这座“沉默”的“金矿”是如何被发掘出来的 呢?

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RNAi的发现
? 1995年,康奈尔大学的S. Guo博士和Kemphues在线虫 (C.elegans)中进行反义RNA实验时,意外的发现, 对照实验中给线虫注射正义RNA,不但不增加该基因 的表达,反而如反义RNA一样,也能特异性的阻断该 基因的表达。 ? 这与反义RNA技术的传统解释机制完全相违背,在当 时一直无法解释这一现象。正义RNA (sence RNA) 也 具有很高的基因沉默活性。

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RNAi的发现

? 直到1998年,华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马 萨诸塞大学医学院的Craig Mello才解开这个谜底。他 们通过大量的尝试发现,Guo发现的正义RNA对基因 的表达抑制,以及过去利用反义RNA技术对基因表达 的阻断,都是由体外转录制备的单链RNA中污染的

微量双链RNA所引起的。

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RNAi的发现
? 实验: 将纯化后的单链反义RNA注射线虫,结果只有微 弱的基因抑制作用。 用纯化的双链RNA(反义RNA和正义RNA)注射 线虫,却能高效特异性阻断相应基因的表达,抑制效 率比单独注射反义RNA诱导基因沉默的效率高2个数量 级。 ? 由此推断,dsRNA触发了高效的基因沉默机制并极大 降低了靶mRNA水平(Fire等,1998)。 ? 人们将这一现象命名为RNA干扰,RNAi (Arenz & Schepers,2003)。
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RNAi的发现
1998年,匹兹堡大学的Richard Carthew等人证明RNA干 扰现象在果蝇(Drosophila melanogaster)中也存在。 随后的一年时间里,又陆续发现RNA干扰现象也存在于 真菌、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等几乎所 有真核生物中。 这说明RNA干扰现象很可能是在真核生物进化的很早期 阶段就已经产生了。

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RNAi的发现

? 2000年2月,剑桥大学的研究人员发现,在哺乳动物小 鼠的早期胚胎中,也有RNA干扰现象。表明RNA干扰 也存在于哺乳动物中,同时利用RNA干扰研究人类基 因功能和治疗人类疾病提供了希望。 ? 2000年6月,密歇根大学的研究人员又发现RNA干扰在 体外培养的细胞系中也能实现,从而使利用RNA干扰 技术研究细胞复杂的信号转导途径的生化和分子机制 更为便捷。

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2006年诺贝尔生理/医学奖
? 目前RNAi技术已经进入了生物科学研究的许多领域, 成为了一种主要的生物学研究工具,发展得相当迅速, 并受到了此次诺贝尔奖评审委员会的青睐,获得2006 年诺贝尔奖医学/生理奖。

颁奖委员会评价:“他们发现了控制基因信息流通的 基本机制, 解释了困惑这一研究者们许久的难题。” “像在 清晨突然打开窗帘,然后一切都一目了然了”。

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2006年诺贝尔生理/医学奖获奖者简介
安德鲁· 法尔(Andrew Fire)
·1959年出生于美国加利福尼亚州圣克 拉拉县 ·1983年获美国麻省理工学院生物学博 士学位 ·现任斯坦福大学斯坦福医学院病理学 和遗传学教授

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克雷格?梅洛(Craig C. Mello )
·1960年 出生于美国

·1990年获得哈佛大学生物 学博士学位 ·现任美国哈佛大学马萨诸 塞州医学院分子医学教授

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RNAi在哺乳动物细胞中应用的
具体设计策略 一.靶siRNA序列的选择 二.siRNA的五种制备方法 三.siRNA的转染 四.实验对照的设置 五.干扰效果的检测 六.RNAi的应用前景
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siRNA的特点
1. 长度约在22nt左右。 2. 依赖Dicer酶的加工,是Dicer的产物,所以具 有Dicer产物的特点。 3. 生成需要Argonaute家族蛋白存在。 4. 是RISC组分。 5. siRNA合成是由双链的RNA形成的。 6. siRNA一般是人工体外合成的,通过转染进入 人体内,是RNA干涉的中间产物;

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siRNA的特点
7. 结构上, siRNA是双链RNA。 8. 在Dicer酶的加工过程中, siRNA对称地来源 于双链RNA的前体的两侧臂。 9. 在作用位臵上, siRNA可作用于mRNA的任 何部位,并与mRNA完全互补。 10. 在作用方式上, siRNA只能导致靶标基因的 降解,即为转录水平后调控。 11. siRNA不参与生物生长,是RNAi的产物,原 始作用是抑制转座子活性和病毒感染。

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siRNA设计
1) 物种特异性:一般来说,siRNA都具有物种特异性,很少与其他 物种有相同的靶位点,所以针对人基因设计的siRNA不会沉默其他 物种的同源序列。然而,也有研究表明siRNA经过特异性设计后能 对两个或两个以上的物种有效(人、小鼠、大鼠可能能找到共同 靶点,但有效性需进一步鉴定),这需要仔细进行siRNA设计和生 物信息学分析。 2) 靶标一般在CDS区选择:siRNA的作用是在mRNA水平,而不 是在蛋白质水平。要设计siRNA,需要准确知道靶mRNA序列。由于 遗传密码的兼并性和密码子的偏移,不可能通过蛋白序列准确预 测核苷酸序列。转录后的RNA前体通过剪接去除内含子序列形成成 熟的mRNA。因为siRNA的功能是酶解mRNA序列的,根据基因组序列 设计的RNA序列有可能落在内含子区,导致设计的siRNA无效,所 以应该根据mRNA序列而不是基因组序列来设计siRNA。
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一. 靶siRNA序列选择
靶siRNA序列选择是RNAi实验成败的关键。哺乳 动物细胞RNAi实验中,使用最广泛且最有效的是21bp siRNA。siRNA由正义链和反义链组成,两条链3’端均 有2个碱基突出,一般为UU或dTdT,其中正义链的前 19nt与靶基因序列相同。

http://www.genesil.com/business/products/order2.htm http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html

http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710 2016/1/21

1. siRNA设计的原则
① 在预定沉默的mRNA中找一段21nt的序列,起始是AA ② 一般在靶mRNA起始密码下游100—200bp至翻译终止密 码上游100bp的范围内,其中AA(N19)TT是最理想的 序列,若靶mRNA中无此序列,亦可选用NA(N21)或 NAR(N17)YNN(R表示嘌呤,Y表示嘧啶); ③ 在19nt的RNA片断中不能含有连续4个T或A的区域; ④ 通过BLAST 确定片断的特异性; ⑤ 通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA,以找到最 有效的siRNA序列。
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1 AGCGGTTGGA GGTTGTAGGA CCGGCGAGGA ATAGGAATCA TGGCGGCTGC

51 GCTGTTCGTG CTGCTGGGAT TCGCGCTGCT GGGCACCCAC GGAGCCTCCG 101 GGGCTGCCGG CACAGTCTTC ACTACCGTAG AAGACCTTGG CTCCAAGATA 151 CTCCTCACCT GCTCCTTGAA TGACAGCGCC ACAGAGGTCA CAGGGCACCG 201 CTGGCTGAAG GGGGGCGTGG TGCTGAAGGA GGACGCGCTG CCCGGCCAGA 251 AAACGGAGTT CAAGGTGGAC TCCGACGACC AGTGGGGAGA GTACTCCTGC 301 GTCTTCCTCC CCGAGCCCAT GGGCACGGCC AACATCCAGC TCCACGGGCC 351 TCCCAGAGTG AAGGCTGTGA AGTCGTCAGA ACACATCAAC GAGGGGGAGA 401 CGGCCATGCT GGTCTGCAAG TCAGAGTCCG TGCCACCTGT CACTGACTGG 451 GCCTGGTACA AGATCACTGA CTCTGAGGAC AAGGCCCTCA TGAACGGCTC 501 CGAGAGCAGG TTCTTCGTGA GTTCCTCGCA GGGCCGGTCA GAGCTACACA 551 TTGAGAACCT GAACATGGAG GCCGACCCCG GCCAGTACCG GTGCAACGGC 601 ACCAGCTCCA AGGGCTCCGA CCAGGCCATC ATCACGCTCC GCGTGCGCAG 651 CCACCTGGCC GCCCTCTGGC CCCTCCTGGG CATCGTGGCT GAGGTGCTGG 701 TGCTGGTCAC CATCATCTTC ATCTACGAGA AGCGCCGGAA GCCCGAGGAC 751 GTCCTGGATG ATGACGACGC CGGCTCTGCA CCCCTGAAGA GCAGCGGGCA 801 GCACCAGAAT GACAAAGGCA AGAACGTCCG CCAGAGGAAC TCTTCCTGAG 851 GCAGGTGGCC CGAGGACGCT CCCTGCTCCA CGTCTGCGCC GCCGCCGGAG 901 TCCACTCCCA GTGCTTGCAA GATTCCAAGT TCTCACCTCT TAAAGAAAAC 951 CCACCCCGTA GATTCCCATC AT

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2. 高效siRNA的序列结构特征
① G/C含量低(30%-52%); ② 正义链3’端具较低稳定性(有利于siRNA与RISC的结合和解链); ③ 无反向重复序列(有利于减小siRNA的有效作用浓度,提高 siRNA干扰效率); ④ 正义链碱基的偏爱性A19(正义链中第19位碱基为A,如下表示 类同); ⑤ A3; ⑥ U10; ⑦ 无G/C19(正义链中第19位碱基不为G或C); ⑧ 无G13。
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二. siRNA制备方法--1.化学合成法
? 早期RNAi实验中,dsRNA或siRNA均由化学法所 合成。 ? 化学合成的siRNA纯度高,合成量不受限制,且 还可对siRNA进行标记,方便对其跟踪, ? 但该方法价格昂贵,定制周期长,不适用于 siRNA序列的筛选和长期基因沉寂实验。

? 目前Proligo、Dharmacon Research和Ambion等公 司均提供siRNA合成服务。
最适用于:已经找到最有效的siRNA的情况下,需要大量siRNA进 行研究
2016/1/21 不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是价格因素

二. siRNA制备方法-- 2. 体外转录
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相对于化学合成而言,体外转录法合成siRNA较为经 济。根据siRNA序列合成相应DNA Oligo模板,再利用 T7RNA聚合酶进行体外转录,分别获得siRNA的正义 链和反义链,然后将其退火、纯化即可得到能直接导 入细胞的siRNA。 体外转录法最大缺点是siRNA合成量受限制,不过其 价格较低,毒性小,稳定性好,效率高。 体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化 学合成siRNAs较高浓度得到的效果(0.5-20 nM vs. 50100 nM per transfection ) 目前国外一些公司均有采用此方法的试剂盒出售,如 Ambion公司生产的Silence siRNA Construction Kit。
最适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成 的价格成为障碍时。

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不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA。长期研究。

“鸡尾酒”(cocotail)法原理是采用Rnase III消化长片 段dsRNA来获取siRNA。基本步骤如下: ① 针对靶基因mRNA(通常选取200-1000bp)在体外转录成 长dsRNA; ② 用大肠杆菌Rnase III酶或Dicer酶对dsRNA进行酶解, 得到一组siRNA混合物; ③ 去除未被消化的dsRNA,剩下siRNA混合物可用来直 接转染细胞。 ? 利用此方法可以省略较为繁琐siRNA设计与筛选工作, 且能够保证靶基因被有效抑制。该方法适合于快速而 经济地研究某个基因功能缺失表型,但因所使用 siRNA为混合物,无法确定有效的siRNA靶序列,并有 可能产生非特异性基因抑制,特别是同源或者密切相 关的基因。
最适用于:快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型
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二. siRNA制备方法--3.鸡尾酒法

不适用于:长时间的研究项目,或者是需要一个特定的siRNA进 行研究,特别是基因治疗。

鸡尾酒疗法
? 鸡尾酒疗法,原指“高效抗逆转录病毒治疗” (HAART),由美籍华裔科学家何大一于 1996年提出,是通过三种或三种以上的抗病 毒药物联合使用来治疗艾滋病。该疗法的应 用可以减少单一用药产生的抗药性,最大限 度地抑制病毒的复制,使被破坏的机体免疫 功能部分甚至全部恢复,从而延缓病程进展, 延长患者生命,提高生活质量。该疗法把蛋 白酶抑制剂与多种抗病毒的药物混合使用, 从而使艾滋病得到有效的控制。
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二. siRNA制备方法--4.siRNA表达载体
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上述3种方法均为体外合成siRNA,不宜进行长 期基因沉默研究。

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借助siRNA表达载体或病毒载体在细胞内产生 siRNA,使研究者无需直接操作RNA就可达到 长期抑制靶基因表达的目的;

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且载体上的抗性标记有助于快速筛选出阳性克 隆,这将具有更为广阔的应用前景。

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最适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基 因沉默,或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。 不适用于:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序 等较为费时、繁琐的工作)
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二. siRNA制备方法--siRNA表达载体
? shRNA表达质粒多采用RNA聚合酶III启动子,如人源H1或

鼠源U6启动子,
? pol III在哺乳动物细胞内引导非编码小RNA的转录,转录产 物无poly(A)尾,且在转录过程中遇到连续4-5个U时转录终止。 ? 此载体最后转录出的产物是经折叠形成的发夹状小 RNA(shRNA); ? shRNA 在细胞内被Dicer酶切割成3’端带有两个U突出的 siRNA,进而启动RNAi,介导基因沉默。
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二. siRNA制备方法--siRNA表达载体
? 用病毒载体介导RNAi可以解决质粒转染效率低、效果不稳定 且某些类型细胞不能转染等问题,从而扩大RNAi应用范围。 ? 腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒,可以高效地转导不同 类型的哺乳动物组织细胞,但不整合到宿主细胞基因组中。 ? 逆转录病毒属于正链RNA病毒,宿主范围广,感染效率高, 并能稳定整合到宿主细胞基因组中,但其只能感染分裂细胞。

? 慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,且较于上两
种病毒体系而言,还适合通过感染胚胎干细胞或胚胎来制备 RNAi转基因动物。
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shRNA文库:RNA干扰研究者的福音
Nature 428, 427 - 431 (25 March 2004);

A resource for large-scale RNAinterference-based screens in mammals
? 美国冷泉港实验室(CSHL,Cold Spring Harbor Laboratory)

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shRNA文库:Expression Arrest

Human shRNA Library
? 美国冷泉港实验室(CSHL)的Dr. Hannon构建的人的 shRNA文库由大量针对验证的目标基因设计的shRNA 克隆组成。human shRNA 1.1版本的文库包括8,500 shRNA克隆,涉及5,700人类基因。该文库可以快速、 高效地对哺乳动物细胞进行功能缺失的遗传筛选和遗 传相互作用的检测。 ? 冷泉港实验室(CSHL)提供的人的shRNA文库的出现 可以免去客户设计和合成siRNA的烦恼,针对目标基 因的每个小分子shRNA均被克隆和测序验证。为了确 保最有效的调控基因的表达水平,每个基因都设计了 多个shRNA克隆,每个shRNA序列都分别与目标基因 的特异序列相对应。当您订购对某一个基因下单时, 该基因所有的shRNA克隆都会一起提供给您。
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二. siRNA制备方法--5. siRNA 表达框架
? siRNA表达框架(siRNA expression cassettes,SECs)是一种由 PCR得到的siRNA表达模版, ? 包括一个RNA pol III启动子,一段发夹结构siRNA,一个 RNA pol III终止位点, ? 能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和 siRNA表达载体不同的是,SECs不需要载体克隆、测序等颇 为费时的步骤,可以直接由PCR得到,不用一天的时间。因 此,SECs成为筛选siRNA的最有效工具,甚至可以用来筛选 在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。 ? 这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。如果有 适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的话,那问题就 可以解决了。另外,没有克隆到载体中的PCR片断并不适于 2016/1/21 大规模制备。

最适用于:筛选siRNA序列,在克隆到载体前筛选最佳启动子 不适用于:长期抑制研究。(如果克隆到载体后就可以了)
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三. siRNA的转染 将siRNA、siRNA表达载体或SECs导入哺 乳动物细胞中是诱导RNAi发生的关键。 有许多转染试剂可供选用,对于同一细 胞系,使用不同的转染试剂或方法,其 效率往往会有所不同;而对于不同的细 胞系,使用同一种转染试剂或方法,效 果亦会不同。因此在实验过程中,有必 要尝试多种试剂或方法来确定最优条件。 最常用的是脂质体转染试剂。
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三. siRNA的转染--1. 阳离子脂质体试 剂
? 在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时,其可 以形成微小的(平均大小约100-400nm)单层脂质体。 这些脂质体带正电,可以靠静电作用结合到DNA的磷 酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子 脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理 不同。使用阳离子脂质体试剂,DNA并没有预先包埋 在脂质体中,而是带负电的DNA自动结合到带正电的 脂质体上,形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称,一 个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就 会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来 源于内吞体和溶酶体。
2016/1/21

三. siRNA的转染--2.磷酸钙共沉淀

? 将氯化钙,RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合, 沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。 磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮 进入目的细胞的细胞质。 ? 沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至 关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心 校准,保证质量,因为甚至偏离最优条件十分 之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
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三. siRNA的转染--3.电穿孔法
? 电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲 中转导分子。将细胞悬浮液臵于电场中会诱导 沿细胞膜的电压差异,据认为这种电压差异会 导致细胞膜暂时穿孔。 ? 电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要, 因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆 地伤害细胞膜而裂解细胞。一般,成功的电穿 孔过程都伴随高水平(50%或更高)的毒性。

2016/1/21

三. siRNA的转染—4.DEAE葡聚糖或 polybrene
? 带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合 物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细 胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休 克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于 转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。

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三. siRNA的转染--5.机械法
? 转染技术也包括使用机械的方法,比如显微注 射和基因枪(biolistic particle)。 ? 显微注射使用一根细针头将DNA,RNA或蛋白 直接转入细胞质或细胞核。 ? 基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细 胞。

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三. siRNA的转染--注意事项
1.纯化siRNA 在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得 到高纯度的siRNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱 或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核 苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化 学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE 胶纯化)。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于 实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤,头发, 所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等, 此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。
2016/1/21

三. siRNA的转染--注意事项
3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性 通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代 数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验, 推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随 时间明显下降。

4.避免使用抗生素 Ambion公司推荐从细胞种植到转染后72小时期间避 免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。 有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条 件。这种情况下,可同时用正常培养基和无血清培养 基做对比实验,以得到最佳转染效果。
5.选择合适的转染试剂 针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同,选择 好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关 2016/1/21 重要。

三. siRNA的转染--注意事项
6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件 对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对照。将不 同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞(同样适合实 验靶siRNA),转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相 对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细 胞毒性以至死亡。 7.通过标记siRNA来优化实验 荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染 效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记 实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了 siRNA的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。
2016/1/21

四. 实验对照的设臵
实验对照是衡量RNAi.实验数据可信度的一个重要因素。

设立阳性对照目的是通过检测不同浓度的siRNA转染效率
及其最终干扰效果,来确定合适的转染条件和最低有 效的siRNA浓度。有实验表明RISC复合物具有饱和性, 且过多siRNA会导致细胞毒性和死亡。对于大多数细 胞,持家基因(如GAPDH,c-myc, β—actin等)是较

好的阳性对照,针对这些基因的高效siRNA序列已有
报道。

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四. 实验对照的设臵

阴性对照是用来检测RNAi的特异性。通常作为阴性对照 的siRNA与选中的siRNA序列有相同碱基组成,但与靶 mRNA无明显同源性。

阴性对照的siRNA序列设计有2种方法,一是将特异性 siRNA的序列打乱,即“零乱”siRNA(scrambled siRNA),再对其进行BLAST比对,防止与目的靶细 胞中的其他基因有同源性;另一种是在特异性siRNA 中引入几个错配碱基。若引入的是一个碱基错配,应 需考虑它与突变mRNA(即SNP位点)结合能力,最好在 设计siRNA时就避免SNP区。
2016/1/21

五. RNAi效果的检测
? RNAi效果可从mRNA和蛋白质两个水平来进行量化。 ? 在mRNA水平上,Northern Blot和实时定量PCR是两种 常用方法。值得注意的是在进行实时定量PCR时, cDNA合成要用oligo(dT),而不是随机引物,且预扩增 片段最好位于靶mRNA序列中siRNA位点的上游。 ? 蛋白质水平可以通过Western Blot、荧光免疫检验法、 流式细胞分析术和表型分析来检测。 ? RNAi一般在转染后24小时内发生,其引发基因沉默的 程度和持续时间依赖于靶蛋白质的降解率(turnover rate of the protein)、siRNA在细胞内的寿命以及其逐渐被稀 释的程度。
2016/1/21

进行RNAi实验时,您是不是会碰到以下问题: 1、 目的细胞暂时不易得到,比如说原代培养的细胞,稀 有难得的细胞株或者目的细胞暂时还没有到位; 2、 目的细胞转染效率低(转染效率在60%以下一般都认 为转染效率偏低); 3、 目的细胞需要诱导才能表达靶基因; 4、 目前尚无靶基因的抗体。

当这些问题摆在我们 面前,而实验又必须 继续进行的时候……
2016/1/21

六. RNAi的应用前景
1. 研究基因功能的新工具 ? 已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中灭活或降低特异 性基因的表达,制作多种表型,而且抑制基因表达的 时间可以随意控制在发育的任何阶段,产生类似基因 敲除的效应。 ? 在基因组序列已测试完毕的模式生物中,发现大量未 知功能的新基因,RNAi将大大促进对这些新基因功能 的研究。 ? 与传统的基因敲除技术相比,这一技术具有投入少, 周期短,操作简单等优势,近来RNAi成功用于构建转 基因动物模型的报道日益增多,标志着RNAi将成为研 究基因功能不可或缺的工具。
2016/1/21

六. RNAi的应用前景
2. 研究信号传导通路的新途径 ? 联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术可以很容易 地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系, Clemensy等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素信息 传导途径,取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致 的结果,在此基础上分析了DSH3PX1与DACK之间的关 系, 证实了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶. ? RNAi技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好, 克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不 高的缺点, 因此认为RNAi技术将可能成为研究细胞信 号传导通路的新途径。

2016/1/21

六. RNAi的应用前景
3.开展基因治疗的新策略 ? RNAi具有抵抗病毒入侵,抑制转座子活动,防止自私基因序列过量 增殖等作用,因此可以利用RNAi现象产生抗病毒的植物和动物,并 可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病 毒。 ? 肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果,传统技术诱发的 单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长, 而RNAi可以 利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一 特性, 设计针对这一区段序列的dsRNA分子,只注射一种dsRNA即 可以产生多个基因同时剔除的表现,也可以同时注射多种dsRNA而 将多个序列不相关的基因同时剔除。 ? 尽管目前RNAi技术在哺乳动物中的应用还处于探索阶段,但它在斑 马鱼和老鼠等脊椎动物中的成功应用预示着RNAi将成为基因治疗中 重要的组成部分,人工合成的dsRNA寡聚药物的开发将可能成为极 具发展前途的新兴产业。
2016/1/21


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RNA干扰实验
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RNA干扰的原理与应用
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关于RNA干扰的综述_图文
关于RNA干扰的综述 - 关于 RNA 干扰的综述 一、相关概念 基因沉默:通过人工手段使基因的最终产物无法表达。分为转录前水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默(TGS ...
RNA干扰载体的构建的实验流程
RNA干扰载体的构建的实验流程 - RNA 干扰载体的构建的实验流程 RNA 干扰载体主要用来研究基因表达调控, RNA 干扰技术已已被广泛用于基因结构功能研究 和传染性疾病...
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