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第二次实验-RT-PCR技术


RT-PCR RT(Reverse TranscriptionTranscriptionPolymerase Chain Reaction)


(一)细胞总 一 细胞总RNA的提取 的提取 细胞总



1、取小鼠肝脏约0.1g(约绿豆大小),置匀浆器中,加入 、取小鼠肝脏约 ),置匀浆器中 (约绿豆大小),置匀浆器中,加入1ml TRIzol, , 充分匀浆。 充分匀浆。 2、将匀浆后样品转入Ep管,离心数秒,取250ul上清至一新 管中。 、将匀浆后样品转入 管 离心数秒, 上清至一新Ep管中 上清至一新 管中。 3、每管样品中加入50ul氯仿(萃取酚),充分振荡混匀,静置 、每管样品中加入 氯仿( ),充分振荡混匀 氯仿 萃取酚),充分振荡混匀,静置10min。 。 4、12000rpm×10min。 、 × 。 5、取上清转入新Epg管,加等体积异丙醇,混匀,室温放置 、取上清转入新 管 加等体积异丙醇,混匀,室温放置10min。 。 6、12000rpm×10min。 、 × 。 7、弃上清,加入50ul 70%乙醇洗涤一次,自然晾干。 、弃上清,加入 乙醇洗涤一次, 乙醇洗涤一次 自然晾干。 8、加入50ul DEPC水溶解沉淀。 、加入 水溶解沉淀。 水溶解沉淀

(二)逆转录反应(总体积20 ul ) 逆转录反应(总体积20
RNA (1~4ug) ~ Oligo dT DEPC处理的ddH2O DEPC处理的ddH 处理的 2 ul 1 ul 5 ul

70℃反应5分钟,迅速置于冰上5 70℃反应5分钟,迅速置于冰上5分钟 5×buffer 10mM dNTP 42℃预热5 42℃预热5分钟 逆转录酶AMV 逆转录酶AMV RNasin 42℃水浴1小时 42℃水浴1 72℃水浴10分钟 72℃水浴10分钟 10 冰上放置备用 2 ul 2 ul 4 ul 4 ul

(三)PCR扩增(总体积30 ul ) )PCR扩增(总体积30 扩增
ddH2O 10× 10×Buffer Mgcl2 (1.5mmol/L) dNTPs (各200umol/L) Primer 1 (10~100pmol) ~ ) Primer 2 (10~100pmol) ~ DNA 模板 (0.1~2ug) ~ Taq DNA聚合酶(5U/ul) 聚合酶( 聚合酶 ) 总体积 15. 15.5 3 2.5 3 1 1 3 1 ul ul ul ul ul ul ul ul

30 ul

(四)PCR产物电泳分析 )PCR产物电泳分析

PCR
(Polymerase Chain Reaction)

1. What is PCR?

PCR is an in vitro method of DNA synthesis by which a particular fragment of DNA can be specifically amplified. amplified.
特异DNA片段的体外快速大量扩增技术 特异 片段的体外快速大量扩增技术. 片段的体外快速大量扩增技术

——PCR技术的发明者 技术的发明者—— 技术的发明者

2 Background knowledge of PCR:
DNA replication DNA denaturation, renaturation & hybridization

DNA Replication:

? DNA Replication:
Template

3’ 5’ DNA-pol 3’ dATP dGTP dATP dTTP dGTP

5’ 3’ dCTP

Primer dCTP

dTTP

? DNA Denaturation & Renaturation:

Denaturation

Renaturation

heating

annealing

? Hybridization

3 Principles of PCR
Denaturation 95℃ ℃

高温变性 低温退火 适温延伸 循环25-30次 循环25-30次

Elongation 72 ℃

Annealing 60℃ ℃

Template DNA
5′ ′
The 1st cycle

5′ ′

5′ ′

Primer 1 5′ Primer 2 ′

5′ ′

5′ ′ 5′ ′
5′ ′

Denaturation 95℃ ℃

Elongation 72 ℃

Annealing 60℃ ℃

Template DNA
5′ ′
The 1st cycle

5′ ′

5′ ′

Primer 1 5′ Primer 2 ′

5′ ′

5′ ′ 5′ ′
The 2nd cycle

5′ ′

5′ ′

5′ ′ 5′ ′

5′ ′ 5′ ′

5′ ′ 5′ ′

5′ ′

The 3th cycle

5′ ′

5′ ′ 5′ ′

5′ ′ 5′ ′

5′ ′ 5′ ′

5′ ′

5′ ′ 5′ ′

5′ ′ 5′ ′

5′ ′ 5′ ′

5′ ′ 5′ ′

After 20 ~ 30 cycles, the original DNA can be amplified millions-fold.

指数扩增期

平台期

到达平台期所需PCR 到达平台期所需 循环次数取决于模板 拷贝数、PCR扩增效 拷贝数、 扩增效 率及DNA聚合酶的种 聚合酶的种 率及 类及活性. 类及活性

4 The Characteristics of PCR
High specificity High sensitivity Simple and rapid operation Wide applicability

High specificity

HAV

HBV

HCV

HDV

HBV HBV HBV HBV HBV HBV HBV HBV HBV
PCR

HBV HBV HBV HBV

HBV HBV HBV

引物设计的原则
引物长度:15引物长度:15-30bp 引物中碱基分布:尽可能随机分布,G+C占 引物中碱基分布:尽可能随机分布,G+C占 45%~ 45%~55% 引物自身不能互补 引物之间不能互补 引物与非扩增区同源性<70%, 末端连续8 引物与非扩增区同源性<70%,3‘末端连续8 个碱基不能与待扩增区以外序列完全互补 引物3 端碱基一定要与模板互补,最好选择G 引物3‘端碱基一定要与模板互补,最好选择G 和C 引物5 端可游离十几个碱基, 引物5‘端可游离十几个碱基,可进行修饰

High sensitivity
Target DNA DNA PCR

Simple and rapid operation Wide applicability

PCR仪器设备: PCR仪器设备: 仪器设备
自动移液器和枪头 微量离心管 PCR仪 PCR仪 电泳设备

5 The Composition of PCR System:
template (ng) primers (0.1-0.5umol/L) ) Taq DNA pol (2.5-5U) ) dNTP (20-200umol/L) Mg2+ (1.5-2.5 mmol/L) )

Target Sequence DNA

Primer 2 Primer 1

DNA聚合酶( DNA聚合酶(DNA polymerase) polymerase) 聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 的Klenow片段; 聚合酶Ⅰ Klenow片段 片段;

耐热DNA聚合酶 耐热DNA聚合酶 ?

耐热DNA聚合酶 耐热DNA聚合酶(Taq DNA pol),来自 聚合酶(Taq pol), Thermus aquaticus, 在95℃的半衰期 aquaticus, 95℃ 小时。 为 1.6 小时。

美国黄石国家公园

6. Standard PCR reaction:
? design the reaction system
Target gene : β-actin Primer 1: 5’ATGGGTCAGAAGGACTCCTATC 3’ Primer 2: 5’ATCTCCTGCTCGAAGTCTAGAG 3’ The length of DNA fragment: 530bp

? design the reaction system & transfer the reagents in reaction tube
ddH2O 10× 10×Buffer Mgcl2 (1.5mmol/L) dNTPs (各200umol/L) Primer 1 (10~100pmol) ~ ) Primer 2 (10~100pmol) ~ DNA 模板 (0.1~2ug) ~ Taq DNA聚合酶(5U/ul) 聚合酶( 聚合酶 ) 总体积 15. 15.5 3 2.5 3 1 1 3 1 ul ul ul ul ul ul ul ul

30 ul

? reaction procedures
Heat for 5 min at 95℃ to make the template DNA ℃ denaturated completely. Cycle parameters: : 95 ℃ 60 ℃ 72 ℃ Cycle times: 30 Finally, incubate for 10 min at 72 ℃ to make all DNA fragments polymerize completely. 50 sec 45 sec 50 sec

? detect the amplified DNA molecule by gel electrophoresis

几种重要的PCR衍生技术 几种重要的PCR衍生技术
(一)反转录PCR技术 反转录PCR技术 (二)原位PCR技术 原位PCR技术 (三)实时PCR技术 实时PCR技术

实时PCR技术原理 实时PCR技术原理 PCR

PCR的主要用途 PCR的主要用途
(一)目的基因的克隆 (二)基因的体外突变 (三)DNA和RNA的微量分析 DNA和RNA的微量分析 DNA序列测定 (四)DNA序列测定 (五)基因突变分析


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